Artículo de método

Establecimiento de un modelo de pancreatitis aguda grave en ratones mediante inyección retrógrada de taurocolato de sodio en el conducto biliopancreático

DOI:

10.3791/63129

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1 de abril de 2022

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1Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Soochow University, 2MOE Engineering Center of Hematological Disease, Soochow University, 3Cyrus Tang Hematology Center, Soochow University, 4National Clinical Research Center for Hematologic Diseases, the First Affiliated Hospital of Soochow University, 5MOH Key Lab of Thrombosis and Hemostasis, Jiangsu Institute of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 6Collaborative Innovation Center of Hematology, Soochow University

En este artículo

Resumen

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Aquí se describe un modelo de ratón de pancreatitis aguda grave. El procedimiento presentado aquí es muy rápido, simple y accesible, lo que potencialmente permite el estudio de los mecanismos moleculares y las diferentes intervenciones terapéuticas en la pancreatitis aguda de una manera conveniente.

Resumen

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La prevalencia de pancreatitis aguda (PA), especialmente pancreatitis aguda grave (PAE), está aumentando en los grupos de edad más jóvenes anualmente. Sin embargo, existe una falta de tratamientos efectivos en la práctica clínica actual. Con la fácil accesibilidad de las cepas transgénicas y knockout y su pequeño tamaño, que permite dosis mínimas de medicamentos requeridas para la evaluación in vivo , se prefiere un modelo experimental bien establecido en ratones para la investigación ap. Además, el SAP inducido a través del taurocolato de sodio (TC) es actualmente uno de los modelos más utilizados y mejor caracterizados. Este modelo ha sido investigado para nuevas terapias y posibles eventos moleculares durante el proceso de AP. Aquí, presentamos la generación de un modelo de ratón AP utilizando taurocolato de sodio y una microjeringa casera simple. Además, también proporcionamos la metodología para las pruebas histológicas y serológicas posteriores.

Introducción

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La pancreatitis aguda (PA) es una inflamación aguda del páncreas caracterizada por la obstrucción del conducto pancreático principal con distensión ductal posterior y la autodigestión del páncreas por sus enzimas anormalmente activadas. Sus manifestaciones clínicas incluyen inflamación local o sistémica, dolor abdominal y elevación de la amilasa sérica1,2. De acuerdo con la clasificación de gravedad3, la PA puede presentarse en formas leves, moderadas y graves, y entre ellas, la pancreatitis aguda grave (PAS) es la afección más preocupante debido a su alta tasa de mortalidad de más del 30%4. En los Estados Unidos, la AP es una de las razones más comunes de hospitalización, que afecta a más de 200,000 pacientes5. Además, ap, especialmente SAP, aumenta anualmente y afecta a grupos de edad más jóvenes6. Sin embargo, existe una falta de opciones de tratamiento efectivas en la práctica clínica actual6,7. Por lo tanto, es necesario explorar los mecanismos moleculares involucrados en la PA, facilitando así la mejora del tratamiento.

Se requieren modelos animales experimentales bien establecidos para estudiar los mecanismos involucrados en la PA y evaluar la efectividad de las diferentes modalidades de tratamiento. Con la fácil accesibilidad de las cepas transgénicas y knockout y su pequeño tamaño, que minimiza las dosis de medicamentos requeridas para la evaluación in vivo, los ratones son preferidos para la investigación ap. Por ello, se han desarrollado varios modelos de AP en ratones8,9.

Trabajando a partir de un modelo de pancreatitis leve en rata inducida a través de la administración intravenosa de caerulein10, Niederau et al. desarrollaron un modelo de ratón SAP presentado con necrosis celular acinar inducida utilizando el mismo fármaco y vía de inyección11. Aunque este modelo posee varias ventajas, incluyendo la no invasividad, la inducción rápida, la amplia reproducibilidad y la aplicabilidad, la principal desventaja es que solo se desarrolla una forma leve de AP en la mayoría de los casos, lo que limita su relevancia clínica. El alcohol se considera uno de los principales factores etiológicos de la PA; sin embargo, Foitzik et al. informaron que causa lesión pancreática solo cuando se combina con otros factores, como la hiperestimulación exocrina12. Además, aunque los modelos de PA inducidos por alcohol se desarrollaron a través de diferentes vías de administración, y se han reportado dosis de fármacos13,14,15, su mayor desventaja es la dificultad para reproducirlos. La administración intraperitoneal de L-arginina también puede inducir AP en ratones16; sin embargo, su baja relevancia clínica dificulta su aplicación. El taurocolato, una sal biliar, fue propuesto por primera vez por Creutzfeld et al. en 1965 para inducir una afección similar a la PA humana a través de la infusión del conducto pancreático17. Aunque existen controversias sobre su relevancia clínica en fisiopatología18,19, la pancreatitis inducida por taurocolato sigue siendo un modelo indispensable para la SAP.

