Artículo de método

Identificación de la fuente de proteínas secretadas en el riñón por la inyección de brefeldina A

DOI:

10.3791/63178

⸱

10 de noviembre de 2021

 ,  ,  , 
1Division of Nephrology and Hypertension, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identificar el tipo de célula responsable de secretar citocinas es necesario para comprender la patobiología de la enfermedad renal. Aquí, describimos un método para teñir cuantitativamente el tejido renal en busca de citocinas producidas por células epiteliales o intersticiales renales utilizando brefeldina A, un inhibidor de la secreción, y marcadores específicos del tipo celular.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La enfermedad renal crónica (ERC) es una de las diez principales causas de muerte en los Estados Unidos. La lesión renal aguda (LRA), aunque a menudo es recuperable, predispone a los pacientes a la ERC más adelante en la vida. Las células epiteliales renales se han identificado como nodos de señalización clave tanto en la LRA como en la ERC, por lo que las células pueden determinar el curso de la enfermedad a través de la secreción de citocinas y otras proteínas. Especialmente en la ERC, varias líneas de evidencia han demostrado que las células tubulares mal reparadas impulsan la progresión de la enfermedad a través de la secreción de factor de crecimiento transformante beta (TGF-β), factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF) y otras citocinas profibróticas. Sin embargo, la identificación de la fuente y el número relativo de proteínas secretadas de diferentes tipos de células in vivo sigue siendo un reto.

En este trabajo se describe una técnica que utiliza brefeldina A (BFA) para prevenir la secreción de citocinas, lo que permite la tinción de citocinas en el tejido renal mediante técnicas estándar de inmunofluorescencia. El BFA inhibe el transporte del retículo endoplásmico (RE) al aparato de Golgi, que es necesario para la secreción de citocinas y otras proteínas. La inyección de BFA 6 h antes del sacrificio conduce a una acumulación de TGF-β, PDGF y CTGF dentro de las células de los túbulos proximales (PTC) en un modelo de cisplatino de ratón de LRA y TGF-β en un modelo de ratón de ácido aristolóquico (AA) de ERC. El análisis reveló que BFA + cisplatino o BFA + AA aumentó significativamente la señal positiva de TGF-β en comparación con BFA + solución salina, cisplatino o AA solos. Estos datos sugieren que el BFA se puede utilizar para identificar el tipo de célula productora de citocinas específicas y cuantificar las cantidades relativas y/o los diferentes tipos de citocinas producidas.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se estima que >10% de la población mundial tiene algún tipo de enfermedad renal1. Definida por su rápida aparición, la LRA es en gran medida curable; sin embargo, un episodio de LRA puede predisponer a los pacientes a desarrollar ERC más adelante en la vida 2,3. A diferencia de la LRA, la ERC se caracteriza por una fibrosis progresiva y un empeoramiento de la función renal, lo que lleva a una enfermedad renal en etapa terminal que requiere terapia de reemplazo renal. La mayoría de las lesiones renales se dirigen a las células epiteliales especializadas, como los podocitos o las células de los túbulos proximales, que forman la nefrona 4,5. Después de una lesión, las células epiteliales sobrevivientes ayudan a coordinar la respuesta de reparación a través de la secreción de citocinas y otras proteínas. De esta manera, las células supervivientes pueden modular la respuesta inmunitaria, dirigir la remodelación de la matriz extracelular y ayudar a la recuperación de los órganos.

Las citocinas son pequeñas proteínas secretadas esenciales para modular la maduración, el crecimiento y la capacidad de respuesta de los organismos multicelulares 6,7. Funcionan como mensajeros de señales entre varios tipos de células, incluidas las células inmunitarias y epiteliales8. Aunque se cree que las citocinas son secretadas principalmente por las células inmunitarias, investigaciones de larga data han demostrado que las células epiteliales e intersticiales del riñón también secretan citocinas como señales para otras células renales residentes, como las células de los túbulos, las células intersticiales y las células inmunitarias 9,10. Las PTC, en particular, desempeñan un papel importante en la fase de inicio y recuperación después de la LRA11. Sin embargo, se sabe que las PTC mal reparadas secretan citocinas profibróticas como el factor de crecimiento transformante β (TGF-β), el factor de crecimiento derivado de plaquetas-D (PDGF-D) y el factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF), lo que contribuye a la progresión de la ERC12. Por lo tanto, las células epiteliales del riñón utilizan citocinas secretadas para modular la lesión renal.

