Summary
O presente protocolo fornece informações instrucionais para o uso do tromfo de tabaco Manduca sexta na pesquisa canabinoide. O método descrito aqui inclui todos os suprimentos e protocolos necessários para monitorar alterações fisiológicas e comportamentais do modelo de insetos em resposta ao tratamento do canabidiol (CBD).
Abstract
Com maior atenção aos canabinóides na medicina, vários organismos modelo de mamíferos têm sido usados para elucidar suas funções farmacêuticas desconhecidas. No entanto, muitas dificuldades permanecem na pesquisa de mamíferos, o que requer o desenvolvimento de organismos modelo não-mamíferos para a pesquisa canabinoide. Os autores sugerem o chifre de tabaco Manduca sexta como um novo sistema de modelo de insetos. Este protocolo fornece informações sobre a preparação da dieta artificial com quantidades variadas de canabidiol (CBD), criação de um ambiente de cultivo e monitoramento de suas mudanças fisiológicas e comportamentais em resposta ao tratamento cbd. Resumidamente, ao receber ovos de vermes, os ovos foram permitidos de 1 a 3 dias a 25 °C em um ciclo claro-escuro de 12:12 para eclodir antes de serem distribuídos aleatoriamente no controle (dieta artificial à base de germes de trigo; AD), veículo (AD + 0,1% óleo de triglicerídeo de cadeia média; Óleo mct) e grupos de tratamento (AD + 0,1% MCT + 1 mM ou 2 mM de CBD). Uma vez que a mídia foi preparada, 1ª larva instar foram colocadas individualmente em um tubo de ensaio de 50 mL com um espeto de madeira, e então o tubo de ensaio foi coberto com um pano de queijo. As medições foram tomadas em intervalos de dois dias para respostas fisiológicas e comportamentais à administração do CBD. Este simples procedimento de cultivo permite que os pesquisadores testem grandes espécimes em um determinado experimento. Além disso, os ciclos de vida relativamente curtos permitem que os pesquisadores estudem o impacto dos tratamentos canabinoides ao longo de várias gerações de uma população homogênea, permitindo que os dados apoiem um design experimental em organismos de modelos de mamíferos mais altos.
Introduction
Nos últimos anos, a atenção pública tem sido centrada nos canabinoides devido ao seu potencial terapêutico, incluindo o tratamento da epilepsia1, doença de Parkinson2, esclerose múltipla3 e várias formas de câncer4,5,6 com canabidiol (CBD). Como a Cannabis é legalizada como uma mercadoria agrícola na Lei de Melhoria Agrícola de 2018, a Lei Pública 115-334 (a Lei da Fazenda 2018), a Cannabis e seus derivados canabinóides nas indústrias alimentícia, cosmética e farmacêutica aumentaram exponencialmente. Além disso, isolados de grau clínico de canabinoides únicos e misturas canabinoides foram testados com sucesso em indivíduos humanos7, linhas celulares5,8 e diversos sistemas de modelo animal9,10.
Um ensaio clínico seria ideal para validar a eficácia e os efeitos adversos dos canabinoides em uma doença específica. No entanto, existem inúmeros desafios em ensaios clínicos, incluindo aprovação ética/IRB, recrutamento e retenção dos sujeitos11. Para superar esses obstáculos, várias linhas de células humanas foram usadas porque as linhas celulares derivadas do homem são econômicas, fáceis de manusear, podem contornar as questões éticas e fornecer resultados consistentes e reprodutíveis, pois as linhas celulares são uma "população pura de células que não têm contaminação cruzada de outras células e produtos químicos"12.