Como este modelo es fácil de realizar y también es efectivo en ratones, ahora es uno de los modelos AP más utilizados para estudios in vivo en animales pequeños. Perides et al. emplearon taurocolato de sodio (CT) para inducir SAP en ratones20, proporcionando información para comprender su patología. Combinado con técnicas de modificación genética, este modelo nos ha permitido confirmar varios genes específicos implicados en la PA. Por ejemplo, Bicozo et al. demostraron que un knockout del gen CD38 protegía frente a un modelo de pancreatitis por infusión de TC y atribuían los mecanismos a alteraciones en la señalización intracelular de Ca2+21. Fanczal et al. investigaron la implicación fisiológica de la expresión de TRPM2 en la membrana plasmática de células acinares y ductales pancreáticas de ratón, y demostraron una gravedad reducida de la SAP inducida por TC en ratones knockout TRPM22. Además, este modelo también proporciona una forma simple y efectiva de probar muchos medicamentos nuevos in vivo. Por ejemplo, este método permitió validar los efectos terapéuticos de la cafeína23, el ácido deshidrocólico24 y diversos antioxidantes y anticoagulantes25,26. Esta evidencia demuestra la versatilidad del modelo SAP inducido por TC. Aunque Wittel et al. describieron un modelo de ratón similar27, la falta de detalles sobre los procedimientos de implementación podría resultar en una incapacidad para reproducir los hallazgos. En este artículo, nos centramos en los métodos que utilizan una microjeringa casera simple y estudiamos la SAP inducida por TC, proporcionando así una posible orientación no solo para un mayor estudio de la patogénesis y el tratamiento de la AP, sino también para un método experimental perfectamente adaptable para muchas otras sustancias.

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Protocolo

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Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Soochow. Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron bajo anestesia completa. No se utilizaron analgésicos para evitar interferencias con el curso natural de la enfermedad según literaturas previas28,29. La aprobación por la falta de analgesia también fue otorgada por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Soochow.

1. Preparación

  1. Rápido un ratón de tipo salvaje C57BL/6 8-12 h antes de la cirugía.
  2. Preparar una solución de TC al 5% (p/v) (93 mM) diluida en cloruro de sodio al 0,9%. Filtre la solución a través de un filtro de 0,22 μm.
  3. Autoclave los instrumentos y materiales quirúrgicos, incluyendo fórceps, tijeras, portapaspas, portaagujas, clip hemostático, pinzas vasculares y cortinas estériles, utilizando un esterilizador a presión a una temperatura de 121 °C durante 30 min.
  4. Prepara una microjeringa casera. Para hacer esto, instale manualmente una punta de insulina desechable y una punta de pipeta de plástico prolongada en una jeringa Microlitro de punta plana de 25 μL. Esterilizar mediante irradiación.

2. Anestesia y preparación preoperatoria

  1. Pesan ratones machos C57BL/6 de tipo salvaje de 6 a 8 semanas de edad (aproximadamente 21-23 g). Inducir anestesia general con una inyección intraperitoneal de solución de pentobarbital sódico al 1% a una dosis de 50 mg/kg.
  2. Fije el ratón en posición supina sobre una placa plana de espuma anirradiada con la cinta.
  3. Prepare la región de operación de cada animal retirando su pelaje con una crema depilación desde el nivel del proceso xifoideo hasta la línea de conexión de la columna ilíaca superior anterior bilateral, con los lados izquierdo y derecho paralelos a la línea axilar frontal.
  4. Prepare un campo quirúrgico estéril con un enfoque particular en el área quirúrgica, que consiste en el área preparada en el animal y la parte frontal del cirujano.
    1. Desinfecte la mesa de trabajo.
    2. Limpie el sitio de la incisión con múltiples aplicaciones de solución de exfoliación quirúrgica. Limpie la piel dos o tres veces con yodóforo al 0,5% y déjela secar durante 1-2 minutos cada vez.
    3. Cubra el ratón con cortinas estériles.

