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Summary

Este protocolo tiene como objetivo medir los parámetros dinámicos (protuberancias, retracciones, volantes) de las protuberancias en el borde de las células que se propagan.

Abstract

El desarrollo y la homeostasis de los organismos multicelulares se basan en la regulación coordinada de la migración celular. La migración celular es un evento esencial en la construcción y regeneración de tejidos, y es fundamental en el desarrollo embrionario, las respuestas inmunológicas y la cicatrización de heridas. La desregulación de la motilidad celular contribuye a los trastornos patológicos, como la inflamación crónica y la metástasis del cáncer. La migración celular, la invasión tisular, el axón y el crecimiento de la dendrita se inician con protuberancias de borde celular mediadas por polimerización de actina. Aquí, describimos un método simple, eficiente y que ahorra tiempo para la obtención de imágenes y el análisis cuantitativo de la dinámica de protrusión del borde celular durante la propagación. Este método mide las características discretas de la dinámica de la membrana del borde celular, como protuberancias, retracciones y volantes, y se puede utilizar para evaluar cómo las manipulaciones de los reguladores clave de actina afectan las protuberancias del borde celular en diversos contextos.

Introduction

La migración celular es un proceso crítico que controla el desarrollo y la función de todos los organismos vivos. La migración celular ocurre tanto en condiciones fisiológicas, como la embriogénesis, la cicatrización de heridas y la respuesta inmune, como en condiciones patológicas, como metástasis de cáncer y enfermedades autoinmunes. A pesar de las diferencias en los tipos de células que participan en diferentes eventos migratorios, todos los eventos de motilidad celular comparten mecanismos moleculares similares, que se han conservado en la evolución de los protozoos a los mamíferos, e involucran mecanismos comunes de control citoesquelético que pueden detectar el entorno, responder a las señales y modular el comportamiento celular en la ^respuesta1.

Una etapa inicial en la migración celular puede ser la formación de protuberancias altamente dinámicas en el borde delantero de la célula. Detrás del lamellipodium se puede encontrar la lámina, que acopla la actina a la contractilidad mediada por la miosina II y media la adhesión al sustrato subyacente. Los lamellipodia son inducidos por estímulos extracelulares como factores de crecimiento, citoquinas y receptores de adhesión celular y son impulsados por la polimerización de actina, que proporciona la fuerza física que empuja la membrana plasmática hacia ^adelante2,3. Muchas proteínas estructurales y de señalización han sido implicadas en esto; entre ellas se encuentran las Rho GTPasas, que actúan coordinadamente con otras señales para activar proteínas reguladoras de actina como el complejo Arp 2/3, las proteínas de la familia WASP y miembros de las familias Formin y Spire en lamellipodia2,4,5.

Además de la polimerización de actina, se requiere actividad de miosina II para generar fuerzas contráctiles en el lamelepodeio y la lámina anterior. Estas contracciones, también definidas como retracciones del borde celular, también pueden resultar de la despolimerización de la actina dendrítica en la periferia celular y son críticas para desarrollar el borde de ataque lamellipodial y permitir que la protuberancia detecte la flexibilidad de la matriz extracelular y otras células y determine la dirección de la migración6,7,8 . Las protuberancias del borde celular que no pueden unirse al sustrato formarán volantes de membrana periférica, estructuras en forma de lámina que aparecen en la superficie ventral de los lamellipodia y las láminas y se mueven hacia atrás en relación con la dirección de la migración. A medida que el lamellipodium no se adhiere al sustrato, se forma un lamellipodium posterior debajo de él y empuja mecánicamente el primer lamellipodium hacia la superficie ventral superior. Los filamentos de actina en el volante que antes eran paralelos al sustrato ahora se vuelven perpendiculares a él, y el volante ahora se coloca sobre el lamellipodium que avanza. El volante que se mueve hacia atrás cae de nuevo en el citosol y representa un mecanismo celular para reciclar la actina lamellipodial9,10.