Si bien se sabe que las células epiteliales renales secretan citocinas, la fuente exacta y la contribución relativa de cada tipo de célula han sido difíciles de determinar debido a los desafíos técnicos delestudio de las proteínas secretadas. La citometría de flujo, un enfoque común utilizado para medir las citocinas, es difícil de realizar en los riñones lesionados, especialmente en los altamente fibróticos. Con la recombinasa Cre impulsada por un promotor de citocinas, los ratones reporteros de citocinas se utilizan a menudo para identificar el tipo de célula que expresa una citocina determinada. Sin embargo, el uso de ratones reporteros es limitado debido a la necesidad de cruzar ratones reporteros con varios fondos de knockout, la falta de reporteros adecuados y el hecho de que solo se puede analizar una citocina a la vez. Por lo tanto, es necesario desarrollar una técnica sencilla, versátil y asequible para detectar las células renales liberadoras de citocinas.

Planteamos la hipótesis de que la inyección de BFA, un inhibidor de la secreción que bloquea el transporte endoplásmico de Loggi en vivo, permitiría la tinción de las proteínas secretadas en el tejido renal (Figura 1A,B), como se muestra con ensayos basados en citometría de flujo14,15. Junto con los fabricantes de tipos de células específicas, esta técnica podría usarse para identificar la fuente y la contribución relativa de las células productoras de citocinas en los riñones lesionados. A diferencia de las muestras para citometría de flujo, los tejidos fijos se pueden mantener a largo plazo con la preservación de proteínas y estructuras celulares, lo que permite una investigación más exhaustiva de las células secretoras. Para probar esta hipótesis, se lesionaron riñones de ratón con un modelo de LRA (cisplatino) y un modelo de ERC (nefropatía por ácido aristolóquico (AAN)), inyectados con BFA y teñidos mediante técnicas inmunofluorescentes estándar.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el protocolo de uso animal aprobado por el Comité Institucional de Usuarios y Cuidado de Animales del Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt.

1. Animales

  1. Utilice ratones machos BALB/c de 8 a 12 semanas de edad (peso corporal: aproximadamente 25 g) para la nefropatía inducida por cisplatino o ácido aristolóquico.
  2. Asegúrese de que los ratones estén sanos y no tengan signos evidentes de angustia o heridas por la pelea.
    NOTA: Las heridas, especialmente en la cola, podrían interferir con el protocolo descrito aquí. Se eligieron ratones BALB/c porque es más fácil visualizar la vena de la cola para la inyección en estos ratones. El protocolo descrito aquí funciona para otras cepas de ratones; Sin embargo, la dosis de cisplatino o ácido aristolóquico puede diferir de una cepa a otra.

2. Inyección de cisplatino

  1. Disolver el cisplatino en solución salina estéril hasta una concentración final de 1 mg/mL.
    NOTA: El cisplatino no se disolverá completamente a temperatura ambiente. Debe manipularse en una campana extractora.
  2. Calentar la solución de cisplatino en un baño de agua a 37 °C y en vórtice repetidamente hasta que el cisplatino se haya disuelto por completo.
  3. Pesar los ratones y calcular el volumen de solución de cisplatino necesario para inyectar 20 mg/kg de peso corporal (pc).
  4. Desinfectar la piel abdominal con hisopos de povidona yodada (7,5%) y alcohol (70%) alternados 3 veces cada uno.
  5. Usando una jeringa de insulina con una aguja de 25 G, inyecte la solución de cisplatino por vía intraperitoneal.
  6. Continúe con la sección 4 el día 3 después de la inyección.

