Aislamiento escalable y purificación de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias

Resumen

Las bacterias secretan vesículas extracelulares (EV) de tamaño nanométrico que transportan moléculas biológicas bioactivas. La investigación EV se centra en comprender su biogénesis, su papel en las interacciones y enfermedades microbio-microbio y huésped-microbio, así como sus posibles aplicaciones terapéuticas. Se presenta un flujo de trabajo para el aislamiento escalable de vehículos eléctricos de varias bacterias para facilitar la estandarización de la investigación de vehículos eléctricos.

Resumen

Diversas especies bacterianas secretan ~20-300 nm vesículas extracelulares (EV), compuestas de lípidos, proteínas, ácidos nucleicos, glicanos y otras moléculas derivadas de las células parentales. Los EV funcionan como vectores de comunicación dentro y entre especies, al tiempo que contribuyen a la interacción entre bacterias y organismos huéspedes en el contexto de la infección y la colonización. Dada la multitud de funciones atribuidas a los EV en la salud y la enfermedad, existe un creciente interés en aislar los EV para estudios in vitro e in vivo . Se planteó la hipótesis de que la separación de EV basada en propiedades físicas, es decir, tamaño, facilitaría el aislamiento de vesículas de diversos cultivos bacterianos.

El flujo de trabajo de aislamiento consiste en centrifugación, filtración, ultrafiltración y cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) para el aislamiento de EV de cultivos bacterianos. Se incorporó un paso de filtración de flujo tangencial (TFF) impulsado por bomba para mejorar la escalabilidad, lo que permite el aislamiento del material de los litros de cultivo celular inicial. Escherichia coli se utilizó como un sistema modelo que expresa nanoluciferasa asociada a EV y mCherry no asociada a EV como proteínas reporteras. La nanoluciferasa se dirigió a los EV fusionando su N-terminal con citolisina A. Las fracciones de cromatografía tempranas que contenían EV de 20-100 nm con citolisina A - nanoLuc asociadas eran distintas de las fracciones posteriores que contenían las proteínas libres. La presencia de nanoluciferasa asociada a EV se confirmó mediante etiquetado de inmunooro y microscopía electrónica de transmisión. Este flujo de trabajo de aislamiento EV es aplicable a otras especies bacterianas gramnegativas y grampositivas asociadas al intestino humano. En conclusión, la combinación de centrifugación, filtración, ultrafiltración / TFF y SEC permite el aislamiento escalable de EV de diversas especies bacterianas. El empleo de un flujo de trabajo de aislamiento estandarizado facilitará los estudios comparativos de EV microbianos entre especies.

Introducción

Las vesículas extracelulares (EV) son estructuras similares a liposomas de tamaño nanométrico compuestas de lípidos, proteínas, glicanos y ácidos nucleicos, secretados por células procariotas y eucariotas¹. Desde los primeros estudios que visualizan la liberación de EV de bacterias gramnegativas², el número de funciones biológicas atribuidas a las EV bacterianas (20-300 nm de diámetro) ha estado creciendo constantemente en las últimas décadas. Sus funciones incluyen la transferencia de resistencia a los antibióticos³, la formación de biopelículas⁴, la detección de quórum

Protocolo

NOTA: Asegúrese de que todo el trabajo que involucre bacterias y ADN recombinante siga las mejores prácticas para la contención de bioseguridad apropiadas para el nivel de peligro de bioseguridad de cada cepa. El trabajo debe realizarse de acuerdo con las normas locales, nacionales e internacionales de seguridad de la biotecnología.

1. Cepas bacterianas y condiciones de cultivo

NOTA: Las cepas bacterianas utilizadas en este estudio fueron Escherichia coli MP1¹³, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve y Bifi....