Aquí, describimos un ensayo para la medición de la dinámica de protrusión del borde celular. El ensayo de protrusión utiliza microscopía de video de lapso de tiempo para medir la dinámica de protrusión de borde celular único durante 10 minutos durante la fase de propagación de la célula. La dinámica de protrusión se analiza generando kymographs a partir de estas películas. En principio, un kymograph imparte datos cuantitativos detallados de partículas en movimiento en una gráfica espaciotemporal para obtener una comprensión cualitativa de la dinámica del borde celular. La intensidad de la partícula en movimiento se traza para todas las pilas de imágenes en una gráfica de tiempo versus espacio, donde el eje X y el eje Y representan el tiempo y la distancia, ^{respectivamente11}. Este método utiliza un análisis manual de kymograph con ImageJ para obtener datos cuantitativos detallados, lo que permite recuperar información de películas e imágenes en caso de baja relación señal-ruido y / o alta densidad de características, y el análisis de imágenes adquiridas en microscopía de luz de contraste de fase o mala calidad de imagen.

El ensayo de dinámica de protrusión de borde celular descrito aquí es un método rápido, simple y rentable. Como tal, y debido a que se ha demostrado que se correlaciona directamente con la migración ^celular11,12, se puede utilizar como un método preliminar para probar la dinámica citoesquelética involucrada en la motilidad celular antes de decidir realizar métodos más exigentes en recursos. Además, también permite la medición cuantitativa de cómo las manipulaciones genéticas (knockout, knockdown o construcciones de rescate) de proteínas citoesqueléticas afectan la dinámica citoesquelética utilizando una plataforma sencilla. El ensayo es un modelo instructivo para explorar la dinámica citoesquelética en el contexto de la migración celular y podría usarse para dilucidar los mecanismos y moléculas subyacentes a la motilidad celular.

Protocol

Todos los métodos descritos en este protocolo han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Bar-Ilan.

NOTA: En la figura 1 aparece una representación gráfica paso a paso del procedimiento descrito en esta sección.

1. Cultivo celular

NOTA: Las células utilizadas en el protocolo son fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) que se generaron a partir de embriones E11.5-13.5 de ratones C57BL/ 6 de tipo salvaje. Los MEFs primarios se generaron de acuerdo con el protocolo de laboratorio ^Jacks13. Las células de cinco embriones diferentes se agruparon e inmortalizaron mediante infección con un vector retroviral que expresa antígeno T grande SV40 seguido de selección con Histidinol de 4 mM durante 3 semanas.

1. Células de cultivo en placas de cultivo de tejidos que contienen el Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco que contiene 1 g/L de glucosa, 1% de glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina y 10% de suero fetal bovino (FBS) (ver Tabla de Materiales), en una incubadora humidificada con 5% de _CO2 a 37 °C.
2. Cultive las células hasta una confluencia del 90% -95% y divida en una proporción de 1: 5 cada 2-3 días.

2. Recubrimiento de plato con fondo de vidrio

NOTA: El recubrimiento del plato con fondo de vidrio debe realizarse en la campana de cultivo de tejidos en condiciones estériles.