3. Inyección de ácido aristolóquico (AA)

  1. Disolver el ácido aristolóquico-I en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración final de 0,5 mg/mL.
    NOTA: El AA debe manipularse en una campana extractora. Se debe utilizar AA-I, ya que es la forma dominante que induce la lesión renal.
  2. Calentar la solución de AA en un baño de agua a 37 °C y en vórtice repetidamente hasta que se disuelva por completo.
  3. Pesar los ratones y calcular el volumen de la solución de AA para inyectar 5 mg/kg de peso corporal.
  4. Desinfecte la piel abdominal con povidona yodada (7,5%) y alcohol (70%) con un hisopo 3 veces.
  5. Con una jeringa de insulina con una aguja de 25 G, inyecte la solución de AA por vía intraperitoneal.
  6. Inyecte AA cada dos días para un total de 3 inyecciones.
  7. Continúe con la sección 4 el día 42 después de la última inyección.

4. Preparación de la solución BFA

  1. Disuelva el BFA en dimetilsulfóxido a una concentración de 10 mg/mL para formar una solución madre.
  2. Almacene la solución madre a -20 °C.
  3. Diluir la solución madre de BFA con PBS estéril a la concentración final de trabajo de 1,25 mg/ml
    NOTA: Prepare una solución de trabajo nueva cada vez inmediatamente antes de la inyección.

5. Inyección de BFA en la vena de cola

  1. Antes de la inyección, coloque la jaula mitad puesta y mitad fuera de una almohadilla térmica durante 10 minutos para asegurarse de que los ratones estén calientes y evitar una caída de la temperatura corporal, que puede causar vasoconstricción de los vasos en la cola e interferir con la inyección.
    NOTA: Coloque la jaula sobre las almohadillas térmicas de modo que la mitad de la jaula esté en la almohadilla y la otra mitad no. De esa manera, cuando los ratones sientan calor, pueden moverse al otro lado de la jaula y viceversa.
  2. Sujete a los ratones utilizando dispositivos de sujeción disponibles en el mercado de tamaño adecuado.
  3. Desinfecte la cola con povidona yodada y un hisopo con alcohol tres veces como se describe anteriormente.
  4. Sostenga la cola horizontalmente y visualice las venas laterales de la cola (Figura 1C). Use una fuente de luz debajo de la cola para ayudar a visualizar las venas.
  5. Inserte una aguja de 28 G, manteniendo la aguja y la jeringa paralelas a la vena en dirección a la cabeza.
  6. Inyecte 200 μL de la solución de 1,25 mg/mL de BFA (0,25 mg de BFA). Espere a que la vena se aclare a medida que la sangre se reemplaza con la solución inyectable, lo que indica que la inyección fue exitosa.
  7. Retire la aguja y presione la cola suavemente hasta que se detenga el sangrado.
  8. Regrese a los ratones a la jaula y vigílelos para detectar sangrado adicional o signos de angustia.

6. Sacrificio y cosecha de los riñones

  1. Eutanasia a los ratones con una sobredosis de isoflurano seguida de luxación cervical 6 h después de la inyección de BFA.
    NOTA: El punto de tiempo de 6 h se eligió con base en la literatura que demuestra que 6 h de tratamiento con BFA en otros órganos permite una acumulación suficiente de citocinas dentro de las células para visualizarlas mediante tinción inmunofluorescente16.
  2. Inmediatamente después del sacrificio, exponer el abdomen y el corazón del ratón mediante una incisión ventral en la línea media.
  3. Recolectar 100-500 μL de sangre para un análisis de nitrógeno ureico en sangre (BUN) por punción cardíaca. Use agujas de 25 g con jeringas de insulina de 1 mL para recolectar la sangre. Para prevenir la coagulación, añadir 5 μL de solución de heparina (100 mg/15 mL dedH2O) a cada muestra.
    NOTA: Se necesita un mínimo de 20 μL de sangre para el ensayo BUN; sin embargo, se pueden recoger aproximadamente 500 μL por punción cardíaca después de la eutanasia, lo que podría ser útil para otros ensayos. Recolecta la mayor cantidad de sangre posible.
  4. Guarde las muestras de sangre en hielo hasta que se recojan los riñones en la sección 7 a continuación.
    1. Centrifugar las muestras de sangre a 1.300 × g durante 10 min.
    2. Aísle el plasma suavemente y guárdelo a -20 °C hasta que esté listo para realizar el ensayo BUN de la sección 17 a continuación. Alternativamente, almacene las muestras de plasma para ensayos de creatinina.

