Este protocolo describe un modelo animal compuesto con exposición a partículas (PM) que agrava la isquemia miocárdica con aterosclerosis.
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Artículo de método
Agravamiento de la isquemia miocárdica tras la exposición a partículas en un modelo animal de aterosclerosis
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Resumen
Resumen
Los problemas de salud causados por la contaminación del aire (especialmente la contaminación por partículas) están recibiendo cada vez más atención, especialmente entre los pacientes con enfermedades cardiovasculares, lo que agrava los trastornos complicados y causa un mal pronóstico. El modelo de exposición a isquemia miocárdica simple (IM) o partículas (PM) no es adecuado para tales estudios de enfermedades con múltiples causas. Aquí, se ha descrito un método para construir un modelo compuesto que combina la exposición a PM, la aterosclerosis y la isquemia miocárdica. Los ratones ApoE-/− fueron alimentados con una dieta alta en grasas durante 16 semanas para desarrollar aterosclerosis, se realizó la instilación traqueal de la suspensión estándar de PM para simular la exposición pulmonar de PM, y la arteria coronaria descendente anterior izquierda se ligó una semana después de la última exposición. La instilación traqueal de PM puede simular la exposición pulmonar aguda al tiempo que reduce significativamente el costo del experimento; La clásica ligadura de la arteria descendente anterior izquierda con intubación traqueal no invasiva y un nuevo dispositivo de expansión auxiliar pueden garantizar la tasa de supervivencia del animal y reducir la dificultad de la operación. Este modelo animal puede simular razonablemente los cambios patológicos del paciente de infarto de miocardio agravados por la contaminación del aire y proporcionar una referencia para la construcción de modelos animales relacionados con estudios que involucran enfermedades con múltiples causas.
Introducción
La contaminación del aire se ha asociado con una alta mortalidad por todas las causas y contribuyó con una carga significativa de enfermedad más que la suma de la contaminación del agua, la contaminación del suelo y la exposición ocupacional1. Un informe de la OMS reveló que la contaminación del aire exterior causó 4,2 millones de muertes prematuras tanto en ciudades como en zonas rurales de todo el mundo en 20162. El 91% de las personas en todo el mundo viven en lugares donde la calidad del aire excede los límites de las directrices de la OMS2. Además, la materia particulada fina (PM) (≤2,5 μm de diámetro, PM2,5) es reconocida como la amenaza más importante de contaminación del aire para la salud pública mundial3, especialmente para las personas que viven en ciudades de países de ingresos bajos y medios.
Los efectos adversos de la contaminación del aire en las enfermedades cardiovasculares merecen más atención. Estudios previos han demostrado que la PM conduce a un mayor riesgo de enfermedad cardiovascular (ECV)4. La exposición a altas concentraciones de partículas ultrafinas durante varias horas puede conducir a un aumento de la mortalidad por infarto de miocardio. Para las personas con antecedentes de infarto de miocardio, la exposición a partículas ultrafinas puede aumentar significativamente el riesgo de recurrencia5. Además, generalmente se acepta que la exposición a PM acelera la progresión de la aterosclerosis6.
Para la investigación médica, es crucial seleccionar un modelo animal adecuado. Ya existen modelos animales de aterosclerosis simple7, modelos animales de isquemia miocárdica8 y modelos animales de exposición a PM9. El ratón ApoE−/− (apolipoproteína E noqueada) es un modelo de ratón tradicional utilizado en estudios de aterosclerosis. La capacidad de eliminar las lipoproteínas plasmáticas en ratones ApoE−/− se ve gravemente afectada. La alimentación con dieta alta en grasas causaría aterosclerosis severa, asemejándose a la dependencia dietética de la cardiopatía aterosclerótica observada en humanos7. La ligadura de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) es un método clásico para inducir el evento isquémico 8,10. La infusión traqueal ha sido utilizada en muchas investigaciones y se destaca de los modelos de exposición11,12 debido a su mejor simulación y menor costo.