3. Procedimiento quirúrgico

NOTA: La Figura 1 muestra la anatomía y morfología del páncreas del ratón antes y después de la inyección retrógrada de TC en el conducto biliopancreático por microinyección.

  1. Haga una incisión abdominal mediana de aproximadamente 2 a 3 cm de largo.
  2. Localice el duodeno de izquierda a derecha a lo largo del estómago. Tire suavemente del duodeno hacia afuera y hacia el lado izquierdo usando fórceps quirúrgicos y un hisopo de algodón empapado en desinfectante para exponer el páncreas, el conducto biliopancreático y la papila duodenal. Tenga cuidado de no lesionar la pared intestinal o los vasos relacionados.
  3. Usar 8-0 suturas para pasar a través de la conexión entre el duodeno y el páncreas alrededor de la papila, y tirar de ellas hacia el lado izquierdo del cuerpo del ratón para fijar el duodeno.
  4. Tire suavemente de la piel y el borde inferior del hígado a un lado. Pinte el conducto hepático común, asegurándose de no sujetar la vena porta o el páncreas. Pinza el conducto biliopancreático proximal.
  5. Perfore el microinyector en el conducto biliopancreático distal retrógradamente. Fije la punta de la aguja cerca de la papila duodenal con una pinza. Infundir 10 μL de TC al 5% en el conducto pancreático a una velocidad de 5 μL/min.
  6. Mantenga el conducto biliopancreático cerrado durante 5 min para lograr una presión estable. Luego, saque el microinyector y retire las abrazaderas.
  7. Restaure el duodeno a la posición anatómica original y verifique el sangrado.
  8. Cierre la herida con suturas 6-0 y desinfecte con yodóforo al 0,5%.

4. Recuperación y gestión postoperatoria

  1. Recuperar a los animales de la anestesia en una almohadilla térmica de 37 °C. No envíe a los animales operados a la sala de postoperatorio temporal hasta que todos los animales se hayan despertado.
  2. Administrar 0,8 ml de solución salina al 0,9% por vía subcutánea y lenta para la suplementación con líquidos.
  3. Controlar a los animales después de la operación para su estado general y signos de infecciones o enfermedades.

5. Pruebas serológicas y evaluación histología

  1. A las 24 h después de la operación, anestesiar a los ratones con pentobarbital sódico utilizando la misma dosis y vía de inyección.
  2. Recoger toda la sangre de la aorta abdominal (aproximadamente 0,8 ml por ratón) y girar a 1.500 x g durante 15 minutos para aislar el suero para pruebas adicionales.
  3. Recoger los tejidos del páncreas.
  4. Abra la cavidad torácica para recoger los tejidos pulmonares.
  5. Mida los índices de función bioquímica del suero, incluida la amilasa, la lipasa, la función hepática (alanina transaminasa (ALT) y aspartato transaminasa (AST)) y la función renal (urea y creatina), utilizando kits comerciales de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.
  6. Homogeneice los tejidos pulmonares y pancreáticos y mida el nivel de mieloperoxidasa (MPO) utilizando un kit comercial de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  7. Abra la cavidad torácica y perfunda con 20 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) dos veces, luego recoja el páncreas. Sumergir en solución de paraformaldehído al 4% durante 24 h. Deshidratar en una serie de concentraciones de alcohol e incrustar en parafina.
  8. Use un microtomo para preparar secciones de tejido pancreático de 5 μm de espesor.
  9. Realizar tinción de H&E para la evaluación histológica del páncreas.
  10. Evaluar las puntuaciones patológicas según los criterios propuestos por Schmidt et al.30.