7. Perfusión y extirpación de los riñones

  1. Perfundir el ratón con 10-20 mL de PBS a través del ventrículo izquierdo usando una jeringa de 20 mL a un caudal de 2-4 mL/min hasta que la perfusión se haga clara.
  2. Extirpe los riñones sosteniendo la arteria y la vena renal con fórceps cerca de la papila y cortando los vasos del lado opuesto al riñón.
  3. Retire suavemente la cápsula de riñón despegándola con la mano o con un par de pinzas finas y estériles.
  4. Dependiendo del anticuerpo, se debe pasar a la sección 8 para la preparación de tejido fijado incluido en parafina o a la sección 10 para la preparación de tejido congelado fijo.
    NOTA: El procesamiento de tejidos deberá optimizarse para cada anticuerpo que se utilizará para la tinción.

8. Tejido incluido en parafina para la tinción de TGF-β y PDGF-D

  1. Divida el riñón colocándolo en un portaobjetos de vidrio limpio y cortándolo horizontalmente con una hoja de afeitar nueva. Coloque la mitad en 10 mL de paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS durante 24 h en un rotador de extremo a extremo a una velocidad de 10 rotaciones por minuto (rpm).
    NOTA: No se necesita todo el riñón para seccionar. La mitad del riñón se puede almacenar o utilizar para otros análisis.
  2. Reemplace el PFA con etanol al 70%.
  3. Envíe la mitad del riñón para su procesamiento e inclusión en parafina en esta etapa, luego corte los tejidos renales incrustados en parafina a 4-6 μm usando un micrótomo y móntelos en portaobjetos cargados previamente limpios17,18.
    NOTA: Los riñones fueron procesados e incorporados en parafina por el Recurso Compartido de Patología Traslacional del Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt y almacenados a temperatura ambiente.

9. Desparafinación y rehidratación

  1. Coloque los portaobjetos en una rejilla para teñir y sumérjalos en un pocillo de tinción que contenga D-limoneno durante 5 minutos, asegurándose de que el tejido esté completamente sumergido. Repita en un pocillo que contenga D-limoneno fresco.
  2. Rehidrate los tejidos sumergiendo los portaobjetos en diluciones seriadas de etanol al 100% (2x), 95%, 90% y 70% durante 5 minutos cada una.
  3. Lave los portaobjetos en dH2O durante 5 min.
  4. Realice la recuperación de antígenos incubando las secciones en tampón de citrato (pH 6.0) en una olla a presión a 121 °C y 15 psi durante 45 min.
  5. Lave los portaobjetos en dH2O durante 20 min.
  6. Pase a la sección 12.

10. Preparación de tejido congelado para la tinción con CTGF

  1. Divida el riñón a lo largo del eje horizontal con una hoja de afeitar nueva.
    NOTA: No se necesita todo el riñón para seccionar. La mitad del riñón se puede almacenar o utilizar para otros análisis.
  2. Coloque la mitad del riñón en 10 mL de PFA al 0,5% en un tubo de 15 mL en un rotador durante 2 h a 4 °C a una velocidad de 10 rpm.
  3. Decantar el PFA en un recipiente para su correcta eliminación y añadir 10 mL de glicina 0,1 M en PBS durante 1 h a 4 °C a una velocidad de 10 rpm.
  4. Decantar la glicina, añadir 10 mL de sacarosa al 15% disuelta en PBS, y colocar el tubo en un rotador durante la noche a 4 °C y 10 rpm.
  5. Decantar la sacarosa al 15% y sustituirla por 10 mL de sacarosa al 30% disuelta en PBS durante 1 h a 4 °C y 10 rpm.
  6. Llene el molde de inclusión con compuesto para temperatura de corte óptima (OCT) e incruste la mitad del riñón del paso 10.5 con la superficie de corte del riñón hacia abajo.
  7. Coloque el molde que contiene el medio riñón y OCT con cuidado en un charco de nitrógeno líquido para congelar.
    NOTA: No permita que el nitrógeno líquido entre en contacto directo con la OCT, ya que esto puede provocar la formación de burbujas. Se debe usar equipo de protección personal adecuado cuando se usa nitrógeno líquido, como gafas/protector facial, guantes criogénicos y bata de laboratorio. Lo mejor es utilizar pinzas largas, de ~25 cm, para colocar los moldes en nitrógeno líquido.
  8. Una vez congelado, almacene el molde a -80 °C.