Alves et al. (2021)13 testaram CBD de forma dependente de dose nos trophoblastos placentários, que são células especializadas da placenta que desempenham um papel essencial na implantação e interação com o útero materno deciditizado14. Seus resultados mostraram que o CBD causou perda de viabilidade celular, interrupção da progressão do ciclo celular e indução da apoptose. Essas observações demonstram os potenciais impactos negativos do uso da Cannabis por mulheres grávidas13. Da mesma forma, uma série de linhas celulares também foram utilizadas para examinar os efeitos farmacológicos do CBD em doenças humanas, em particular, várias formas de câncer. Os estudos in vitro demonstraram com sucesso efeitos anticu câncer em células cancerígenas pancreáticas15, mama8 e colorretal16. No entanto, embora esteja amplamente disponível e fácil de manusear, linhas celulares específicas como HeLa, HEK293 são propensas a alterações genéticas e fenotípicas devido a alterações em suas condições de crescimento ou manuseio17.
Na pesquisa da Cannabis, vários sistemas de modelos animais, que vão desde pequenos animais como mouse18, cobaia-pig19 e coelho19 até animais de grande porte como canino20, leitão21, macaco22, cavalo23, têm sido usados para explorar efeitos terapêuticos desconhecidos. Os camundongos têm sido o sistema de modelo animal mais preferido para a pesquisa canabinoide devido à sua semelhança anatômica, fisiológica e genética com os humanos24. Mais significativamente, os camundongos têm receptores CB1/2 em seu sistema nervoso, que estão presentes em humanos. Eles também têm um ciclo de vida mais curto do que os seres humanos, com manutenção mais fácil e recursos genéticos abundantes, tornando muito mais fácil monitorar os efeitos dos canabinoides durante todo um ciclo de vida. O sistema mamífero é amplamente utilizado e demonstrou com sucesso que o CBD alivia distúrbios convulsivos1, transtorno de estresse pós-traumático9, úlceras bucais25 e sintomas semelhantes a demência10. O modelo de camundongos também possibilitou um estudo de interação social de indivíduos dentro de uma comunidade que é extremamente difícil em animais de grande porte e humanos26.
Apesar de todas as vantagens do sistema de modelo animal, ele ainda é caro e requer cuidados intensivos durante a administração de medicamentos e coleta de dados. Além disso, há escrutínio do uso de camundongos em pesquisas devido à irreprodutividade e má recapitulação das condições humanas devido a limitações no design experimental e rigor27.
Com a crescente demanda por estudos médicos/pré-clínicos de canabinóides, é necessário um sistema modelo não-mamífero. Modelos invertebrados tradicionalmente conferiam benefícios distintos sobre modelos de vertebrados. Os benefícios significativos incluem a facilidade e o baixo custo de criar muitos espécimes e permitir que os pesquisadores monitorem múltiplas gerações de populações geneticamente homogêneas28. Um estudo recente comprovou que a mosca-das-frutas, Drosophila melanogaster, é um sistema eficaz de modelo de insetos para investigar funções farmacológicas de canabinóides na modulação dos comportamentos alimentares29. Entre os sistemas de modelos de insetos, os autores se concentraram na minhoca do tabaco, manduca sexta, também conhecida como mariposa de esfinge carolina ou mariposa falcão, como um novo sistema modelo de insetos para pesquisa canabinoide.
Manduca sexta pertence à família de Sphingidae. O inseto é a praga vegetal mais comum no sul dos Estados Unidos, onde se alimentam de plantas solanáceas. O modelo de insetos tem uma longa história em pesquisas em estudos de fisiologia de insetos, bioquímica, neurobiologia e interação medicamentosa. O portfólio de pesquisa de Manduca sexta inclui uma sequência de genomas, permitindo uma compreensão em nível molecular dos processos celulares essenciais30. Outro benefício crucial deste sistema modelo é o seu grande tamanho, atingindo mais de 100 mm de comprimento e 10 g de peso nos 18-25 dias de desenvolvimento larval. O tamanho grande permite que os pesquisadores monitorem facilmente as mudanças morfológicas e comportamentais em tempo real em resposta ao tratamento do CBD. Além disso, devido ao tamanho, as respostas eletrofisiológicas foram examinadas com o sistema nervoso abdominal, incluindo gânglios dissecados das larvas sem configurações de microscópio de alta resolução. O recurso único permite que os pesquisadores investiguem prontamente respostas agudas e de longo prazo aos canabinoides administrados.