Sin embargo, los modelos animales de una sola enfermedad tienen limitaciones significativas en la investigación científica. La isquemia miocárdica inducida simplemente por la ligadura de LAD no se simula en la situación real. En el estado natural, la isquemia miocárdica suele ser causada por la ruptura de la placa y el bloqueo de las arterias coronarias13. Los pacientes con miocardiopatía isquémica suelen presentar lesiones básicas ateroscleróticas13. También hay metabolismo anormal de los lípidos y reacciones inflamatorias en el cuerpo14. Por lo tanto, la isquemia causada por factores físicos o en condiciones naturales tiene diferentes manifestaciones patológicas. Estudios existentes han demostrado que el infarto y la inflamación en modelos de isquemia miocárdica con aterosclerosis son más graves15,16. La exposición a PM puede agravar aún más la aterosclerosis y la isquemia miocárdica al inducir inflamación y estrés oxidativo1. Tres factores generalmente coexisten en el estado natural, por lo que la situación real podría simularse mejor mediante el uso de un modelo compuesto.
Este protocolo describe el desarrollo de un modelo animal de isquemia miocárdica (IM) que combina aterosclerosis (EA) y exposición aguda a PM. Los ratones ApoE−/− fueron alimentados con una dieta alta en grasas para inducir aterosclerosis. La exposición pulmonar de PM fue imitada por goteo de suspensión de PM a través de la tráquea. La ligadura de la LAD en ratones se utilizó para inducir isquemia miocárdica. Estos métodos se combinaron y optimizaron para simular mejor el estado de la enfermedad y mejorar la tasa de supervivencia de los animales. No se necesita una gran unidad de exposición o una máquina de anestesia de gas, lo que hace que el experimento sea fácil de realizar. Este modelo se puede utilizar para estudiar el impacto de la exposición a PM en la contaminación del aire en la aterosclerosis y la miocardiopatía isquémica y realizar investigaciones sobre nuevos medicamentos desarrollados para tratar enfermedades con factores tan complejos.
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Protocolo
Todas las actividades con animales descritas aquí fueron aprobadas por el Comité de Ética Animal del Instituto de Materia Médica China, Academia China de Ciencias Médicas Chinas. Para el estudio se utilizaron ratones machos ApoE−/− (fondo C57BL/6) de 6-8 semanas de edad.
1. Preparación experimental
- Prepare anestésicos de tribromoetanol (15 mg/ml): disuelva 0,75 g de tribromoetanol en 1 ml de alcohol terc-amílico (ver Tabla de materiales). Después de la disolución completa, dilúyalo a 50 ml con solución salina estéril. Conservar la solución a 4 °C en un recipiente estéril y evitar la exposición a la luz.
NOTA: En este protocolo, se utilizó tribromoetanol debido al tiempo óptimo de recuperación de la anestesia y la tasa de supervivencia de los animales. Siga las recomendaciones del comité local de ética animal al seleccionar el régimen de anestesia. - Preparar la suspensión PM: medir 5 mg de DPM (material particulado diesel, ver Tabla de materiales) en tubos de centrífuga de 10 ml. Agregue 5 ml de solución salina normal y voltee el tubo boca abajo para mezclar bien. Use una película de parafina para sellar el tubo y luego colóquelo en un limpiador ultrasónico durante 2-3 h (40KHz, 80w) para la rotura ultrasónica.
NOTA: La suspensión debe ser homogénea y libre de partículas aglomeradas. Agitar bien antes de usar.
2. Inducción de aterosclerosis en ratones
- Alimente a los ratones con una dieta alta en grasas (yema de huevo en polvo 10%, manteca de cerdo 10%, esterol 1%, alimento de mantenimiento 79%, consulte la Tabla de materiales) durante 12 semanas.
- Para estimar el progreso de la aterosclerosis, seleccione 2-3 ratones al azar y verifique si hay una placa en el arco aórtico mediante imágenes de ultrasonido u observación anatómica directa17.
