Artículo de método

Uso de la optogenética para revertir la neuroplasticidad e inhibir la búsqueda de cocaína en ratas

DOI:

10.3791/63185

⸱

5 de octubre de 2021

 ,  , 
1Department of Psychiatry, University of Pittsburgh, 2Department of Psychiatry, Rutgers University

En este artículo

Resumen

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Los métodos descritos aquí describen un procedimiento utilizado para revertir optogenéticamente la plasticidad inducida por la cocaína en un circuito conductualmente relevante en ratas. La estimulación óptica sostenida de baja frecuencia de las sinapsis tálamo-amígdala induce depresión a largo plazo (LTD). La LTD inducida optogenéticamente in vivo en ratas experimentadas con cocaína resultó en la posterior atenuación de la búsqueda de drogas motivada por señales.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo demuestra los pasos necesarios para usar herramientas optogenéticas para revertir la plasticidad inducida por la cocaína en los circuitos tálamo-amígdala para reducir los comportamientos posteriores de búsqueda de cocaína en la rata. En nuestra investigación, descubrimos que cuando las ratas se autoadministran cocaína intravenosa combinada con una señal audiovisual, las sinapsis formadas en las entradas del núcleo geniculado medial del tálamo (MGN) en las neuronas principales de la amígdala lateral (LA) se vuelven más fuertes a medida que se aprende la asociación señal-cocaína. Planteamos la hipótesis de que la reversión de la plasticidad inducida por la cocaína en estas sinapsis reduciría el comportamiento de búsqueda de cocaína motivado por señales. Para lograr este tipo de neuromodulación in vivo, queríamos inducir la depresión sináptica a largo plazo (LTD), que disminuye la fuerza de las sinapsis MGN-LA. Para ello, utilizamos la optogenética, que permite la neuromodulación de los circuitos cerebrales utilizando la luz. La opsina excitatoria oChiEF se expresó en terminales MGN presinápticos en el LA mediante la infusión de un AAV que contenía oChiEF en el MGN. Luego se implantaron fibras ópticas en el LA y se pulsó luz láser de 473 nm a una frecuencia de 1 Hz durante 15 minutos para inducir LTD y revertir la plasticidad inducida por la cocaína. Esta manipulación produce una reducción duradera en la capacidad de las señales asociadas con la cocaína para inducir acciones de búsqueda de drogas.

Introducción

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El abuso de sustancias es un problema de salud pública muy grave en los Estados Unidos y en todo el mundo. A pesar de décadas de intensa investigación, hay muy pocas opciones terapéuticas efectivas 1,2. Un revés importante para el tratamiento es el hecho de que el uso crónico de drogas genera recuerdos asociativos a largo plazo entre las señales ambientales y la droga en sí. La reexposición a señales relacionadas con las drogas impulsa respuestas fisiológicas y conductuales que motivan el uso continuo de drogas y la recaída3. Una estrategia terapéutica novedosa es promulgar tratamientos....

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Protocolo

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Los experimentos descritos en este protocolo fueron consistentes con las pautas establecidas por la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pittsburgh. Todos los procedimientos se realizaron con ratas Sprague-Dawley adultas e ingenuas que pesaban 275-325 g a su llegada.

1. Construcción de implantes de fibra óptica y cables de conexión

  1. Preparar los implantes de fibra óptica siguiendo los protocolos publicados anteriormente9. Los experim....

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Resultados

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En la Figura 1 se muestra una línea de tiempo que describe el orden de los experimentos. A lo largo de los experimentos conductuales, el número de infusiones de cocaína, así como el número de respuestas realizadas en la palanca activa sirve como una medida de la intensidad del comportamiento de búsqueda de cocaína. Durante los primeros días de autoadministración de cocaína, el número de respuestas activas debe aumentar gradualmente a lo largo de cada día de adquisición, antes de estabilizars.......

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Discusión

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Como se describió anteriormente, hay varios pasos críticos que son importantes para lograr los resultados experimentales adecuados. Es probable que el protocolo solo sea efectivo en animales que adquieran adecuadamente la autoadministración de cocaína, y hasta la fecha, solo se ha probado utilizando los parámetros descritos anteriormente. Es posible que la dosis de cocaína, el programa de refuerzo y los parámetros de señal puedan modificarse con probablemente poco efecto sobre los resultados conductuales, con la excepció.......

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Divulgaciones

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Nada que revelar.

