El presente protocolo optimiza los métodos de perfusión/descelularización in situ hepática y microscopía de dos fotones para establecer una plataforma confiable para visualizar la dinámica de la remodelación de la matriz extracelular (MEC) durante la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA).
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Artículo de método
Imágenes 3D de la matriz extracelular hepática en un modelo de ratón de esteatohepatitis no alcohólica
En este artículo
Resumen
Resumen
La esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) es la enfermedad hepática crónica más común en los Estados Unidos, que afecta a más de 70 millones de estadounidenses. NASH puede progresar a fibrosis y, finalmente, a cirrosis, un factor de riesgo significativo para el carcinoma hepatocelular. La matriz extracelular (ECM) proporciona soporte estructural y mantiene la homeostasis hepática a través de señales matricelulares. La fibrosis hepática es el resultado de un desequilibrio en el proceso dinámico de remodelación de la ECM y se caracteriza por una acumulación excesiva de elementos estructurales y cambios asociados en los glicosaminoglicanos. El patrón de fibrosis típico de NASH se llama "alambre de pollo", que generalmente consiste en fibrosis perisinusoidal/pericelular de zona 3, según las características observadas por la tinción tricrómica de Masson y las tinciones de rojo de Picrosirius. Sin embargo, estas técnicas tradicionales de imágenes bidimensionales delgadas (2D) basadas en diapositivas de tejido no pueden demostrar los cambios estructurales detallados de ECM tridimensional (3D), lo que limita la comprensión de la remodelación dinámica de ECM en la fibrosis hepática.
El trabajo actual optimizó un protocolo rápido y eficiente para obtener imágenes de la estructura nativa de ECM en el hígado a través de la descelularización para abordar los desafíos anteriores. Los ratones fueron alimentados con comida o dieta de comida rápida durante 14 semanas. La descelularización se realizó después de la perfusión de la vena porta in situ , y las técnicas de microscopía de dos fotones se aplicaron para obtener imágenes y analizar los cambios en la ECM nativa. Las imágenes 3D de los hígados normal y NASH fueron reconstituidas y analizadas. La realización de la descelularización de perfusión in situ y el análisis del andamio mediante microscopía de dos fotones proporcionaron una plataforma práctica y confiable para visualizar la remodelación dinámica de ECM en el hígado.
Introducción
La enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) es la enfermedad hepática más común, que afecta al 20% -25% de la población adulta. El 25% de los pacientes con NAFLD progresan a esteatohepatitis no alcohólica (NASH), donde el riesgo de cirrosis, insuficiencia hepática y carcinoma hepatocelular aumenta1. En los próximos 20 años, se estima que NASH representará 2 millones de muertes relacionadas con el hígado en EE.UU.2. Como no existen tratamientos aprobados, existe una necesidad urgente de descifrar los mecanismos que causan fibrosis hepática en pacientes con EHNA y desarrollar un tratamiento dirigido
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Protocolo
Los experimentos con animales se realizan de acuerdo con los procedimientos experimentales aprobados por los comités institucionales de cuidado y uso de animales (IACUC) de la Universidad de Stanford y el Hospital de Asuntos de Veteranos en Palo Alto. Los ratones machos C57BL / 6J de 6-8 semanas de edad fueron alimentados con comida rápida o una dieta de comida rápida suplementada con jarabe de maíz con alto contenido de fructosa al 4,2% (consulte la Tabla de materiales) en agua potable durante 14 semanas5. Los ratones se mantuvieron en jaulas estándar en un ciclo de oscuridad / luz de 12 h.
1.....
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Resultados
Las fibras de colágeno se detectaron con segunda generación armónica y microscopía de dos fotones. La señal proviene de las estructuras frangibles de colágeno fibrilar triple helicoidal y nativas. No se utilizaron anticuerpos específicos para analizar los subtipos de colágeno; Sin embargo, esto podría agregarse a la técnica de imagen.
Cuando se estudia el tejido hepático sin descelularización, es difícil obtener imágenes de alta resolución de la red de colágeno (Fi.......
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Discusión
El presente protocolo muestra que la descelularización a través de una perfusión in situ DOC de bajo caudal preserva las estructuras frangibles de colágeno fibrilar de triple hélice y nativas, proporcionando una plataforma confiable y rentable para capturar la remodelación dinámica de la ECM en la fibrosis hepática NASH. Aunque la descelularización se realizó en hígados normales y fibróticos antes de identificar componentes de la MCE o generar andamios biológicos para cultivo celular, la dinámica de la remodelac.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no hay conflictos de intereses con respecto a este artículo.
Agradecimientos
Agradecemos a Hyesuk Park por la ayuda técnica. Esta investigación fue apoyada por fondos del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, a NJT), el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (NIA), NIH (1R01AG060726, a NJT). Agradecemos a Jon Mulholland y Kitty Lee del Centro de Imágenes de Ciencias Celulares en el Centro Beckman por su asistencia técnica con las imágenes de microscopía de dos fotones.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 4-0 MONOCRYL SIN TEÑIR 1 x 18" P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
| 4-0 sutura | scientific | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
| AnaSed Inyección (xilacina) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | este medicamento para uso por o bajo la orden de un veterinario autorizado. |
| Catéter intravenoso BD INSYTE AUTOGUARD CON TECNOLOGÍA BC | BD | ||
| Chow diet | Envigo | # 2918 | Dieta de control. Una dieta de fórmula fija, no esterilizable en autoclave, fabricada con ingredientes de alta calidad y diseñada para apoyar la gestación, la lactancia y el crecimiento de los roedores. |
| Dieta de comida rápida (AIN76A Western Diet) | Dieta de prueba | 1810060 | https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
| Kit de tinción de hematoxilina y eosina | vectorlabs | H-3502 | |
| https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html Kent Scientific Rata Kit Quirúrgico fisher | scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
| INYECCIÓN DE CLORHIDRATO DE KETAMINA | Vedco | NDC 50989-996-06 - 10 mL - vial. | KetaVed se ha estudiado clínicamente en primates subhumanos, además de las especies enumeradas en Administración y dosis. |
| Leica SP5 vertical Confocal, | Leica | SP5 | |
| (llave de paso de tres vías con SPIN-LOCK®) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences, Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
| Aplicador de rayón | puritan | 25-806 1PR | |
| Desoxicolato de sodio | sigmaaldrich | D6750-100G | |
| Jarabe | www.target.com | 24 fl oz | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 |
| Bomba Peristáltica de Velocidad Variable | INTLLAB | BT100 | https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1 |
| VECTASHIELD Medio de montaje antidecoloración | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |
Referencias
- Friedman, S. L., Pinzani, M. Hepatic fibrosis: 2022 unmet needs and a blueprint for the future. Hepatology. 75 (2), 473-488 (2021).
- Ye, Q., et al. Global prevalence, incid....
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Reimpresiones y permisos