NOTA: Para la observación anatómica, los animales fueron seleccionados mediante muestreo aleatorio y sacrificados después de la anestesia. Luego, se abrió su cavidad torácica y se visualizaron directamente los vasos sanguíneos. La observación anatómica suele ser más confiable porque las imágenes de ultrasonido pueden no detectar todas las placas. - Una vez que la aterosclerosis se ha juzgado formada, prepare a los ratones para el siguiente paso.
3. Intubación orotraqueal y exposición aguda a partículas
NOTA: PM estará expuesto una vez a la semana durante 4 semanas después de 12 semanas de alimentación alta en grasas y continuamente se le dará una dieta alta en grasas.
- Prepare una tabla de disección (consulte la Tabla de materiales) con una banda elástica que se asegure a 1,5 cm del borde superior. Fije la placa de disección en un ángulo de 60° desde el plano de la mesa.
- Anestesiar al ratón con anestésico de tribromoetanol por inyección intraperitoneal (0,1 mL por cada 10 g de peso corporal). Después de 2-3 minutos, voltee el mouse para verificar si hay un reflejo de enderezamiento. Realice un pellizco en el dedo del pie para confirmar la sedación. Deje caer lubricante estéril en los ojos.
- Desinfecte la tabla de disección con toallitas con alcohol.
- Coloque el ratón anestesiado en posición supina sobre la tabla y enganche los incisivos superiores a la banda elástica.
- Utilice un pequeño foco LED (consulte la Tabla de materiales) con un tubo flexible. Enfoca la luz en la tráquea, que se encuentra alrededor del punto medio de la línea axilar.
- Coloque un pequeño hisopo de algodón estéril en la boca del ratón, luego enrolle el hisopo para sacar la lengua.
- Sostenga la lengua y tire suavemente hacia arriba para formar la cavidad oral, la faringe y la tráquea en la misma dirección longitudinal. La glotis, que es la entrada de la tráquea, se mostrará como un punto brillante, que se abre y se cierra con cada respiración.
- Siga sosteniendo la lengua suavemente. Inserte la cánula (22 G) en la tráquea del ratón apuntando a la glotis, sacando el núcleo de la aguja después de insertar la cánula en la tráquea.
- Use una pistola de pipeta con una pequeña cantidad de solución salina normal para probar si el tubo está correctamente en la comadreja. Si el tubo está en la posición correcta, la columna de líquido en la pistola de pipeta rebotará con cada respiración.
- Coloque 50 μL de suspensión DPM (preparada en el paso 1.2) en el tubo con una pipeta. La suspensión se inhalará naturalmente en los pulmones del ratón mientras respira.
NOTA: Para garantizar una respiración suave, es mejor darle al ratón dos veces la suspensión DPM (25 μL por una vez), separada por 10 s. - Retire la aguja permanente de la mascota después de la exposición a PM. Espere a que el ratón permanezca en las almohadillas térmicas hasta que recupere la conciencia (10-20 min) y luego vuelva a colocarlo en la jaula de la casa.
4. Ligadura de arterias coronarias
NOTA: La operación de modelado de isquemia miocárdica (ligadura de la arteria coronaria) se realiza enla semana 16.
- Preparar instrumentos quirúrgicos. Después del autoclave, guarde todas las herramientas quirúrgicas en una caja de instrumentos sellada. Remojarlos en alcohol al 75% durante 20-30 minutos antes de la cirugía.
- Construir la plataforma de cirugía. Para lograr la pendiente adecuada de la plataforma, utilice una cubierta de placa de cultivo celular (150 mm x 25 mm). Doble la seda 0-0 (10-15 cm de longitud) por la mitad y fije los extremos del hilo a la parte superior de la plataforma inclinada con cinta adhesiva para crear un lazo de suspensión.
- Anestesiar a los ratones siguiendo el procedimiento descrito en el paso 3.2.
NOTA: Se debe asegurar un intervalo de 1 semana entre cada administración de tribromoetanol. - Desinfecte la plataforma con toallitas con alcohol.