1. Agregue 2 ml de solución de HCl 1N en el centro de un plato con fondo de vidrio (Tabla de materiales) e incube durante 20 min a temperatura ambiente (RT).
   NOTA: Esta etapa está destinada a eliminar los residuos del vidrio que pueden interrumpir las imágenes más adelante.
2. Lave el plato con fondo de vidrio tres veces con 2 ml de 1x PBS (Tabla de Materiales) cada uno.
3. Diluir la fibronectina (ver Tabla de Materiales) a 10 μg/mL en 1x PBS. Agregue 200 μL de la solución diluida de fibronectina al centro de vidrio del plato. Incubar a 37 °C (incubadora de cultivo de tejidos) durante 1 h.
   NOTA: Alternativamente, el plato con fondo de vidrio se puede incubar durante la noche a 4 ° C en una superficie plana.
4. Durante el tiempo de incubación del recubrimiento de fibronectina, prepare una solución de BSA (Tabla de materiales) al 1% en 1x PBS, filtre a través de 0,2 μm y desnaturalice incubando a 70 ° C durante 30 min en un baño de agua precalentado.
5. Lave el plato recubierto con fondo de vidrio tres veces con 2 ml de 1x PBS cada uno.
6. Añadir 2 ml de solución de BSA desnaturalizada al centro de vidrio e incubar durante 1 h a 37 °C (incubadora de cultivo de tejidos).
   NOTA: Alternativamente, el plato con fondo de vidrio se puede incubar durante la noche a 4 ° C en una superficie plana.
7. Lave el plato con fondo de vidrio 3 veces con 2 ml de 1x PBS cada uno.
   NOTA: La incubación de platos con fondo de vidrio con fibronectina debe realizarse durante al menos 1 h a 37 ° C para cubrir la superficie adecuadamente. Un tiempo de incubación más corto puede no producir un recubrimiento adecuado y, como resultado, el fenotipo celular puede no estar relacionado con la activación de la integrina. La capa BSA es inerte y no afectará la dinámica de protrusión y está destinada a bloquear los sitios potenciales libres para la adhesión celular independiente de la integrina. La BSA debe desnaturalizarse antes del recubrimiento para evitar que induzca la apoptosis celular, lo que puede influir en la dinámica del borde celular.

3. Preparación de células para la obtención de imágenes

1. De dieciséis a dieciocho horas antes del experimento, las células alcancen una confluencia del 70% al 80% al día siguiente. Para los MEF, placa 0,7 x ¹⁰⁶ células por placa de cultivo de tejido de 10 cm de diámetro un día antes de realizar el experimento.
   NOTA: Para un experimento de protrusión exitoso, es importante que las células se utilicen durante su fase de crecimiento logarítmico. Para lograr esto, las células deben alcanzar una confluencia del 70% al 80% el día del experimento. Una mayor densidad de células resultará en un mayor tiempo de propagación y / o impedimento en la unión durante el experimento.
2. El día del experimento, agregue 2 ml de solución de tripsina (Tabla de materiales) por placa de cultivo de tejido de 10 cm de diámetro e incube durante 2-3 minutos en una incubadora de cultivo de tejidos hasta que las células se desprendan. Inactivar la tripsina añadiendo 5 ml del medio completo.
3. Contar las células utilizando un hemocitómetro y una placa de 20.000 células en 2 ml del medio completo en un plato con fondo de vidrio recubierto como se indica arriba (sección 2).
   NOTA: El número de celdas para el revestimiento depende del tamaño y el tipo de celdas. Para células más grandes o más diseminadas, placa solo 10,000 células para tener suficientes células para la obtención de imágenes. Es importante elegir células individuales que no se toquen, ya que el contacto de célula a célula puede alterar los comportamientos de propagación intrínsecos de la célula.
4. Incubar los platos con fondo de vidrio con células chapadas en la incubadora de cultivo de tejidos durante 15 min.
   NOTA: Durante esta etapa, las células se adhieren al sustrato de fibronectina y se extienden sobre él. Al medir las protuberancias durante la propagación celular, se debe permitir que las células se propaguen durante 15 minutos después del recubrimiento y antes de la toma de imágenes. Las imágenes se pueden realizar dentro de una ventana de tiempo entre 15 minutos y ~ 1 h después del recubrimiento y, en cualquier caso, antes de que las celdas comiencen a migrar.

4. Configuración del microscopio e imágenes

NOTA: Varios sistemas de microscopía de células vivas están disponibles. El sistema utilizado aquí es un microscopio invertido Leica AF6000 equipado con unidades de _CO2 y calefacción y está conectado a una cámara CMOS digital ORCA-Flash 4.0 V2.