Agradecimientos

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Los autores desean agradecer el apoyo de las subvenciones de USPHS K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR) y el Departamento de Salud de Pensilvania.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.9% SalineFisher ScientificNC0291799
A.M.P.I. Stimulus IsolatorIso-Flex
AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomatoDuke Viral Vector Core (vía Roger Tsien)#268Véase Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
AAV5.hSyn.tdTomato (Control)Duke Viral Vector Core ControlVéase Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
Lágrimas artificiales (ungüento oftálmico)Covetrus70349
ATP Sal de magnesioFisher ScientificA9187
BetadineButler Schein38250
Cloruro de calcioFisher ScientificC1016
Cloruro de cesioFisher Scientific289329
Cesio hidróxido FisherScientific516988
Metanosulfonato de cesioFisher ScientificC1426
Cocaína HClCentro de suministro de drogas NIDA9041-001
CriostatoLeicaCM1950
D-glucosaSigma-AldrichG8270
DMSOFisher ScientificBP231-1
Controlador de temperatura de doble canalWarner InstrumentsTC-344C
EGTAFisher ScientificE3889
EtanolAlmacén de química de la Universidad de Pittsburgh200C5000
Tapones antipolvo de férulaThor LabsCAPLTapones antipolvo de plástico blanco para férulas de 1,25 mm
Manguitos de acoplamiento de férulas LentesdóricasF210-3011Sleeve_BR_1.25, bronce, 1.25 mm DI
Férulasde precisión Productosde fibra MM-FER2007C-2300Ø Férula cerámica LC/PC multimodo de 1,25 mm, & Oslash; 230 y mu; m tamaño del agujero
Fibra ópticaThor LabsFP200URT200 μ fibra multimodo de núcleo m (0,5 NA)
Junta rotativa de fibra ópticaPrizmatix(Pedido a Amazon)Conector FC-FC de 18 mm de diámetro para fibra
Herramienta de pelado de fibraThor LabsT12S21
Fluoroshield con DAPISigma-AldrichF6057
GentamicinaHenry Schein6913
GTP Sal de sodioFisher ScientificG8877
Jeringa Hamilton Hamilton8008510 μ Volumen L, calibre 26, 2 pulgadas, estilo de punta 3
Pistola de calorAllied Electronics972-6966250 V, 750-800 ° F
fibra de precisiónepoxi curable por calorPFP-353ND-8OZ
HeparinaHenry Schein55737
HEPESSigma-AldrichH3375
Ácido clorhídricoFisher Scientific219405490
IsofluranoHenry Schein29405
Ketamina HClHenry Schein55853La ketamina es una sustancia controlada y debe manejarse de acuerdo con las pautas institucionales
. sHenry Schein9846
Láser, controlador y acoplador de láser a fibraOEM Laser SystemsBL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0100 mW, 473 nm, láser de estado sólido bombeado por diodo (una opción)
L-glutatiónFisher ScientificG4251
LidocaínaButler Schein14583
Sensor de luzThor LabsPM100DConsola compacta de contador de energía con pantalla digital
Adhesivo instantáneo LoctiteGrainger5E207
Sulfatode magnesio Sigma-Aldrich203726
Amplificador de microelectrodos/adquisición de datosMolecular DevicesMULTICLAMP700B / Digidata 1440A
Bomba de microinyectorHarvard Apparatus70-4501Jeringa doble
MicromanipuladorSutter InstrumentsMPC-200/ROE-200
MicroscopioOlympusBX51WIMicroscopio vertical para electrofisiología
MicroscopioOlympusBX61VSMicroscopio epifluorescente de barrido con portaobjetos
N-metil-D-glucaminaSigma-AldrichM2004
Orthojet cemento dental, líquidoLang Dental1504BLKnegro
Orthojet cemento dental, polvoLang Dental1530BLKPolvo contemporáneo, negro
ParaformaldehídoSigma-AldrichP6148
Cables de conexiónThor LabsFP200ERTMultimodo, FT030 Tubo
PicrotoxinaFisher ScientificAC131210010
Disco de pulidoThor LabsD50FC
Almohadilla de pulidoThor LabsNRS9139" x 13"
Papel de pulidoThor LabsLFG5P5 μ grano m
Papel de pulidoThor LabsLFG3P3 μ grano m
Papel de pulirThor LabsLFG1P1 μ papel de pulido de grano m
Thor LabsLFG03P0.3 μ grano m
Cloruro de potasioSigma-AldrichP9333
Hidróxido de potasioFisher ScientificP5958
Metanosulfonato de potasioFisher Scientific83000
QX-314-ClAlomone LabsQ-150
Rimadyl (Carprofeno)Henry Schein24751
Autoadministración Chambers/SoftwareMed AssociatesMED-NP5L-D1
Bicarbonato de sodioSigma-AldrichS5761
Cloruro de sodioSigma-AldrichS7653
Hidróxido de sodioSigma-Aldrich1064980500
L-ascorbato de sodioSigma-AldrichA7631
Pentobarbital de sodioHenry Schein24352
Fosfato de sodioSigma-AldrichS9638
Fosfocreatina de sodioFisher ScientificP7936
Piruvato de sodioSigma-AldrichP2256
Tornillos de acero inoxidableWW Grainger  6GB25M2-0.40mm Tornillo de metal, Pan, Phillips, A2 Acero inoxidable, liso, 3 mm
de longitud Adaptador estereotámico para férulasThor LabsXCL
Marco estereotásticoStoelting51603
SacarosaSigma-AldrichS8501
Hilo de suturaFine Science Tools18020-50 Hilo deseda; Tamaño: 5/0, Diámetro: 0,12 mm
TEA-Cloruro FisherScientificT2265
ThioureaSigma-AldrichT8656
Vetbond Adhesivo tisularCovetrus001505
VibratomeLeicaVT1200S
XilacinaMayordomo Schein33198
Productos de

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Connors, N. J., Hoffman, R. S. Experimental treatments for cocaine toxicity: A difficult transition to the bedside. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 347 (2), 251-257 (2013).
  2. Makani, R., Pradhan, B., Shah, U., Parikh, T.

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