Preparación biológica y técnica mecánica para determinar las propiedades viscoelásticas de las fibras zonulares

Summary

El protocolo describe un método para el estudio de la viscoelasticidad de la matriz extracelular y su dependencia de la composición proteica o de factores ambientales. El sistema matricial objetivo es la zónula del ratón. El rendimiento del método se demuestra comparando el comportamiento viscoelástico de las fibras zonulares de tipo salvaje con las que carecen de glicoproteína-1 asociada a microfibrillas.

Abstract

La elasticidad es esencial para la función de tejidos como los vasos sanguíneos, los músculos y los pulmones. Esta propiedad se deriva principalmente de la matriz extracelular (ECM), la malla de proteínas que une células y tejidos. Cómo las propiedades elásticas de una red ecm se relacionan con su composición, y si las propiedades de relajación de la ECM juegan un papel fisiológico, son preguntas que aún no se han abordado por completo. Parte del desafío radica en la compleja arquitectura de la mayoría de los sistemas ECM y la dificultad para aislar los componentes ECM sin comprometer su estructura. Una excepción es la zónula, un sistema ecm que se encuentra en el ojo de los vertebrados. La zónula comprende fibras de cientos a miles de micrómetros de longitud que abarcan el espacio libre de células entre el cristalino y la pared del ojo. En este informe, describimos una técnica mecánica que aprovecha la estructura altamente organizada de la zónula para cuantificar sus propiedades viscoelásticas y determinar la contribución de los componentes proteicos individuales. El método consiste en la disección de un ojo fijo para exponer el cristalino y la zónula y emplea una técnica de pull-up que estira las fibras zonulares por igual mientras se controla su tensión. La técnica es relativamente barata pero lo suficientemente sensible como para detectar alteraciones en las propiedades viscoelásticas de las fibras zonulares en ratones que carecen de proteínas zonulares específicas o con el envejecimiento. Aunque el método presentado aquí está diseñado principalmente para estudiar el desarrollo ocular y la enfermedad, también podría servir como un modelo experimental para explorar preguntas más amplias sobre las propiedades viscoelásticas de las ECM elásticas y el papel de factores externos como la concentración iónica, la temperatura y las interacciones con las moléculas de señalización.

Introduction

El ojo de un vertebrado contiene una lente óptica viva que ayuda a enfocar las imágenes en la ^retina1. La lente está suspendida en el eje óptico por un sistema de delicadas fibras orientadas radialmente, como se ilustra en la Figura 1A. En un extremo, las fibras se adhieren al ecuador del cristalino y, en el otro, a la superficie del cuerpo ciliar. Sus longitudes abarcan distancias que van desde 150 μm en ratones hasta 1 mm en humanos. Colectivamente, estas fibras se conocen como la zónula de ^Zinn2, la zónula ciliar, o simplemente la zónula. El trauma ocular, la enfermedad y ciertos trastorn....

Protocol

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Estudios Animales de la Universidad de Washington y se adhirieron a la Declaración ARVO para el Uso de Animales en la Investigación Oftálmica y de la Visión.

1. Fabricación de piezas especializadas y construcción de aparatos

1. Fabricación de piezas especializadas
   1. Fabricación de sondas. Sostenga un capilar de vidrio en ángulo como se muestra en el panel izquierdo de la Figura 2A. Coloque una llama de un encendedor de cigarrillos a unos 2 cm de un extremo y manténgala allí hasta que el extremo se doble 90 °, com....

Results

La técnica pull-up descrita aquí proporciona un enfoque sencillo para determinar las propiedades viscoelásticas de las fibras zonulares en ratones. En resumen, el ojo de ratón se conserva primero mediante la inyección de un fijador a presión intraocular fisiológica. Este enfoque mantiene la inflación natural del ojo y mantiene las fibras adecuadamente pretensadas (la fijación se consideró aceptable después de que los experimentos preliminares demostraron que no alteraba significativamente la elasticidad o la resistencia .......

Discussion

La zónula es un sistema ECM inusual donde las fibras están dispuestas simétricamente y pueden manipularse de manera idéntica desplazando la lente del ojo a lo largo del eje óptico. También se puede acceder fácilmente al espacio sin interrupción celular, lo que permite estudiar las fibras en un entorno cercano a su estado nativo. La técnica pull-up aprovecha esta presentación ECM para manipular las delicadas fibras de ratones, un sistema genéticamente tratable, y cuantificar con precisión sus propiedades mecánicas. Esto n.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tornillos hexagonales de 1/4-20 de 3/4 de pulgada de largo	Thorlabs	SH25S075
Tuerca de 1/4-20	ferretería
	Anycubic	Photon
4-40 tornillos de 3/8 de pulgada de largo, 2	Capilares de ferretería
, diámetro exterior 1,2 mm y 3 pulgadas de largo, sin filamento	WPI	1B120-3
Cianoacrilato (súper) pegamento	Loctite
Digital Escala con una precisión de 0,01 g	Vernier	OHAUS Scout 220
Excel	Hoja de cálculo	de Microsoft
Encendedor
Microscopio de inspección/disección	Amscope	SKU: SM-4NTP Distancia de	trabajo ~ 15 cm
Micromanipulador, económico WPI		de 4 ejesKite-L
Micrómetro motorizado	Thorlabs	Z812B
Lente cilíndrica negativa	Thorlabs	Distancia focal de LK1431L1-75 mm
Placas de Petri, 50 mm
Soporte para postes, 3 pulgadas	Thorlabs	PH3
Poste, 4 pulgadas	Thorlabs	TR4
Scale software de registro	Vernier	LoggePro
Controlador de servomotor	Thorlabs	KDC101
Software de controlador de servomotor	Thorlabs	APT
Base ranurada, 1	Thorlabs	BA1S
Bases ranuradas, 2	Thorlabs	BA2
Soporte para micromanipular	WPI	M-10
Cámara USB para microscopio	Referencia de Amscope	: MD500
Pegamento activado UV con fuente UV	Amazon