11. Seccionamiento congelado

  1. Asegúrese de que el criostato esté a -20 °C.
  2. Almacene los moldes que contienen muestras en OCT en el criostato a -20 °C durante 2 h para equilibrar la temperatura.
  3. Retira el molde sujetando las lengüetas y presionando desde la parte inferior.
  4. Coloque OCT fresco en un soporte para muestras y coloque el bloque de muestras congeladas encima, con el lado del pañuelo en dirección opuesta al soporte para muestras.
  5. Coloque el portamuestras y la muestra en el estante de congelación.
  6. Coloque un extractor de calor ponderado en la parte superior del bloque para aplanar la superficie. Mantenga la cubierta del criostato cerrada cuando no esté en uso para evitar fluctuaciones de temperatura.
  7. Una vez que se haya congelado la OCT nueva entre el bloque de muestras y el soporte de muestras, verifique que la conexión sea segura.
  8. Sujete el portamuestras en la cabeza del micrótomo criostato.
  9. Comience a seccionar hasta que el tejido sea visible en el bloque de muestras.
  10. Divida el tejido renal a 4-6 μm y recoja las secciones en un portaobjetos19 cargado a temperatura ambiente.
  11. Una vez recogido el pañuelo, guarde el portaobjetos a una temperatura de -20 °C a -80 °C hasta que esté listo para teñir. No permita que se descongele hasta que esté listo para comenzar a teñir.
  12. Antes de teñir, retire los portaobjetos del almacenamiento y deje que se calienten a temperatura ambiente. No permita que las secciones se sequen.
  13. Una vez a temperatura ambiente, lavar inmediatamente las secciones con PBS durante 5 min dos veces a temperatura ambiente para eliminar el compuesto OCT.
  14. Pase a la sección 12.

12. Tinción de inmunofluorescencia

  1. Delinea las secciones de tejido con un rotulador de barrera hidrofóbica. Mantenga una distancia de al menos 5 mm desde el tejido hasta el contorno de la barrera hidrofóbica.
  2. Añadir 50 μL de tampón bloqueante que contenga un 3% de suero de burro y un 0,1% de Triton en suero bovino/solución salina tamponada (TBS) al 1% en la parte superior de la sección e incubar durante 1 h a temperatura ambiente en una cámara humidificada.
  3. Diluir los anticuerpos primarios con PBS a la concentración adecuada. Para la detección de citocinas, utilice 50 μL de soluciones de anticuerpos primarios dirigidos contra TGF-β1 (1:200), PDGF-D (1:400) y CTGF (1:200). Para el marcaje de miofibroblastos, se deben utilizar 50 μL de una solución del anticuerpo primario dirigida contra la actina del músculo liso alfa (α-SMA) conjugada con Cy3 a 1:200.
  4. Retire la solución de bloqueo y agregue los anticuerpos primarios a la sección, asegurándose de que no se escape del contorno hidrofóbico circular e incube durante la noche a 4 °C en una cámara humidificada. Vuelva a aplicar la barrera hidrofóbica si se produce una fuga.
  5. Lavar 3 veces con PBS durante 5 min.
  6. Diluir los anticuerpos secundarios apropiados a 1:200 con PBS.
  7. Incubar las muestras con 50 μL de soluciones de anticuerpos secundarios durante 1 h a temperatura ambiente en una cámara humidificada.
  8. Lavar con PBS durante 5 min.
  9. Lectina tetragonolobus de loto diluida (LTL) conjugada con fluoresceína en PBS con Ca2+ y Mg2+ a una concentración de 10 μg/mL.
    NOTA: Ca2+ y Mg2+ son necesarios para la unión LTL.
  10. Incubar los tejidos con 50 μL de solución LTL durante 30 min a temperatura ambiente en una cámara humidificada.
  11. Lavar con PBS con Ca2+ y Mg2+ durante 5 min.
  12. Incubar con 50 μL de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 5 μg/mL en agua) para teñir el ADN/núcleos durante 5 min a temperatura ambiente.
  13. Monte los cubreobjetos añadiendo 20 μL de reactivo de montaje antidecoloración en el pañuelo y colocando lentamente el cubreobjetos. Espere 24 horas para que el reactivo antidecoloración se solidifique antes de tomar imágenes.
    NOTA: La unión de lectina puede degradarse con el tiempo, lo que resulta en una pérdida de señal. Es mejor obtener imágenes de las muestras teñidas con lectina poco después de configurar el reactivo de montaje. Si se observa pérdida de señal, se pueden añadir Ca2+ y Mg2+ al reactivo de montaje para preservar la tinción.