1. Encienda la unidad de calefacción al menos 1 h antes de obtener la imagen y configúrela a 37 °C.
2. Encienda la unidad de _CO2 al menos 10 minutos antes de la toma de imágenes y configúrela al 5% de _CO2.
3. Encienda el microscopio, la cámara y la computadora.
4. Abra el software de adquisición del microscopio (consulte la Tabla de materiales). Elija la carpeta para guardar las imágenes capturadas y escriba un nombre de archivo. Guarde cada película como un nuevo archivo.
5. Ajuste el aumento en una lente seca de 40x, contraste de fase. Establezca el intervalo de tiempo en 5 s, la duración total de la película 10 min.
6. Después de 15 minutos de incubación de las células chapadas, coloque el plato con fondo de vidrio con células adheridas en el adaptador y fíjelo. Inserte el adaptador con el plato en su ranura en la etapa del microscopio.
7. Retire la tapa del plato y coloque la tapa de _CO2 en su lugar. Abra la válvula de _CO2 .
   NOTA: Asegúrese de que la cubierta de _CO2 esté limpia antes de colocarla encima del plato con fondo de vidrio. Una cubierta sucia reducirá la calidad de las películas. Limpie la parte inferior de la tapa de _CO2 con una toallita sin pelusa empapada con etanol al 70% para eliminar el polvo y la suciedad. Limpie una segunda vez con una toallita seca sin pelusa.
8. Vea las células y encuentre una célula adecuada para la obtención de imágenes. Asegúrese de que la celda esté enfocada y comience la adquisición de películas.

5. Análisis de imágenes

NOTA: El análisis de imágenes se realiza utilizando ImageJ (Tabla de materiales) de la siguiente manera:

1. Abra la película adquirida en ImageJ.
2. Usando la herramienta Recto en la barra de herramientas principal, haga ocho líneas de 20 unidades arbitrarias cada una perpendicular a las protuberancias, incluyendo la lámina y el borde de la celda, en una disposición radial cada 45°, como se muestra en la Figura 2A.
3. En la barra de herramientas principal, vaya a > pilas > Reslice. Esto producirá una imagen de kymograph, que describe el movimiento de puntos individuales dentro de la membrana celular (Figura 2B). Esta acción debe realizarse para cada línea de las ocho líneas por separado.
4. Extraiga y cuente manualmente de las respectivas imágenes del kymograph el número de protuberancias, retracciones y volantes en cada una de las ocho regiones de la celda, marcadas por las líneas de la cuadrícula. Estos números representan la frecuencia de protuberancias, retracciones y volantes por 10 min (Figura 2C, D).
   NOTA: Los volantes se pueden distinguir de otras estructuras en función de su apariencia oscura en microscopía de contraste de fase y su movimiento centrípeto, que comienza en el borde celular y termina en el borde del cuerpo celular, que se puede observar en las películas adquiridas. Cabe destacar que, al cuantificar la protuberancia, la retracción y la frecuencia de los volantes, las películas deben observarse como un control para la cuantificación y especialmente para definir los volantes.
5. Determinar la persistencia de la protuberancia, la distancia y la velocidad mediante análisis de quimografía. Para cada uno de los kymographs generados, el eje X representa la distancia y el eje Y representa el tiempo.
6. Para medir la distancia de protuberancia, siga los pasos 5.6.1-5.6.2.
   1. Dibuja una línea perpendicular desde la base de la protuberancia hasta el pico más alto de la protuberancia. Presione M en ImageJ para medir la longitud de la línea en píxeles.
   2. Para convertir la longitud de píxeles a μm, asegúrese de que se conoce la relación píxel-μm.
      NOTA: La relación μm a píxel es la longitud física de un píxel en la cámara CCD / aumento total. El tamaño de píxel es característico de cada tipo de cámara. Por ejemplo, para la cámara utilizada en este estudio, el tamaño de píxel es de 6,5 μm x 6,5 μm, la longitud física es de 6,5 μm y el aumento que utilizamos es de 40x. Por lo tanto, la relación μm a píxel de nuestra cámara es de 0,1625 μm/píxel. En el análisis, para una línea en la longitud de 30 píxeles, la distancia de protuberancia sería de 30 píxeles x 0,1625 μm/píxel = 4,875 μm (Figura 3).
7. Para medir el tiempo de protuberancia (persistencia; la cantidad de tiempo que una protuberancia pasa sobresaliendo antes de retraerse), siga los pasos 5.7.1-5.7.2.
   1. Dibuje una línea horizontal desde el comienzo de la protuberancia (de izquierda a derecha) hasta la región del pico más alto. Presione M en ImageJ para medir la longitud de la línea en píxeles.
   2. Para convertir la longitud de píxeles a minutos, calcule la relación píxel-minuto. Este valor depende del intervalo entre imágenes.
      NOTA: En este ejemplo, el intervalo entre imágenes es de 5 s, la relación mínimo/píxel es de 0,0833 y la longitud de línea horizontal es de 8 píxeles. Por lo tanto, el tiempo de protuberancia es de 8 píxeles x 0,0833 min/píxel = 0,6664 min.
8. Mida y calcule el tiempo de retracción de manera similar al tiempo de protuberancia para una línea trazada horizontalmente en la base de la protuberancia desde donde el pico de la protuberancia está a su base a la derecha (línea X2 en la Figura 3).
9. Calcule la velocidad de protuberancia dividiendo la distancia de protrusión por el tiempo de protuberancia. Calcule la velocidad de retracción dividiendo la distancia de protrusión por el tiempo de retracción. En este ejemplo, la velocidad de protrusión se calcula como 4,875 μm/0,6664 min = 7,315 μm/min., y la velocidad de retracción es idéntica porque la línea que representa el tiempo tiene la misma longitud.
   NOTA: Al comparar diferentes tipos de células, es decir, células que expresan construcciones de tipo salvaje y mutantes de la misma proteína, es imperativo realizar un análisis ciego, para que no se introduzca ningún sesgo.

