Se presenta un protocolo detallado para preparar la masarimicina de diamida bacteriostática, una sonda de molécula pequeña que inhibe el crecimiento de Bacillus subtilis y Streptococcus pneumoniae al dirigirse a la degradación de la pared celular. Su aplicación como sonda química está demostrada en ensayos de sinergia/antagonismo y estudios morfológicos con B. subtilis y S. pneumoniae.
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Artículo de método
Síntesis de masarimicina, un inhibidor de molécula pequeña del crecimiento bacteriano grampositivo
En este artículo
Resumen
Resumen
El peptidoglicano (PG) en la pared celular de las bacterias es una estructura macromolecular única que confiere forma y protección del entorno circundante. Un elemento central para comprender el crecimiento y la división celular es el conocimiento de cómo la degradación de PG influye en la biosíntesis y el ensamblaje de la pared celular. Recientemente, se ha reportado el etiquetado metabólico de PG a través de la introducción de azúcares o aminoácidos modificados. Si bien es posible el interrogatorio químico de pasos biosintéticos con inhibidores de moléculas pequeñas, las herramientas de biología química para estudiar la degradación de PG por autolisinas están subdesarrolladas. Las autolisinas bacterianas son una amplia clase de enzimas que están involucradas en la degradación estrechamente coordinada de PG. Aquí, se presenta un protocolo detallado para preparar una sonda de molécula pequeña, masarimicina, que es un inhibidor de la N-acetilglucosaminidasa LytG en Bacillus subtilis, y el metabolismo de la pared celular en Streptococcus pneumoniae. Se proporciona la preparación del inhibidor a través de la síntesis orgánica clásica y asistida por microondas. Se presenta su aplicabilidad como herramienta para estudiar la fisiología Gram-positiva en ensayos biológicos.
Introducción
Peptidoglicano (PG) es un polímero similar a una malla que delinea la forma y estructura celular en bacterias Gram-positivas y Gram-negativas 1,2. Este heteropolímero es una matriz de aminoazúcares reticulados por péptidos cortos 3,4,5,6 con una columna vertebral compuesta por residuos de ácido N-acetilglucosamina (GlcNAc) y ácido N-acetilmurámico (MurNAc) alternados β-(1,4) (Figura 1)1. Unido a la fracción C-3 lactyl de MurNAc es....
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Protocolo
1. Métodos generales
NOTA: Todos los compuestos se compraron a proveedores estándar y se utilizaron sin purificación adicional.
- Realizar cromatografía de capa fina (TLC) sobre una placa de aluminio precubierta con gel de sílice XG F254. Detectar manchas debajo de una lámpara UV, por inmersión en tinción de p-anisaldehído, o por exposición al vapor I2 .
- Registre todos los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) en un espectrómetro de 400 MHz.
NOTA: 1espectro de RMN H y 13de RMN C se hicieron referencia a picos de disolventes residuales. Las constantes d....
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Resultados
La masarimicina es un inhibidor bacteriostático de molécula pequeña de B. subtilis y S. pneumoniae y se ha demostrado que inhibe la GlcNAcase LytG de acción exo-acción en B. subtilis35,37 y se dirige a la pared celular en S. pneumoniae37. La masarimicina se puede preparar de manera eficiente mediante la síntesis orgánica clásica o asistida por microondas con rendimientos en el rango del 55% al 70%. La sí.......
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Discusión
La masarimicina es un único inhibidor bacteriostático micromolar del crecimiento de B. subtilis35 y S. pneumoniae37 . En B. subtilis, se ha demostrado que la masarimicina inhibe la GlcNAcase LytG35, mientras que no se ha identificado la diana molecular precisa en la pared celular de S. pneumoniae 37. La síntesis de masarimicina utilizando la síntesis orgánica clásica o el procedimiento de microondas .......
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Divulgaciones
Reid, C. W. tiene propiedad intelectual que involucra aplicaciones específicas de masarimicina.