13. Adquisición de imágenes

  1. Encienda el microscopio invertido (consulte la Tabla de materiales) con una platina XY automatizada.
  2. Selecciona el objetivo 20x.
  3. Abra el software de adquisición de imágenes (consulte la Tabla de materiales).
  4. Haga clic en En vivo para abrir la ventana de visualización en vivo.
  5. Busque la sección de tejido y asegúrese de que esté enfocada.
  6. Haga clic en el menú Adquirir y seleccione Escanear imagen grande.
  7. En la ventana Escanear imagen grande , configure el área que desea escanear moviendo el escenario con el joystick a la parte más a la izquierda de la sección de tejido y haga clic en la flecha izquierda. Repita el procedimiento para los segmentos de tejido superior, derecho e inferior.
  8. Haga clic en el menú de adquisición .
  9. Asegúrese de que la casilla de verificación para imagen grande esté marcada.
    1. Si captura imágenes multicanal, haga clic en la pestaña Lambda .
    2. Haga clic en cada canal y ajuste el tiempo de exposición a un nivel en el que la mancha sea aparente sin saturación de ninguna parte de la imagen.
      NOTA: Estos ajustes deben ser consistentes dentro de un grupo experimental. Cambiar la configuración de adquisición entre muestras dará lugar a resultados inexactos.
    3. Repita el paso 9.2 para cada canal que se vaya a recoger.
  10. Haga clic en Escanear.

14. Análisis de imágenes

  1. Abra el software de adquisición de imágenes.
  2. Haga clic en Archivo | Abra y seleccione la imagen.
  3. Haga clic con el botón derecho en la ventana de la imagen y elija la región de interés poligonal (ROI).
  4. Esboza el retorno de la inversión con la herramienta a mano alzada . Esbozar las células de los túbulos LTL positivas o las células intersticiales α SMA positivas.
  5. Haga clic en la pestaña Medición | Umbral.
  6. Configure los límites superior e inferior del umbral ajustando los controles deslizantes a ambos lados del área de señal positiva.
  7. Haga clic en la pestaña ROI .
  8. Haga clic en el icono Exportar para guardar los valores. Utilice un software de hoja de cálculo para calcular el porcentaje de área de señal positiva/área de ROI.

15. Alternativa: Análisis de imágenes con software libre (ImageJ)

  1. Abra ImageJ.
  2. Haga clic en Archivo | Abrir para ver una imagen.
  3. Haga clic en Selecciones a mano alzada.
  4. Seleccione el ROI delineando con la herramienta a mano alzada . Esbozar las células de los túbulos LTL positivas o las células intersticiales α SMA positivas.
  5. Haga clic en el menú Editar y seleccione Borrar exterior.
  6. Haga clic en Analizar y seleccione Medir para determinar el área de retorno de la inversión.
  7. Ir a la imagen | Colores | Canales divididos.
  8. Ajuste los límites superior e inferior del umbral para detectar el área de señal positiva.
  9. Haga clic en Analizar y seleccione Medir.
  10. Guarde los datos.
  11. Abra los datos con un software de hoja de cálculo y calcule la relación entre el área de señal positiva y el área de ROI.

