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Imágenes 3D de la matriz extracelular hepática en un modelo de ratón de esteatohepatitis no alcohólica

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DOI:

10.3791/63106

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25 de febrero de 2022

 ,  ,  , 
1Gastroenterology and Hepatology, Stanford University

En este artículo

Resumen

El presente protocolo optimiza los métodos de perfusión/descelularización in situ hepática y microscopía de dos fotones para establecer una plataforma confiable para visualizar la dinámica de la remodelación de la matriz extracelular (MEC) durante la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA).

Resumen

La esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) es la enfermedad hepática crónica más común en los Estados Unidos, que afecta a más de 70 millones de estadounidenses. NASH puede progresar a fibrosis y, finalmente, a cirrosis, un factor de riesgo significativo para el carcinoma hepatocelular. La matriz extracelular (ECM) proporciona soporte estructural y mantiene la homeostasis hepática a través de señales matricelulares. La fibrosis hepática es el resultado de un desequilibrio en el proceso dinámico de remodelación de la ECM y se caracteriza por una acumulación excesiva de elementos estructurales y cambios asociados en los glicosaminoglicanos. El patrón de fibrosis típico de NASH se llama "alambre de pollo", que generalmente consiste en fibrosis perisinusoidal/pericelular de zona 3, según las características observadas por la tinción tricrómica de Masson y las tinciones de rojo de Picrosirius. Sin embargo, estas técnicas tradicionales de imágenes bidimensionales delgadas (2D) basadas en diapositivas de tejido no pueden demostrar los cambios estructurales detallados de ECM tridimensional (3D), lo que limita la comprensión de la remodelación dinámica de ECM en la fibrosis hepática.

El trabajo actual optimizó un protocolo rápido y eficiente para obtener imágenes de la estructura nativa de ECM en el hígado a través de la descelularización para abordar los desafíos anteriores. Los ratones fueron alimentados con comida o dieta de comida rápida durante 14 semanas. La descelularización se realizó después de la perfusión de la vena porta in situ , y las técnicas de microscopía de dos fotones se aplicaron para obtener imágenes y analizar los cambios en la ECM nativa. Las imágenes 3D de los hígados normal y NASH fueron reconstituidas y analizadas. La realización de la descelularización de perfusión in situ y el análisis del andamio mediante microscopía de dos fotones proporcionaron una plataforma práctica y confiable para visualizar la remodelación dinámica de ECM en el hígado.

Introducción

La enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) es la enfermedad hepática más común, que afecta al 20% -25% de la población adulta. El 25% de los pacientes con NAFLD progresan a esteatohepatitis no alcohólica (NASH), donde el riesgo de cirrosis, insuficiencia hepática y carcinoma hepatocelular aumenta1. En los próximos 20 años, se estima que NASH representará 2 millones de muertes relacionadas con el hígado en EE.UU.2. Como no existen tratamientos aprobados, existe una necesidad urgente de descifrar los mecanismos que causan fibrosis hepática en pacientes con EHNA y desarrollar un tratamiento dirigido3.

La matriz extracelular (MEC) es un microambiente dinámico y complejo que ejerce comunicación bidireccional con las células para regular la homeostasis tisular4. La ECM hepática está compuesta por elementos estructurales como proteoglicanos, colágenos, fibronectina, elastina y otras proteínas no estructurales (por ejemplo, olfactomedina y trombospondina) para proporcionar soporte físico y estructural4.

La fibrosis hepática es una respuesta crónica de cicatrización de heridas al daño hepático de diversas etiologías, incluida la EHNA3. Es el resultado de un desequilibrio en el proceso dinámico de remodelación de la matriz ECM y se caracteriza por un exceso de proteínas estructurales en el hígado lesionado4. La fibrogénesis depende de la comunicación dinámica célula-célula entre los diferentes tipos de células hepáticas. Las células estrelladas hepáticas (HSC), cuando se activan, se diferencian en células similares a miofibroblastos que expresan actina, migran y proliferan en músculo liso alfa 2 y sintetizan proteínas ECM como una acción de cierre de heridas. Las HSC activadas son las células productoras de colágeno central en el hígado1.

