Una plataforma mejorada para el cultivo de embriones enteros permite el desarrollo continuo y robusto ex utero de embriones de ratón postimplantación durante un máximo de seis días, desde las etapas de pregastrulación hasta la organogénesis avanzada. En este protocolo, detallamos el procedimiento estándar para el cultivo exitoso de embriones utilizando placas estáticas y sistemas de botellas giratorias.
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Artículo de método
Ex Utero Cultivo de embriones de ratón desde la pregastrulación hasta la organogénesis avanzada
En este artículo
Resumen
Resumen
Los métodos de cultivo de embriones de mamíferos postimplantación han sido generalmente ineficientes y limitados a breves períodos después de la disección fuera del útero. Recientemente se han desarrollado plataformas para el cultivo ex utero altamente robusto y prolongado de embriones de ratón desde las etapas de cilindro de huevo hasta la organogénesis avanzada. Estas plataformas permiten un desarrollo adecuado y fiel de embriones pregastrulantes (E5.5) hasta la etapa de formación del miembro posterior (E11). Los embriones de gastrulación tardía (E7.5) se cultivan en botellas giratorias en estos entornos, mientras que el cultivo extendido de las etapas de pregastrulación (E5.5 o E6.5) requiere una combinación de cultivos de botellas estáticas y giratorias. Además, la regulación sensible de la concentración de O2 y CO2 , la presión del gas, los niveles de glucosa y el uso de un medio de cultivo ex utero específico son críticos para el desarrollo adecuado del embrión. Aquí, se proporciona un protocolo detallado paso a paso para el cultivo extendido de embriones de ratón ex útero. La capacidad de cultivar embriones de ratón normales ex utero desde la gastrulación hasta la organogénesis representa una herramienta valiosa para caracterizar el efecto de diferentes perturbaciones experimentales durante el desarrollo embrionario.
Introducción
El desarrollo intrauterino del embrión de mamífero ha limitado el estudio de las primeras etapas del desarrollo postimplantacional1,2. La inaccesibilidad del embrión en desarrollo dificulta la comprensión de los procesos clave de desarrollo que ocurren después de que el embrión se implanta en el útero, como el establecimiento del plan corporal animal, la especificación de las capas germinales o la formación de tejidos y órganos. Además, el tamaño muy pequeño del embrión postimplantado temprano dificulta la observación por imágenes intravitales en el útero antes de E103. La inca....
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Protocolo
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las Directrices de Protección Animal del Instituto Weizmann de Ciencia y fueron aprobados por el IACUC pertinente del Instituto Weizmann (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2). Se pidió a las mujeres embarazadas sanas que dieran su consentimiento informado para recolectar sangre de su cordón umbilical, según lo aprobado por el Comité del Centro Médico Rambam Helsinki (#RMB-0452-15). A los adultos sanos se les pidió su consentimiento informado para que se recolectara sangre de acuerdo con las pautas del Comité del Instituto Weizmann de Ciencias de Helsinki (# 1566-3).
1. P....
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Resultados
Las condiciones de cultivo con rodillos descritas para embriones E7.5 (etapa de gastrulación tardía) apoyan un crecimiento embrionario constante y normal con una eficiencia promedio cercana al 75% después de 4 días de cultivo (Figura 2 y Tabla 1). La eficiencia del desarrollo embrionario puede variar entre diversos antecedentes genéticos de ratón, pero es consistentemente robusta (Figura 2C). La suplementación con HBS en lugar de HCS produce una.......
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Discusión
El protocolo de cultivo presentado aquí puede mantener un desarrollo embrionario de ratón adecuado y continuo ex utero durante un máximo de seis días, desde E5.5 hasta E11. Anteriormente, los embriones en estas etapas de desarrollo podían desarrollarse normalmente en cultivo solo por períodos cortos (hasta 48 h)15. El acoplamiento del módulo de regulación de gas a la incubadora de cultivo de rodillos para un control preciso de la concentración de oxígeno y la presión de gas hiperbárico es.......
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Divulgaciones
J.H.H es asesor de Biological Industries Ltd y ha presentado una solicitud de patente que cubre las condiciones de cultivo estático y de rodillos descritas en este documento (presentada por J.H.H. y el Instituto Weizmann de Ciencias). Otros autores declaran no tener intereses contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por Pascal e Ilana Mantoux; Consejo Europeo de Investigación (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); Consejo de Investigación Médica de Auxiliares de Vuelo (FAMRI); Cátedra del Fondo de Investigación del Cáncer de Israel (ICRF), BSF, Instituto Helen y Martin Kimmel para la Investigación de Células Madre, Premio Helen y Martin Kimmel a la Investigación Innovadora; Israel Science Foundation (ISF), Minerva, el Sherman Institute for Medicinal Chemistry, Nella and Leon Benoziyo Center for Neurological Diseases, David and Fela Shapell Family Center for Genetic Disorders Research, Kekst Family Institute for Medical Genetics, Dr. Beth Rom-Rymer Stem Cel....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,22 y micro; m filtro de tamaño de poro (250 mL) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 µ m Jeringa de tamaño de poro Filtro PVDF | Millipore | SLGV033RS | |
| 8 pocillos µ-placas fondo de vidrio/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| Botella con tapón adaptador para entrada de gas | Arad Technologies | ||
| Tapones (orificio) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 06 | Se utiliza para sellar las botellas al tambor |
| Tapones (sólidos) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 07 | Se utiliza para sellar el tambor giratorio |
| Botellas de cultivo | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 03/BTC 04 | Botellas de vidrio (pequeñas) BTC 03 o botellas de vidrio (grandes) BTC 04 |
| D(+)-glucosa Monohidrato | J.T. Baker | ||
| Cuchillo de diamante | Fine Science Tools | 10100-30/45 | |
| Manómetro digital | Shanghai Benxu Electronics Technology co., Ltd | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological industries | 02-020-1A | |
| Fetal Bovine Serum | Biological industries | 04-013-1A | |
| Módulo de regulación de gas | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | glutamina |
| Pinzas Graefe | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| Pinzas microquirúrgicas (Dumont #5, #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Pipetas Pasteur (vidrio) | Hilgenberg | 3150102 | |
| Pipetas Pasteur (plástico) | Alexred | SO P12201 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Industrias biológicas | 03-031-1B | |
| Placas de Petri (60 mm y 100 mm) | Falcon | 351007/351029 | |
| Sistema de incubadora de precisión | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | Modelo BTC01 con kit de burbujeador |
| de gas Tubos de ensayo estériles procoagulantes (5 mL) | Greiner Bio-One | #456005 | |
| Suero de cultivo de embriones enteros para ratas | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| Microscopio estereoscópico equipado con placa calefactora | Nikon | SMZ18 | |
| Jeringas estériles (5, 10 ml) para la filtración de sueros | Pic Solution | ||
| Tijeras quirúrgicas | Fine Science Tools | 14094-11 |
Referencias
- New, D. A. Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).
- Tam, P. P., Behringer, R. R. Mouse gastrulation: the....
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Reimpresiones y permisos