Agradecimientos
La investigación fue apoyada por la Fundación Nacional de Ciencias bajo la subvención número 2009522. El análisis de RMN de masaromicina fue apoyado por el premio del programa de instrumentación de investigación principal de la Fundación Nacional de Ciencias bajo el número de subvención 1919644. Cualquier opinión, hallazgo y conclusión, o recomendación expresada en este material son las de los autores y no reflejan necesariamente los puntos de vista de la National Science Foundation.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ácido 2-yodobenzoico | SIGMA-ALDRICH | I7675-25G | Polvo corrosivo, irritante, de color amarillo claro a marrón anaranjado |
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 109827-4L | inflamable, irritante, incoloro |
| Acetonitrilo | SIGMA-ALDRICH | 34851-4L | inflamable, irritante, incoloro |
| Placas de sílice con respaldo de aluminio | Sorbtech | 4434126 | gel de sílice XG F254 sobre placas con respaldo de aluminio |
| cloroformo-d | SIGMA-ALDRICH | 151823-50G | solvente para RMN |
| Espectrómetro de masas compacto | Advion-Interchim | Advion CMS | espectrómetro de masas compacto equipado con fuente APCI y sonda de análisis de sólidos atmosféricos |
| Corning Costar 96 placas de fondo plano de pozos-estéril | fisher chemical | 07-200-90 | para ensayos de sinergia/antagonismo |
| cubreobjetos | fisher chemical | 12-547 | para microscopía |
| Ciclohexanocarboxaldehído | CHEM-IMPEX INT'L INC. | 24451 | líquido inflamable, irritante, incoloro a rosado |
| Isocianuro de ciclohexilo | SIGMA-ALDRICH | 133302-5G | irritante, líquido incoloro, olor extremadamente desagradable |
| Ciclohexilamina | SIGMA-ALDRICH | 240648-100ML | corrosivo, inflamable, irritante, líquido incoloro a menos que esté contaminado |
| Acetato de etilo | SIGMA-ALDRICH | 537446-4L | inflamable, irritante, incoloro |
| cartucho de sílice flash líquida (12g) | Advion-Interchim | PF-50SIHP-F0012 | paquete de columnas de sílice flash (12g) para la purificación de masarimycina |
| formaldehído | SIGMA-ALDRICH | F8775-25ML | agente fijador para microscopía |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H8651-25G | tampón para solución de fijación de microscopía |
| Hexano, mezcla de isómeros | SIGMA-ALDRICH | 178918-4L | perjudicial para el medio ambiente, inflamable, irritante, peligroso para la salud, líquido incoloro |
| Espectrómetro de masas compacto de alto rendimiento | Sonda | de análisis de sólidos atmosféricos (ASAP), baja resolución | |
| High Vac | eppendorf | Vacufuge plus | vacío asistido por la fuerza centrífuga y la temperatura |
| Ácido clorhídrico | SIGMA-ALDRICH | 258148-2.5L | corrosivo, irritante, incoloro |
| ácido clorhídrico | líquido SIGMA-ALDRICH | 320331-2.5L | |
| aceite de inmersión | fisher chemical | 12-365-19 | para microscopía |
| Yodo, cristales resublimados | Alfa Aesar | 41955 | perjudicial para el medio ambiente, irritante, peligro para la salud, gris oscuro/púrpura cristales |
| Mestre Mnova | MestreLab Research | software para el procesamiento de espectros de RMN | |
| Metanol | SIGMA-ALDRICH | 439193-4L | inflamable, tóxico, peligro para la salud, líquido incoloro |
| azul de metileno | SIGMA-ALDRICH | M9140-25G | Tinción microscópica para la tinción de paredes celulares |
| Placas de agar Meuller-Hinton + 5% de sangre de oveja | Fisher Química | B21176X | medios de crecimiento para Streptococcus pneumoniae |
| Caldo Meuller-Hinton | fisher chemical | DF0757-17-6 medio de | Streptococcus pneumoniae |
| fisher chemical | 22-310397 | para microscopía | |
| estación de laboratorio de síntesis por microondas | MILESTONE | START SYNTH | dispositivo que requiere la ventilación de una campana de gases, equipado con carrusel de síntesis |
| RMN SIGMA-ALDRICH | Z562769-5EA | Tubos de RMN de 5 mm 600 MHz | |
| Resonancia Magnética Nuclear (RMN) | Bruker | Ascend 400 | imán superconductor grande (400MHz) |
| Optocina | Fisher Químico | AAB21627MC | clorhidrato de etilhidrocupreína placas de |
| Petrie | Celltreat | 229695 | para la preparación de placas de agar para el crecimiento bacteriano |
| Microscopio de campo claro/contraste de fase Primo Star con cámara ERc5s | Zeiss | para estudios de morfología | |
| puriFlash | interchim | XS520plus | sistema de purificación por cromatografía flash |
| resazurin | SIGMA-ALDRICH | R7017-1G | para ensayos de sinergia/antagonismo |
| evaporador rotativo | Heidolph | Hei-VAP Value "The Collegiate" | evaporador de disolvente |
| bicarbonato de sodio | SIGMA-ALDRICH | S6014-500G | irritante, blanco polvo |
| Cloruro de sodio | fisher químico | S271-1 | cristalino, incoloro |
| Cloruro de sodio | SIGMA-ALDRICH | S5886-500G | para el crecimiento de B.subtilis y la preparación de medios LB |
| Sulfato de sodio | SIGMA-ALDRICH | 7985592-500G | anhidro, granular, |
| triptona | fisher químico | BP1421-500 | para el crecimiento de B.subtilis y preparación de medios LB |
| Whitney DG250 Workstation | Microbiology International | DG250 | estación de trabajo anaeróbica. Mezcla de gases anaeróbicos utilizada: 5% de hidrógeno, 10% de dióxido de carbono, extracto de levadura de nitrógeno de equilibrio |
| fisher chemical | BP1422-500 | para el crecimiento de B.subtilis y preparación de medios LB | |
| Zen Lite (azul) software | Zeiss | para la adquisición de micrografías |
Referencias
- Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Review. 32 (2), 149-167 (2008).
- Munita, J. M., Bayer, A. S., Arias, C. A. Evolving resistance among Gram-positive pathogens. Clinical Infectious Diseases. 61, suppl-2 48....
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Reimpresiones y permisos