El mecanismo molecular de la remodelación de la ECM, los patrones de fibrosis y su relación con los eventos celulares no están claros. Todavía se necesita una mejor comprensión de la estructura tridimensional (3D) de la ECM, a pesar de que las técnicas de espectrometría de masas han ayudado a analizar la composición de la proteína ECM4. Tradicionalmente, la tinción tricrómica de Masson, las tinciones de rojo Picro Sirius y las imágenes de segunda generación armónica (SHG) se han realizado en secciones delgadas del hígado bidimensionales (2D). El patrón típico de fibrosis de NASH se llama "alambre de gallina", que se extiende a la zona 3 y es fibrosis perisinusoidal/pericelular 5,6. Sin embargo, ha habido una falta de estudios centrados en la estructura 3D del hígado nativo, particularmente aquellos que no implican la sección de tejido. Los enfoques de imagen robustos para identificar patrones y características de la fibrosis a través de la remodelación dinámica de la ECM en la fibrosis hepática fortalecerían significativamente la comprensión de los mecanismos de NASH e identificarían nuevos objetivos terapéuticos.

Para abordar estos desafíos, se optimizó un protocolo rápido y eficiente para obtener imágenes de la ECM hepática nativa a través de la descelularización7. La descelularización de todo el hígado es un enfoque para eliminar el contenido celular hepático mientras se mantiene la red 3D ECM nativa a través de la perfusión detergente. Los ratones fueron alimentados con comida o dieta de comida rápida (FFD) durante 14 semanas. La descelularización se realizó después de la perfusión in situ de la vena porta con detergente suave y bajas tasas de flujo para preservar las estructuras de colágeno fibrilar triple helicoidal y nativas. Se aplicó microscopía de dos fotones para analizar los cambios en las estructuras de colágeno en la ECM. Se reconstituyeron y analizaron las imágenes 3D de la estructura nativa de ECM en hígados normales y NASH. Realizar la descelularización de perfusión in situ y analizar el andamio mediante microscopía de dos fotones proporciona una plataforma práctica y asequible para visualizar la remodelación dinámica de ECM en el hígado.

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Protocolo

Los experimentos con animales se realizan de acuerdo con los procedimientos experimentales aprobados por los comités institucionales de cuidado y uso de animales (IACUC) de la Universidad de Stanford y el Hospital de Asuntos de Veteranos en Palo Alto. Los ratones machos C57BL / 6J de 6-8 semanas de edad fueron alimentados con comida rápida o una dieta de comida rápida suplementada con jarabe de maíz con alto contenido de fructosa al 4,2% (consulte la Tabla de materiales) en agua potable durante 14 semanas5. Los ratones se mantuvieron en jaulas estándar en un ciclo de oscuridad / luz de 12 h.

1. Preparación quirúrgica y procedimientos de perfusión hepática

  1. Pese el ratón antes del procedimiento.
  2. Anestesiar al ratón administrando ketamina (90 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) (ver Tabla de materiales) mediante una inyección intraperitoneal. Asegúrese de que el ratón esté completamente anestesiado pellizcando los dedos de los pies antes de continuar con el siguiente paso.
    NOTA: El isoflurano no es necesario aquí ya que esta es una cirugía de no supervivencia.
  3. Afeite el área ventral con un cortapelos y desinfecte la piel con etanol al 70%. Coloque el ratón en su espalda e inmovilice las patas en la tabla quirúrgica con cinta adhesiva.
  4. Después de reconfirmar la profundidad de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie, usa unas tijeras Mayo y fórceps Adson (consulta la Tabla de materiales) para hacer una incisión lateral de 3 cm en la parte inferior del abdomen y luego una incisión vertical de 5 cm desde la parte baja del abdomen hasta la apófisis xifoidea. Tenga cuidado de no abrir la cavidad torácica.
  5. Después de abrir el peritoneo, coloque suavemente los intestinos a la izquierda del animal y eleve el lóbulo derecho del hígado con un aplicador con punta de rayón (consulte la Tabla de materiales) para exponer la vena porta.
  6. Cateterizar la vena porta con un catéter IV de 24 G. Introduzca el catéter en el extremo distal de la vena porta. Coloque la punta del catéter antes de que la vena porta se ramifique hacia los lóbulos hepáticos.
  7. Extraiga la aguja inmediatamente cuando el catéter entre en la vena. Verifique que el catéter esté colocado correctamente dentro de la vena perfundiendo el hígado con PBS usando una jeringa de 1 ml a través del catéter.
    NOTA: Tras la perfusión de PBS, todos los lóbulos deben blanquearse inmediatamente. Si el catéter está colocado correctamente, la sangre venosa fluirá rápidamente a través del catéter.
  8. Use microfórceps Dumont, un soporte para microagujas Castroviejo y sutura 4-0 (consulte la Tabla de materiales) para colocar una sutura debajo de la ramificación de la vena porta y una segunda puntada 1 cm más abajo para asegurar el catéter.