Resultados

Para evaluar qué fracciones de cromatografía SEC se enriquecieron para EV, la columna SEC se cargó con 2 ml de medio de cultivo acondicionado con E. coli MP1 que había sido concentrado 1.000 veces por TFF, y se recolectaron fracciones secuenciales. Usando MRPS, se encontró que las fracciones 1-6 contenían la mayor cantidad de EV (Figura 2A). Las fracciones posteriores contenían muy pocos EVs, que comprendían proteínas libres de EV en lugar de EV (Figura 2B

Discusión

En el protocolo anterior, se describe un método que es escalable y aísla de manera confiable los EV de varias bacterias gramnegativas / positivas y aeróbicas / anaeróbicas. Tiene varios puntos de parada potenciales a lo largo del procedimiento, aunque es mejor evitar tomar más de 48 h para aislar los EV de los medios de cultivo bacteriano condicionados.

En primer lugar, consiste en cultivar bacterias para generar un medio de cultivo bacteriano condicionado. Se encontró que aumentar el tiempo d.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de PCR de pared delgada con tapa plana de 0,5 ml	Thermo Scientific	3430	es importante utilizar tubos de PCR de pared delgada para obtener lecturas precisas con
la solución acuosa de paraformaldehído (formaldehído) Qubit 16%	Ciencias de la microscopía electrónica	15700
Frascos de centrífuga de polipropileno Fiberlite de 250	mL ThermoFisher	010-1495
Botellas centrífugas de polipropileno Fiberlite de 500 mL	ThermoFisher	010-1493
Adaptador de botella de polipropileno de fondo redondo/cónico de 65 mm	Beckman Coulter	392077	Permite que Vivacell quepa en rotor
Akkermansia mucinophila	ATCC	BAA-835
Amicon-15 (100 kDa MWCO)	MilliporeSigma	UFC910024
Avanti J-20 Centrífuga XPI	Beckman Coulter		Ya no es vendido por Beckman. Avanti J-26XP es el modelo contemporáneo más cercano.
Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482	ATCC	29148
Bifidobacterium breve	NCIMB	B8807
Bifidobacterium dentium	ATCC	27678
Caldo de infusión cerebro-corazón (BHI)	Himedia	M2101	Después de la esterilización en autoclave, se introdujeron en la cámara anaeróbica tanto el caldo BHI como el agar, suplementados con menadiona (1 µ g/L), hematina (1,2 y micro; g/L) y clorhidrato de L-cisteína (0,05%). Luego se incubaron durante al menos 24 horas en condiciones anaeróbicas antes de la inoculación con las cepas bacterianas anaeróbicas.
Cartucho de microfluídica C-300	Spectradyne
Chlorampfenicol	MP Biomedicals	ICN19032105
Microscopio electrónico	FEI empresa Tecnai	G2 SpiritBT
em>Escherichia coli HST08 (Células competentes de Steller)	Takara	636763
Escherichia coli MP1	Dr. Mark Goulian (regalo)		Bacterias comensales derivadas del intestino del ratón
Adaptador Fiberlite de 500 mL a 250 mL	ThermoFisher	010-0151-05	utilizado con el rotor Fiberlite para permitir que las botellas de 250 mL se utilicen para el inicio de cultivos bacterianos
menor tamaño Rotor centrífugo de ángulo fijo Fiberlite	ThermoFisher	F12-6x500-LEX	para 6 botellas de 500 mL
Formvar Carbon Film 400 Mesh, Cobre	Ciencias de la microscopía electrónica FCF-400-CU
Glutaraldehído (grado EM, solución aqeosa al 10%)	Ciencias de la microscopía electrónica	16100
Hematin	ChemCruz	207729B	La solución madre se hizo en una solución de L-histidina de 0,2 M como   1,2 mg/mL
Lector de microplacas Infinite M Nano+	Tecan		Este equipo se utilizó para medir la fluorescencia de mCherry