16. Opcional: Imágenes con microscopio confocal de barrido láser

NOTA: Para obtener imágenes de mayor resolución para su publicación, la microscopía confocal de barrido proporciona imágenes más claras y un fondo reducido en el tejido renal.

  1. Encienda el microscopio confocal de barrido láser (consulte la Tabla de materiales).
  2. Seleccione el objetivo 40x (consulte la Tabla de materiales).
  3. Haga clic en la pestaña Localizar y busque los tejidos ajustando el foco.
  4. Vaya a la pestaña Adquisición , haga clic en Canales y elija 1 UA en la configuración estenopeica.
  5. Ajuste la intensidad de ganancia del láser en cada canal de modo que la señal positiva sea visible pero no esté saturada. Asegúrese de que los ajustes dentro de un conjunto de muestras experimentales permanezcan constantes.
  6. Haga clic en Ajustar y guarde la imagen en el formato deseado.

17. Nivel de pan de plasma

  1. Retire las muestras a -20 °C y descongélelas en hielo.
  2. Diluir el plasma con dH2O en una proporción de 1:10.
  3. Para cada muestra, configure tres reacciones separadas por duplicado en una placa de 96 pocillos.
    1. Para la muestra más estándar, agregue 5 μL de 200 mg/dL de urea y 20 μL de plasma diluido.
    2. Para la muestra sola, añadir 5 μL de dH,2O y 20 μL de plasma diluido.
    3. Para la muestra en blanco, agregue 5 μL de dH2O y 20 μL de plasma diluido.
  4. Mezclar 85 μL del reactivo + 1 μL de ureasa por muestra para preparar la solución de trabajo.
  5. Añada 80 μl de la solución de trabajo a los pocillos «muestra más patrón» y «muestra sola».
  6. Añada 80 μL del reactivo (sin ureasa) al pocillo de "muestra en blanco" del paso 17.3 anterior.
  7. Golpee suavemente la placa para mezclarla e incubarla durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  8. Lea OD560 con un lector de placas.
  9. Calcule la concentración de urea Eq (1) y conviértala a BUN usando Eq (2).
    Urea (mg/dL) = (Muestra sola-Muestra en blanco)/(Estándar-Muestra sola) x (Estándar/4) x (factor de dilución) (1)
    BUN (mg/dL) = Concentración de urea/2,14 (2)
    NOTA: Este ensayo mide el contenido de urea (peso molecular: 60) del suero; sin embargo, BUN solo hace referencia al contenido de nitrógeno de la urea (peso molecular: 28). Por lo tanto, se necesita una corrección de 2,14 (60/28) para convertir la concentración de urea en BUN.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para examinar el papel de las células epiteliales tubulares en la producción de citocinas después de la LRA inducida por cisplatino, se inyectó cisplatino a una concentración de 20 mg/kg seguido de una inyección intravenosa de 0,25 mg de BFA el día 3 después de la inyección de cisplatino. Los riñones se extrajeron 6 h después. Los riñones incluidos en parafina se seccionaron y se tiñeron con TGF-β, PDGF-D y CTGF, citocinas representativas responsables de la reparación de tejidos en la LRA. Como se muestra en la

