Drosophila melanogaster Protocolo de inyección de larvas

Resumen

Las moscas adultas de Drosophila melanogaster se han utilizado ampliamente como organismos modelo para investigar los mecanismos moleculares subyacentes a las respuestas inmunes innatas antimicrobianas del huésped y las estrategias de infección microbiana. Para promover la etapa de larva de D. melanogaster como un sistema modelo adicional o alternativo, se describe una técnica de inyección larvaria.

Resumen

El uso de modelos no convencionales para estudiar la inmunidad innata y la virulencia de los patógenos proporciona una alternativa valiosa a los modelos de mamíferos, que puede ser costosa y plantear problemas éticos. Los modelos no convencionales son notoriamente baratos, fáciles de manejar y cultivar, y no ocupan mucho espacio. Son genéticamente susceptibles y poseen secuencias completas del genoma, y su uso no presenta consideraciones éticas. La mosca de la fruta Drosophila melanogaster, por ejemplo, ha proporcionado grandes conocimientos sobre una variedad de investigaciones sobre el comportamiento, el desarrollo, el metabolismo y la inmunidad. Más específicamente, las moscas y larvas adultas de D. melanogaster poseen varias reacciones de defensa innatas que se comparten con los animales vertebrados. Los mecanismos que regulan las respuestas inmunes se han revelado principalmente a través de estudios genéticos y moleculares en el modelo de D. melanogaster . Aquí se proporciona una nueva técnica de inyección larvaria, que promoverá aún más las investigaciones de los procesos inmunes innatos en larvas de D. melanogaster y explorará la patogénesis de una amplia gama de infecciones microbianas.

Introducción

Drosophila melanogaster ha sido inmensamente utilizado en la investigación biológica y biomédica durante varias décadas, ya que la sofisticada gama de herramientas genéticas y moleculares han evolucionado constantemente para el análisis de una amplia gama de estudios1,2,3,4. Los aspectos evolutivamente conservados del desarrollo, la homeostasis y la inmunidad innata en D. melanogaster lo han convertido en un valioso organismo modelo para el estudio de diversas enfermedades humanas e ^{insectos5,6<....}

Protocolo

1. Cría de moscas

NOTA: El ciclo de vida de D. melanogaster se divide en cuatro etapas: embrión, larva, pupa y adulto. El tiempo de generación con condiciones óptimas de cría en el laboratorio (~ 25 ° C, 60% de humedad y suficiente comida) es de aproximadamente 10 días desde el óvulo fertilizado hasta el adulto eclosionado. Las hembras ponen ~ 100 embriones por día, y la embriogénesis dura aproximadamente 24 ^h22. Las larvas se someten a tres etapas de desarrollo (instars; L1-L3) en ~4 días (L1 y L2: 24 h, y L3: 48 h). Las primeras larvas de instar comienzan a alimentarse inmediatamente en la s....

Resultados

Cuando se realizan correctamente, las inyecciones de larvas de D. melanogaster muestran un efecto específico de la bacteria. Los datos de supervivencia se recogieron en varios puntos temporales tras las infecciones por P. asymbiotica (cepa ATCC43943), E. coli (cepa K12) y PBS (Figura 4). Mientras que las larvas de D. melanogaster son susceptibles a P. asymbiotica, que compromete la supervivencia rápidamente, las larvas inyectadas con controles.......

Discusión

Drosophila melanogaster es uno de los modelos manipulados experimentalmente más valiosos utilizados para las investigaciones de la inmunidad innata y la patogénesis de diversas infecciones microbianas. Esto se debe a su ciclo de vida simple y rápido, mantenimiento simple en un laboratorio, genética evolutiva bien establecida y diversa caja de herramientas genéticas. Los métodos anteriores de inyecciones de larvas de D. melanogaster, como el uso de un dispositivo microfluídico híbrido o un micromanipulad.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Fly Food B (Receta de Bloomington)	LabExpress	7001-NV	Food B, en viales estrechos, 100 viales/bandeja
100 x 15, Placas de Petri mono totalmente apilables	VWR	25384-342	Diámetro 100 x 15 mm
60 x 15, Placas de Petri mono totalmente apilables	VWR	25384-092	Diámetro 60 x 15 mm
Capilares de vidrio	VWR	53440-186
Papel de filtro cualitativo de grado 1 de grado estándar, círculo	VWR	28450-150	Diámetro 150 mm
Cultivo de laboratorio Clase II Tipo A2 Cabina de seguridad de bioseguridad	ESCO	LA2-4A2-E
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425-500	LB agar miller en polvo 500 g
LB Caldo	Fisher Scientific	BP1426-500	LB caldo miller en polvo 500 g
Aceite	mineralAlfa Aesar, Thermo Fisher Scientific	31911-A1
NanoDrop 2000/2000C Espectrofotómetro	Thermo Fisher Scientific	ND-2000C
Nanoject III Inyector de nanolitros programable	Drummond	3-000-207
Viales estrechos de Drosophila, poliestireno	Genesee Scientific	32-109
Agujas, hipodérmicas	VWR	89219-316	22 g,
Extractor de micropipetas de última generación	World Precision Instruments	SU-P1000
PBS	VWR	97062-732	Buffer PBS tabletas de grado biotecnológico 200tab
Prisma	GraphPad	versión 8
Jeringas - plástico, desechables	VWR	76124-652	20 mL
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154

de 25 mm