Representative Results

Discussion

La dinámica de protrusión del borde celular, compuesta de protuberancias, retracciones y volantes, es tanto un requisito previo como un evento potencial limitante de la velocidad en la motilidad celular. Aquí describimos un método rápido y simple para medir la dinámica de las protuberancias del borde celular durante la propagación. Este método permite obtener imágenes a corto plazo, genera una cantidad significativa de datos, no requiere el etiquetado fluorescente de las células o el costoso equipo de microscopía fluorescente, y podría usarse como un método preliminar para probar la dinámica citoesquelética involucrada en la motilidad celular antes de decidir realizar métodos que requieren más recursos. Además, se pueden usar células knockout o knockdown y / o mutantes de proteínas en este ensayo como una herramienta rápida y simple para identificar proteínas críticas y posibles mecanismos de señalización involucrados en la dinámica citoesquelética.

Cabe destacar que es importante elegir las células correctas para el análisis de protuberancia. Las células se incuban durante 15 minutos antes de que se adquieran películas para permitir la propagación. Si uno decide medir la protuberancia durante la propagación (en lugar de medir las protuberancias durante la migración), entonces solo se deben obtener imágenes de las células que están en su fase de propagación durante la adquisición de la película. Las células que no comenzaron a diseminarse no son apropiadas para el análisis de quimografía. Las células que completaron su fase de propagación pero no comenzaron a moverse (Figura 4) tampoco serán apropiadas para el análisis. El movimiento de su núcleo puede distinguir estas células: durante la propagación, el núcleo es estacionario, mientras que durante la migración celular, el núcleo es dinámico y se localiza en la parte posterior de la célula para construir un eje borde de ataque-centrosoma-núcleo hacia la dirección de la migración. Otro problema común en las últimas etapas de las imágenes es una situación en la que las células se tocan entre sí. Tales películas deben excluirse del análisis, ya que las interacciones y señales de las células vecinas pueden interferir con la dinámica de protuberancia del borde celular.

En este manuscrito, describimos el análisis de la dinámica de protuberancia del borde celular utilizando microscopía de luz de contraste de fase. Este método también se puede ampliar para medir la dinámica de los componentes intracelulares con microscopía de fluorescencia. Este uso común de la quimografía fluorescente se describe a menudo para medir la dinámica de las estructuras citoesqueléticas dentro de las células. Por ejemplo, Dogget y Breslin han utilizado la gammagrafía de células HUVEC transfectadas con actina GFP para analizar la dinámica y el recambio de la fibra de estrés de ^actina14.