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Resultados

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Siguiendo cuidadosamente las instrucciones anteriores, obtuvimos una duración media de la cirugía de aproximadamente 40 min. Los ratones estaban ligeramente inactivos y habían perdido aproximadamente 0,5-1,75 g, 0,85-1,85 g y 0,5-4,73 g de peso a las 24 h, 48 h y 72 h después de la operación, respectivamente (Figura 2).

Desde el momento de la finalización de la cirugía hasta las 24 horas después de la operación, a medida que se desarrollaba la enfermedad, los rato...

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Discusión

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El modelo SAP inducido por TC es una excelente herramienta de investigación. Como se muestra en este estudio, este modelo se realiza muy fácilmente en laboratorios generales sin emplear dispositivos específicos. Cuando se usa en combinación con histología y análisis bioquímicos, proporciona un enfoque de costo (reactivos de bajo costo) y ahorro de tiempo (ventana de tiempo de 24 h) para inducir y evaluar AP. Ajustar la concentración de TC también ofrece la posibilidad de producir AP leve y moderado. Perides et al. tambié...

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Agradecimientos

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Agradecemos el apoyo de las siguientes subvenciones: una Subvención de Investigación Traslacional de NCRCH [2020WSA01], una Subvención Científica KJXW de la Comisión de Salud de Suzhou para Jóvenes Académicos [KJXW2020002], un Plan de Ciencia y Tecnología de la Ciudad de Suzhou (SKY2021038 y SKJY2021050), una subvención del Desarrollo del Programa Académico Prioritario de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu (PAPD) y un Plan de Investigación Primaria y Desarrollo Social de la Provincia de Jiangsu (BE2018659).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,5% yodoforoShanghai Likang Desinfectante3101024 mL/ratón
0,9% cloruro de sodioSinopharm Group Co., Ltd.100193180,8 mL/ratón
1% Pentobarbital sódicoSigmaP37610,2 -0,25 mL/ratón
25 μ L punta plana Jeringa de microlitroGaoge, ShangháiA124019
4% ParaformaldehídoBeyotime, Nantong, ChinaP0099-500ml
5% taurocolato de sodio (TC)AladdinS100834-5g10 μ L/SAP mouse
6-0 Microsutura de nailon estéril con aguja roscada (1/2 círculo)Cheng-He20093
75% de alcoholSinopharm Group Co., Ltd.100092184 mL/ratón
8-0 Microsutura de nailon estéril con aguja roscada (3/8 de círculo)Cheng-He19064
Kit de ensayo de actividad ALTEPNK, Anhui, ChinaALT0012
Kit de ensayo de amilasaEPNK, Anhui, ChinaAMY0012
Pinza de bulldog pequeña en ángulo con mordaza de 12 mm (3 cm)Cheng-HeHC-X022
virutas de álamo temblón o Trituraciones para lecho de ratonestecnología animal de laboratorio VR03015
Vital River EPNK, Anhui, ChinaKit de
EPNK, Anhui, ChinaBUN0011
C57BL/6 Kitcreatina Beijing Vital River Laboratory Animal Technology213
EPNK, Anhui, China
Característica de la hoja del micrótomoBeyotime, Nantong, ChinaE0994
Pinzas hemostáticas (9,5 cm, curvas)JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.JC3901
Kit de ensayo de lipasaJiancheng, Nanjing, ChinaA054-2-1
MicrotomoLeica biosystem, AlemaniaRM2245
Analizador de bioquímica MindrayMindray, Shenzhen, ChinaBS-420
MPO Kit de ensayoJiancheng, Nanjing, ChinaA044-1-1
Comida de ratón normalTrófico, Nantong, ChinaLAD 1000
Solución salina tamponada con fosfatoBeyotime, Nantong, ChinaC0221A
Pinza recta de micro-bulldog con mordaza de 5 mm (1,5 cm)JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.W40130
Pinzas rectas o curvas (11,0 cm)Cheng-HeHC-X091A o HC-X090A
Tijeras rectas (10,0 cm)Cheng-He, Ningbo, ChinaCentrífuga HC-J039102
Thermo ScientificThermo Scientific, EE. UU.Multifuge X1R
Kit de ensayo de actividad AST de de tecnología animal de laboratorio de Beijing ensayo de nitrógeno ureico en sangre (BUN) AST0012 ratón de ensayo de CRE0012

Referencias

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