2. Descelularización tisular

  1. Conecte el catéter a un tubo de silicona (~1 m de longitud, 3 mm de diámetro interior y 4,1 mm de diámetro exterior) con un conector Luer. Conecte el tubo de silicona a una bomba peristáltica y a un depósito que contenga agua desionizada (consulte la Tabla de materiales).
  2. Retire con cuidado las burbujas de aire dentro del tubo y evite generar nuevas burbujas durante la perfusión. Ajuste la bomba peristáltica a una salida de flujo de 0,2 ml/min (es decir, 288 ml/24 h).
  3. Perfundir primero con agua desionizada (~50 mL/ratón) durante 2 h. El color del hígado cambiará de rojo a amarillo durante la perfusión.
    NOTA: El animal caducará después de 10 minutos de perfusión.
  4. Cambie la solución de perfusión a desoxicolato de sodio al 0,5% (peso / vol) (DOC, consulte la Tabla de materiales) y continúe durante la noche (18 h, ~ 250 ml / ratón). El hígado se volverá blanco al final de la perfusión (Figura 1).
  5. Cambie la solución de perfusión a agua desionizada (~ 50 ml / ratón) y perfunda durante 2 h.
  6. Use microfórceps Dumont y tijeras de microresorte (consulte la Tabla de materiales) para recoger el hígado descelularizado y lávelo cuidadosamente en una placa de Petri con PBS.
  7. Cortar el tejido descelularizado en trozos pequeños para obtener imágenes inmediatas o congelarlo a -80 °C para un análisis bioquímico adicional, como espectrometría de masas en tándem, ELISA o western blot.

3. Preparación del portaobjetos para la obtención de imágenes (con un microscopio de fluorescencia multifotón/confocal)

  1. Transfiera un pequeño trozo de hígado descelularizado (<3 x 3 x 3 mm) a un portaobjetos de microscopio y coloque el tejido en el medio.
  2. Añadir 10 μL de medio de montaje antidecoloración (ver Tabla de materiales) al tejido con una pipeta para evitar que el tejido se seque.
  3. Cubra el pañuelo con un vaso de cobertura y aplique una pequeña fuerza para aplanar la muestra. Selle los bordes del vidrio de la cubierta con esmalte de uñas incoloro y transparente (Figura 2).
    NOTA: Debido a la colocación de los dos fotones verticales a través del microscopio, se utilizó un vidrio de cubierta en la muestra. Sin embargo, las muestras podrían colocarse de manera diferente si se utiliza un microscopio invertido.

4. Adquisición de imágenes

  1. Coloque una gota de aceite de inmersión en la parte superior del vidrio de la cubierta y coloque el portaobjetos en el portaobjetos del microscopio. Baje la lente del objetivo de aceite 20x hasta que entre en contacto con el aceite de inmersión.
  2. Cambie al canal violeta (405 nm), encienda el obturador y enfoque la muestra. Navegue y posicione el área de interés para la obtención de imágenes. Apague el obturador antes de pasar a la adquisición de imágenes mediante luz láser.
  3. Cambie al control de la computadora e inicie el láser de dos fotones. Encienda primero el láser de dos fotones (Figura 3A), luego encienda el controlador láser de dos fotones (consulte Tabla de materiales) y el obturador (Figura 3B, C). Asegúrese de que la potencia de salida sea superior a 2,5 W.
    Reduzca la potencia del láser para evitar el enfriamiento de la fluorescencia. Seleccione y ajuste los detectores (tanto fotomultiplicadores como híbridos) para acomodar los fluoróforos elegidos.
    NOTA: Las imágenes de dos fotones se realizaron a una longitud de onda de excitación de 860 nm. Se seleccionaron dos canales para las imágenes de colágeno SHG y fluorescencia excitada de dos fotones (TPEF), respectivamente. Un canal correspondiente al rango de longitud de onda de 415-445 nm detectó la estructura detallada del colágeno a partir de señales SHG. Otro canal cubrió el rango de 465-669 nm para recoger señales TPEF.
  4. Elija adquisiciones de imágenes simultáneas o secuenciales. Ajuste el agujero de alfiler al valor más alto. Ajuste las longitudes de onda del láser, la ganancia, la potencia y el desplazamiento. Ajuste el tiempo de permanencia de los píxeles, el tamaño de píxel, el promedio y el zoom (Figura 4A).
  5. Desplácese por el controlador z de la computadora y establezca las dimensiones z, defina los puntos inicial y final, y elija el número de imágenes dadas dentro de un volumen (pila z). Adquirir imágenes.
    NOTA: Aquí, se eligió un volumen Z de 20 μm y un tamaño de paso Z de 1 μm (Figura 4B).