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se sabe que las PTC renales regulan la LRA y la ERC a través de la secreción de TGF-β, TNF-α, CTGF, PDGF, factor de crecimiento endotelial vascular, así como muchas otras proteínas 20,21,22,23. Del mismo modo, los glomérulos, los túbulos distales y otras células epiteliales del riñón, así como las células intersticiales, secretan estas y/u otras proteínas duran...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Asociación Americana del Corazón (AHA): Kensei Taguchi, 20POST35200221; Departamento de Salud y Servicios Humanos (HHS) | Institutos Nacionales de Salud | Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (NIDDK, por sus siglas en inglés): Craig Brooks, DK114809-01 DK121101-01.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Jeringas de insulina de 1 mlBD329654
Jeringa de 10 mlBD302995
tubo de 2 mlMarca Fisher05-408-138
Jeringa de 20 mlBD302830
Agujas de 25 GBD305125
Agujas de 28 GBD329424
Placa de 96 pocillosCorning9017
Ácido aristolóquico-ISigma-AldrichA9461
&alfa;-SMA anticuerpo conjugado con Cy3Sigma-AldrichC6198RRID:AB_476856
Cuchilla para criostatoC.L. Sturkey. IncDT315R50
Albúmina sérica bovina (BSA)  Sigma-AldrichA7906
Brefeldina ASigma-AldrichB6542
CisplatinoSigma-AldrichP4394
Ácido cítricoSigma-Aldrich791725
ZEISS  LSM710
Objetivos de microscopía confocalZEISS40x / 1.10 LD C-Apocromat WATER
Software confocalZEISSZEN
Coplin frascoFisher Scientific19-4
Cubreobjetos marcaFisher12545F
CryostatLeicaCM1850
CTGF anticuerpoGenetexGTX124232RRID:AB_11169640
Cy3-AffiniIgG anti-conejo de burro puro (H + L)Jackson immunoresearch711-165-152RRID: AB_2307443
Cy5-AffiniIgG anti-cabra de burro puro (H + L)Jackson immunoresearch705-175-147RRID: AB_2340415
DAPISigma-AldrichD9542
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Moldes de base desechablesFisher marca22-363-553
suero de burroJackson immunoresearch017-000-121
EthanolDecon Labs, Inc.2701
PinzasVETUSESD-13
GlycineFisher brand12007-0050
Almohadillas térmicasKent scientificDCT-20
Heparina salsódica ACROS organics41121-0010100mg/15ml de dH2O
Cámara humidificadaInvitrogen44040410Se puede utilizar una caja de plástico cubierta con papel de aluminio como Cámara humidificada alternativa.
Jeringas de insulinaBD329461
Microscopio invertidoNIKONEclipse Ti-E2inmunofluorescencia
KIM-1 anticuerpoR & DAF1817RRID:
AB_2116446 Lemozol (Histo-clear)National diagnosticsHS-200
lotus tetragonolobuslectina VectorFL-13212
Portaobjetos de microscopioFisher scientific12-550-343
MicrotomoReichertJung 820 II
cámara CMOS monocromáticaNIKON  DS-Qi-2
Kit quirúrgico para ratonesKent scientificINSMOUSEKIT
NIS Elements NIKON
Plan Apo 20x/0.75software de adquisición de imágenes vinculado a Eclipse Ti-E2 (microscopio invertido)
Compuesto OCTScigen4586
Pap plumaVectorH-4000
PBS con calcio y magnesioCorning21-030-CV
PBS sin calcio y magnesio Corning21-031-CV
PDGF-D anticuerpoThermo-Fisher scientific40-2100
PFACiencia de microscopía electrónica15710RRID: AB_2533455
Lector de placasPromegaGloMax® Descubra el lector de microplacas4% PFA se diluye al 16% en PBS.
povidona yodada (Betadine)Avrio Health L.P.NDC 67618-151-17
Olla a presión  Tristar 8Qt. Power Cooker Plus
ProLong Gold Reactivo AntidecoloraciónInvitrogenP36930
Quantichrom Urea (BUN) Assay Kit IIBioAssay SystemsDUR2-100
Cuchilla de afeitar de un solo filo para disección de riñón (.009", 0.23 mm)Herramientas IDL521013
Calentador de diapositivasLab Scientific Inc.,XH-2001
SoftwareNIKONNIS elements
SacarosaRPIS24060
TGF-b1 anitbodySigma-AldrichSAB4502954
Tris EDTA bufferCorning46-009-CMRRID: AB_10747473
Citrato trisódico dihidratadoSigma-AldrichSLBR6660V
Citrato trisódico dihidratadoSigma-Aldrich
TritonSigma-Aldrich9002-93-1
Tween 20Sigma-AldrichP1379
Portaobjetos de Microscopio Cargado de Vidrio Blanco, Tamaño de 25 x 75 mm, Bordes Rectificados, AzulFrosted Globe Scientific1358D
Microscopio confocal Objetivos NIKON SLBR6660V

Referencias

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