Este protocolo y varios otros artículos anteriores utilizaron fibroblastos chapados en fibronectina para el ensayo de protrusión del borde celular, así como para los ensayos de motilidad celular bidimensional. Los fibroblastos se usan comúnmente para ensayos de motilidad y otros ensayos relacionados, como el ensayo de dinámica de protrusión del borde celular, ya que son mesenquimales y móviles y tienen estructuras citoesqueléticas claras como lamellipodia, filopodia y adherencias focales. Aunque no describimos el ensayo para otros tipos de células y sustratos, este método podría modificarse fácilmente. Por ejemplo, en la primera documentación del ensayo de dinámica de láminas, que nosotros y otros modificamos para convertirse en el ensayo de dinámica de protrusión de borde ^celular11, los autores utilizaron queratinocitos estimulados a migrar por EGF en un ensayo de rasguño, demostrando que otros tipos de células y otras estimulaciones podrían aplicarse a este ensayo. Además, aunque describimos la medición de la dinámica de protrusión del borde celular durante la propagación celular, el mismo método podría utilizarse midiendo la dinámica de las protuberancias durante la migración de las células, como se demostró, por ejemplo, en Bear et ^al.12 y Hinz et ^al.11.

De hecho, varios laboratorios han utilizado este ensayo en MEF para dilucidar la dinámica citoesquelética y los mecanismos de señalización en el pasado. Por ejemplo, Miller et al. habían utilizado previamente el ensayo de protuberancia para demostrar que Abl2/Arg media el contacto entre la actina y los microtúbulos en el borde ^celular15. Bryce et al. demostraron utilizando el ensayo que las células de derribo de cortactina tienen una motilidad celular deteriorada que co-dentro con el deterioro en la persistencia de las protuberancias lamellipodiales. Este defecto resulta de un deterioro en el montaje de nuevas adherencias en ^{protuberancias16}. Lapetina et al. utilizaron el ensayo de protrusión del borde celular en células knockout de Abl2/Arg y knockdown de cortactina rescatadas con mutantes de las dos proteínas para dilucidar un mecanismo de regulación mediado por Abl2/Arg protuberancias de borde ^celular17. Utilizando el mismo ensayo, Miller et al. también han demostrado que Arg regula la polimerización de actina mediada por N-WASP y la consiguiente dinámica de protrusión del borde ^celular18. Recientemente hemos utilizado el ensayo de protrusión del borde celular para demostrar que la tirosina quinasa pyk2 no receptora regula la dinámica de las protuberancias y la posterior migración celular a través de interacciones directas e indirectas con la proteína adaptadora CrkII. En este artículo, hemos utilizado Pyk2-WT y Pyk2^-/- y Crk-WT y mef de derribo, mutantes de rescate y experimentos de epistasis para dilucidar las interacciones moleculares y la jerarquía de señalización entre las dos proteínas durante la protuberancia del borde celular. Este novedoso y complejo mecanismo de regulación permite ajustar la dinámica de protrusión del borde celular y la consiguiente migración celular, por un lado, junto con una regulación estricta de la motilidad celular, por otro ^lado19. Utilizando el ensayo de protrusión del borde celular, los documentos anteriores y otros que siguieron han aumentado significativamente nuestro conocimiento de los mecanismos de regulación de las protuberancias del borde celular en particular y la migración celular en general.

Materials

10 cm cell culture plates	Greiner	P7612-360EA
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Biological Industries, Israel	01-055-1A	Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose)
Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS)	Biological Industries, Israel	02-023-1A
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries, Israel	04-001-1A
Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture	Sigma-Aldrich	F0895
Glass bottom dishes	Cellvis	D35-20-1.5-N	35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm).
ImageJ software	NIH		Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
LAS-AF Leica Application Suite 3.2			Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS
Leica AF6000	Leica		Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera .
L-glutamine solution	Biological Industries, Israel	03-020-1B
ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera	Hamamatsu Photonics
Penicillin-streptomycin solution	Biological Industries, Israel	03-031-1B
Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%)	Biological Industries, Israel	03-052-1A