In-Fusion   HD Cloning Plus	Takara	638909	Para la clonación de los fragmentos de PCR en los vectores linealizados por PCR
JS-5.3 AllSpin Rotor de cubeta oscilante Beckman	Coulter	368690
Caldo Lauria Bertani (LB), Miller	Difco	244620
Clorhidrato de L-cisteína	J.T. Baker	2071-05	Debe pesarse y agregarse directamente a los medios BHI esterilizados en autoclave dentro del anaerobio Cámara
Masterflex Racor, Polipropileno, Recto, Luer Hembra a Manguera Adaptador de lengüeta, 1/8" de diámetro interior; 25/PK	cole-parmer - especial	HV-30800-08	adaptadores de conexión para circuito de tubos de filtración
Racor Masterflex, Polipropileno, Recto, Macho Luer a Manguera Adaptador de lengüeta, 1/8" de diámetro interior; 25/PK	cole-parmer -	HV-30800-24	para circuito
de tubos de filtraciónMasterflex L/S Consola Analógica de Velocidad Variable, 20 a 600 rpm	Masterflex	HV-07555-00
Masterflex L/S Cabezal de Carga Fácil para Tubos de Precisión, 4 Rodillos, Carcasa PARA, Rotor SS	Masterflex	EW-07514-10
Masterflex L/S Tubo de Bomba de Precisión, PharmaPure, L/S 16; 25 pies	Cole Palmer	EW-06435-16	Tubo de baja fijación/baja lixiviación
Menadiona (Vitamina K3)	MP	102259	madre se fabricó en etanol como 1 mg/mL
MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK	Repligen	D04-E100-05-N	Dispositivo TFF que hemos utilizado para filtrar hasta 2 L de supernadante de cultivo de E. coli
Sistema de ensayo de luciferasa Nano-Glo Promega		N1110	Este kit de ensayo se utilizó para medir la luminiscencia de la proteína reportera nluc
NanoLuc (Nluc) anticuerpo luciferasa, clonar 965808	R& D Systems	MAB10026
nCS1 microfluídica instrumento de detección de pulsos resistivos	Spectradyne
nCS1 Viewer	Software de análisis Spectradyne		para la distribución del tamaño de partícula
OneTaq 2x Master Mix con tampón estándar	NEB	M0482	Mezcla maestra de ADN polimerasa utilizada para realizar las reacciones de PCR de rutina para la verificación de colonias
Protein LoBind, 2.0 mL, PCR tubos limpios	Eppendorf	30108450
Q5 Q5 High-Fidelity 2x Master Mix	NEB	M0492	DNA polymerasa master mix utilizada para realizar las reacciones de PCR necesarias para la clonación
qEV original, 35 nm	Izon		volumen de carga máximo de 0,5 mL
qEV rack Izon			para uso con las columnas qEV-original SEC
qEV-2, 35 nm	Izon		volumen de carga máximo de 2 mL
Fluorímetro Qubit	ThermoFisher		El artículo ya no está disponible. El producto más cercano disponible es Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238)
Kit de ensayo de proteínas Qubit	ThermoFisher	Q33211	Almacene el kit a temperatura ambiente. Los estándares se almacenan a 4 & deg;C.
Centrífuga Sorvall Lynx 4000	ThermoFisher	75006580
SpectraMax i3x Lector de microplacas	Molecular Devices		Este equipo se utilizó para medir la bioluminiscencia de la nanoluciferasa
Stericup Quick-release-GP Sistema de filtración al vacío estéril (150, 250 o 500 mL)	MilliporeSigma	S2GPU01RE S2GPU02RE S2GPU05RE	Se pueden utilizar uno o varios filtros para acomodar volúmenes de trabajo. En nuestra experiencia, puede filtrar el doble del volumen que figura en el tamaño del producto.
Acetato de uranilo	Ciencias de la microscopía electrónica	22400
Cámara anaeróbica de vinilo	Coy Lab
Vivacell 100, 100.000 MWCO PES	Sartorius	VC1042
Filtros de jeringa Whatman Anotop 10 Plus (0,02 micras)	MilliporeSigma	WHA68093002	para filtrar el diluyente MRPS