- Colocar el ratón en posición supina sobre la plataforma de intubación y enganchar los incisivos superiores en el asa de suspensión descrita en el paso 4.2. Pegue con cinta adhesiva la cola, las extremidades y los bigotes.
- Retire el vello del pecho izquierdo y parte del pecho derecho adyacente con crema depilatoria antes de la cirugía.
- Realizar la intubación orotraqueal en ratones siguiendo el procedimiento descrito en los pasos 3.4-3.8.
- Vincule la aguja que habita en la mascota con un ventilador para animales (consulte la Tabla de materiales). Configuración del ventilador: frecuencia respiratoria- 120 veces / min; relación inhalación/respiración: 1:1.1; volumen corriente - 1.7 mL.
- Limpie la piel con yodóforo y alcohol para desinfectar.
- Exponer el corazón. Haga un corte de piel de 0,5-1 cm con tijeras oftálmicas y sujete los músculos (músculo pectoral superficial y músculo serrato anterior) para exponer las costillas. Sujete la costilla con una pinza oftálmica (con ganchos) y luego haga un pequeño corte en el tercer espacio intercostal (consulte la Tabla de materiales). Haga una ventana operativa con herramientas caseras de apertura de pecho.
NOTA: El corte de piel se encuentra en aproximadamente un tercio del proceso xifoide y la línea de la axila. - Rasgar las membranas pericárdicas. Entonces es posible ligar LAD siguiendo los pasos 4.11-4.14.
NOTA: Si los lóbulos pulmonares están bloqueando la vista, empújelo detrás del corazón con un pequeño hisopo de algodón estéril. - Al principio, localice el LAD.
- Sostenga la sutura de seda estéril 6-0 con una aguja usando pinzas hemostáticas microvasculares (consulte la Tabla de materiales). Pasar la seda a través de un ancho de miocardio de 2 mm en el área donde se encuentra la arteria coronaria.
NOTA: No intente ligar el LAD solamente, que puede causar una hemorragia intraoperatoria importante. - Coloque un trozo corto de seda 5-0 estéril entre la ligadura y los tejidos del miocardio para evitar la rotura del tejido.
- Ate el LAD y el pequeño haz del miocardio alrededor de él con fuerza. La ligadura se considera exitosa cuando la pared anterior del ventrículo izquierdo (VI) se vuelve pálida; La elevación del segmento ST se puede observar simultáneamente si se conecta una máquina de electrocardiograma.
- Exprima suavemente el aire del pecho. Suturar los músculos intercostales y la piel secuencialmente con seda estéril 5-0.
NOTA: Para exprimir el aire del tórax, cierre el tórax en el momento de la expansión pulmonar y use los dedos índice y medio para apretar suavemente la caja torácica en el medio y permitir que el aire escape más allá de la última puntada. Las jeringas también se pueden usar para extraer gas torácico.
NOTA: Se recomienda una sutura interrumpida simple, ya que los ratones pueden roer la seda cuando están despiertos.
5. Recuperación
- Limpie toda la mancha de sangre después de la cirugía, o el ratón sería atacado por otros.
- Coloque el ratón sobre una almohadilla térmica en posición reclinada lateral. Controle continuamente los signos del ratón durante 5-20 minutos hasta que se recuperen de la anestesia. El tiempo de monitoreo depende del estado del cuerpo.
NOTA: Los ratones respiran mejor en la posición lateral reclinada. - Una vez recuperado el reflejo de enderezamiento, transfiera los ratones a jaulas de recuperación limpias en una almohadilla térmica con comida y botella de agua. Continúe monitoreando durante 15-30 minutos para garantizar la supervivencia del ratón. Mantenga el ratón alejado de los demás antes de que pueda moverse de forma totalmente autónoma.
- Para prevenir la infección de la herida, inyecte penicilina sódica por vía intramuscular de acuerdo con la dosis deseada (1,00,000-1,50,000 U/kg). Para obtener más detalles, consulte la etiqueta del medicamento para la conversión de la dosis.
