Este protocolo tiene como objetivo medir los parámetros dinámicos (protuberancias, retracciones, volantes) de las protuberancias en el borde de las células que se propagan.
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Artículo de método
Medición de la dinámica de protrusión del borde celular durante la propagación mediante microscopía de células vivas
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En este artículo
Resumen
Resumen
El desarrollo y la homeostasis de los organismos multicelulares se basan en la regulación coordinada de la migración celular. La migración celular es un evento esencial en la construcción y regeneración de tejidos, y es fundamental en el desarrollo embrionario, las respuestas inmunológicas y la cicatrización de heridas. La desregulación de la motilidad celular contribuye a los trastornos patológicos, como la inflamación crónica y la metástasis del cáncer. La migración celular, la invasión tisular, el axón y el crecimiento de la dendrita se inician con protuberancias de borde celular mediadas por polimerización de actina. Aquí, describimos un método simple, eficiente y que ahorra tiempo para la obtención de imágenes y el análisis cuantitativo de la dinámica de protrusión del borde celular durante la propagación. Este método mide las características discretas de la dinámica de la membrana del borde celular, como protuberancias, retracciones y volantes, y se puede utilizar para evaluar cómo las manipulaciones de los reguladores clave de actina afectan las protuberancias del borde celular en diversos contextos.
Introducción
La migración celular es un proceso crítico que controla el desarrollo y la función de todos los organismos vivos. La migración celular ocurre tanto en condiciones fisiológicas, como la embriogénesis, la cicatrización de heridas y la respuesta inmune, como en condiciones patológicas, como metástasis de cáncer y enfermedades autoinmunes. A pesar de las diferencias en los tipos de células que participan en diferentes eventos migratorios, todos los eventos de motilidad celular comparten mecanismos moleculares similares, que se han conservado en la evolución de los protozoos a los mamíferos, e involucran mecanismos comunes de control citoesquelético que pueden detectar el ....
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Protocolo
Todos los métodos descritos en este protocolo han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Bar-Ilan.
NOTA: En la figura 1 aparece una representación gráfica paso a paso del procedimiento descrito en esta sección.
1. Cultivo celular
NOTA: Las células utilizadas en el protocolo son fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) que se generaron a partir de embriones E11.5-13.5 de ratones C57BL/ 6 de tipo salvaje. Los MEFs primarios se generaron de acuerdo con el protocolo de laboratorio
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Resultados
En el experimento descrito en la Figura 2, los MEF inmortalizados se enchaparon en platos con fondo de vidrio precubiertos con fibronectina para activar la señalización mediada por integrina, bloqueada por BSA desnaturalizada, para bloquear sitios potenciales libres para la adhesión celular que no depende de la activación de integrina. Para alcanzar la fase de crecimiento logarítmico al 70%-80% de confluencia de células el día del experimento, se colocaron 0,7 x 106 MEF en una pla.......
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Discusión
La dinámica de protrusión del borde celular, compuesta de protuberancias, retracciones y volantes, es tanto un requisito previo como un evento potencial limitante de la velocidad en la motilidad celular. Aquí describimos un método rápido y simple para medir la dinámica de las protuberancias del borde celular durante la propagación. Este método permite obtener imágenes a corto plazo, genera una cantidad significativa de datos, no requiere el etiquetado fluorescente de las células o el costoso equipo de microscopía fluores.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones NIH MH115939, NS112121, NS105640 y R56MH122449-01A1 (a Anthony J. Koleske) y de la Fundación de Ciencias de Israel (subvenciones número 1462/17 y 2142/21) (a Hava Gil-Henn).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placas de cultivo celular de 10 cm | Greiner | P7612-360EA | |
| (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco' s medio Eagle modificado (DMEM) | Biological Industries, Israel | 01-055-1A | El medio contiene alta glucosa (4,5 g/L D-glucosa) |
| Dulbecco' Solución salina tamponada con fosfato (1xDPBS) | Biological Industries, Israel | 02-023-1A | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Biological Industries, Israel | 04-001-1A | |
| Fibronectina de plasma humano, líquido, 0,1%, apto para cultivo celular | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Platos con fondo de vidrio | Cellvis | D35-20-1.5-N | Plato con fondo de vidrio de 35 mm, tamaño del plato 35 mm, tamaño de pozo 20 mm, cubreobjetos # 1.5 (0.16-0.19 mm). |
| Software ImageJ | NIH | Feely disponible en: | |
| https://imagej.nih.gov/ij/download.html LAS-AF Leica Application Suite 3.2 | Software de adquisición de microscopio equipado con un CMOS digital ORCA-Flash 4.0 V2 | ||
| Leica AF6000 | invertido Leica | 40x, NA 1.3 ) equipado con óptica de contraste de fase, una incubadora y una unidad de CO2 con software de adquisición LAS AF equipado con un Cámara digital CMOS ORCA-Flash 4.0 V2. | |
| Solución de L-glutamina | Biological Industries, Israel | 03-020-1B | |
| Cámara CMOS digital ORCA-Flash 4.0 V2 | Hamamatsu Photonics | ||
| penicilina-estreptomicina | Biological Industries, Israel | 03-031-1B | |
| Solución de tripsina-EDTA B (0,25%), EDTA (0,05%) | Biological Industries, Israel | 03-052-1A |
Referencias
- Kurosaka, S., Kashina, A. Cell biology of embryonic migration. Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 84 (2), 102-122 (2008).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112<....
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Reimpresiones y permisos