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Resultados

Las fibras de colágeno se detectaron con segunda generación armónica y microscopía de dos fotones. La señal proviene de las estructuras frangibles de colágeno fibrilar triple helicoidal y nativas. No se utilizaron anticuerpos específicos para analizar los subtipos de colágeno; Sin embargo, esto podría agregarse a la técnica de imagen.

Cuando se estudia el tejido hepático sin descelularización, es difícil obtener imágenes de alta resolución de la red de colágeno (Fi...

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Discusión

El presente protocolo muestra que la descelularización a través de una perfusión in situ DOC de bajo caudal preserva las estructuras frangibles de colágeno fibrilar de triple hélice y nativas, proporcionando una plataforma confiable y rentable para capturar la remodelación dinámica de la ECM en la fibrosis hepática NASH. Aunque la descelularización se realizó en hígados normales y fibróticos antes de identificar componentes de la MCE o generar andamios biológicos para cultivo celular, la dinámica de la remodelac...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses con respecto a este artículo.

Agradecimientos

Agradecemos a Hyesuk Park por la ayuda técnica. Esta investigación fue apoyada por fondos del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, a NJT), el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (NIA), NIH (1R01AG060726, a NJT). Agradecemos a Jon Mulholland y Kitty Lee del Centro de Imágenes de Ciencias Celulares en el Centro Beckman por su asistencia técnica con las imágenes de microscopía de dos fotones.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
4-0 MONOCRYL SIN TEÑIR 1 x 18" P-3MONOCRYLY494G
4-0 suturascientific10-000-649https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true
AnaSed Inyección (xilacina)AnaSedNDC 59399-110-20este medicamento para uso por o bajo la orden de un veterinario autorizado.
Catéter intravenoso BD INSYTE AUTOGUARD CON TECNOLOGÍA BCBD
Chow dietEnvigo# 2918Dieta de control. Una dieta de fórmula fija, no esterilizable en autoclave, fabricada con ingredientes de alta calidad y diseñada para apoyar la gestación, la lactancia y el crecimiento de los roedores.
Dieta de comida rápida (AIN76A Western Diet)Dieta de prueba1810060https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf
Kit de tinción de hematoxilina y eosinavectorlabsH-3502
https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html Kent Scientific Rata Kit Quirúrgico fisherscientific13-005-205https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit
INYECCIÓN DE CLORHIDRATO DE KETAMINAVedcoNDC 50989-996-06 - 10 mL - vial.KetaVed se ha estudiado clínicamente en primates subhumanos, además de las especies enumeradas en Administración y dosis.
Leica SP5 vertical Confocal,LeicaSP5
(llave de paso de tres vías con SPIN-LOCK®)bbraunD300https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html
Picrosirius Red Stain KitPolysciences, Inc.24901https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771
Aplicador de rayónpuritan25-806 1PR
Desoxicolato de sodiosigmaaldrichD6750-100G
Jarabewww.target.com24 fl ozhttps://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801
Bomba Peristáltica de Velocidad VariableINTLLABBT100https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1
VECTASHIELD Medio de montaje antidecoloraciónvectorlabsH-1000-10https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html
fisher 382612 conector Luer multifotón

Referencias

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