- Vuelva a colocar el ratón en la jaula de la casa. Mantenga el monitoreo durante las próximas 24 h antes de la recolección de muestras. Administrar analgésicos para experimentos a largo plazo.
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Resultados
Los ratones fueron sacrificados 24 h después de la ligadura de la arteria coronaria, y la sangre se recogió después de la anestesia. Los ratones fueron anestesiados por tribromoetanol (según el paso 3.2), y la muestra de sangre se recogió del seno retroorbitario. Se extrajo el corazón y se examinó el grado de isquemia mediante tinción de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) (Figura 1). Los tejidos normales se vuelven rojos cuando el TTC reacciona con la succinato deshid...
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Discusión
El establecimiento de un modelo animal compuesto es ligeramente diferente del modelo IM único. Mantener una alta tasa de supervivencia es un desafío en el desarrollo del modelo compuesto. La gravedad de la aterosclerosis en ratones ApoE−/− se volverá más severa con la extensión del tiempo de alimentación alto en grasas7, y la debilidad de los ratones conduce a una mayor mortalidad. Por lo tanto, es necesario monitorear la condición de los ratones durante el experimento continuamente y a...
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Divulgaciones
Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos que declarar.
Agradecimientos
Este modelo fue desarrollado con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nos. 81673640, 81841001 y 81803814) y el Programa Nacional Principal de Ciencia y Tecnología de China para Medicamentos Innovadores (2017ZX09301012002 y 2017ZX09101002001-001-3).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2,2,2-tribromoetanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| 75% alcohol desinfectante Ventilador | |||
| para animales | Shanghai Alcott Biotech | ALC-V8S Bastoncillos | |
| de | estériles | ||
| Hisopos de algodón para bebés | Estéril , Aproximadamente 3 mm de diámetro | ||
| Placa | de cultivoCorning | 430597 | 150 mm x 25 mm |
| Diésel Material particulado Instituto | Nacional de Tecnología de Normalización | 1650b | |
| Tablero | Aprox. 25 x 17 cm. El tablero de disección se puede reemplazar por un tablero de madera del mismo tamaño | ||
| Dieta alta en grasas para ratones | Prescripción: yema de huevo en polvo 10%, manteca de cerdo 10%, esteroles 1%, alimento de mantenimiento 79% | ||
| Desinfectante | |||
| Foco | 5 V, 3 W, con mangueras y abrazaderas Bola de | ||
| hilo de seda médica | Shanghai Medical Suture Needle Factory Co., Ltd. | - | 0-0 |
| Cinta médica | 3M | 1527C-0 | |
| Pinzas hemostáticas microvasculares | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Fábrica de instrumentos quirúrgicos | W40350 | |
| Portaagujas | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Fábrica de instrumentos quirúrgicos JC32010 | ||
| solución salina | |||
| normalTijeras oftálmicas | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Fábrica de Instrumentos Quirúrgicos | Y00040 | |
| Pinza oftálmica, 10cm, curvada, con ganchos | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Fábrica de Instrumentos Quirúrgicos | JD1080 | |
| Pinza oftálmica, 10cm, curvada, con dientes | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Fábrica de Instrumentos Quirúrgicos | JD1060 | |
| Puntas de pipeta | Axygen | T-200-Y-R-S | 0-200 μ |
| L Pipeta | eppendorf 3121000074 | 100 uL | |
| Alfiler | Aproximadamente 4,5 cm de longitud, para la fabricación de herramientas de apertura de pecho | ||
| Cánulas intravenosas para animales pequeños | Baayen healthcare suzhou | BAAN-322025 | CATÉTER INTRAVENOSO 22FG x 25 MM |
| Aguja de sutura con hilo | Shanghai Medical Suture Needle Factory Co., Ltd. | - | 6-0,Línea de nylon Aguja |
| sutura con hilo | JinHuan Medical | F503 | 5-0 |
| Jeringa | 1 mL | ||
| Terc-amyl | |||
| alcohol Zoom-microscopio estereoscópico | Mshot | MZ62 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