Apesar de tal versatilidade, M. sexta só recentemente foi explorado por sua adequação como modelo experimental para estudos de Cannabis e canabinoides. Em 2019, os autores utilizaram pela primeira vez o sistema modelo de insetos para abordar a hipótese de que a Cannabis evoluiu para produzir canabidiol para se proteger de herbívoros de insetos30,31. O resultado mostrou claramente que as plantas exploraram o CBD como um impedimento alimentar e inibiram o crescimento da lagarta m. sexta inseto de pragas, além de causar aumento da mortalidade31. O estudo também demonstrou os efeitos de resgate do CBD para larvas de etanol intoxicados, identificando o potencial efeito veicular do etanol como portador do CBD. Como mostrado, o sistema modelo de insetos investigou efetivamente os efeitos terapêuticos dos canabinóides dentro de 3-4 semanas com menos mão-de-obra e custos do que outros sistemas animais. Embora o modelo de insetos carece de receptores canabinoides (ou seja, sem receptores CB1/2), o sistema modelo fornece uma ferramenta valiosa para entender os papéis farmacológicos dos canabinóides através de uma maneira canabinoide independente do receptor.
Os autores deste estudo já trabalharam com a minhoca de tabaco como um sistema modelo para pesquisas canabinoides31. Após cuidadosa consideração dos benefícios e riscos do uso de M. sexta, fornecemos um método que envolve o cuidado adequado e a preparação da dieta para ensaios pré-clínicos que permitem oportunidades para futuros usos laboratoriais pré-clínicos.
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Protocol
1. Preparação de minhoca e tratamento de canabidiol
- Obter 150-200 M viável. sexta ovos e dietas artificiais à base de germes de trigo (ver Tabela de Materiais).
- Coloque os ovos de minhoca em uma placa de Petri de poliestireno com uma camada de dieta artificial baseada em germes de trigo (AD) e transfira os ovos para uma câmara de criação de insetos (ver Tabela de Materiais) mantida a 25 °C com 40%-60% de umidade relativa.
- Deixe os ovos de múmbriga de tabaco por 1-3 dias para eclodir dentro da câmara de criação de insetos mantida a 25 °C com 40%-60% de umidade relativa.
- Prepare a solução de estoque de canabidiol (CBD) (200 mM) adicionando 1,26 g de >98% de pureza O CBD isolou em 20 mL de EtOH (200 à prova) ou 100% de óleo de triglicerídeos de cadeia média (MCT) (ver Tabela de Materiais).
NOTA: O isolado do CBD é sensível à luz, por isso manuseie ao escuro. - Adicione 5 mL e 10 mL da solução de estoque cbd de 200 mM aos 1.000 g de AD para trazer as concentrações finais das dietas 1 mM e 2 mM de CBD, respectivamente.
NOTA: Certifique-se de que a solução de estoque de dieta e CBD esteja bem misturada até formar uma mistura completamente homogênea. Misture o AD contendo estoque de CBD em um saco plástico por pelo menos 45 minutos à mão.
ATENÇÃO: O misturador de café ou qualquer outro moedor de metal parecia ser ineficaz. - Dispense 20 g das três mídias, controle (AD), veículo (AD + 0,1% de óleo EtOH ou MCT) e CBD contendo mídia (AD + 0,1% de óleo EtOH ou MCT + 1 mM/2 mM de CBD) para a parte inferior do tubo de 50 mL.
- Distribua aleatoriamente 1ª larva instar (~2 mm de comprimento) individualmente em um tubo de ensaio de 50 mL e cubra com uma tampa perfurada ou pano de queijo (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Coloque o tubo de cabeça para baixo e cresça insetos em uma câmara de criação de insetos mantida 25 °C com 40%-60% de umidade relativa. - Plante-os dentro de uma câmara de criação de insetos (ver Tabela de Materiais) mantida a 25 °C com um ciclo claro/escuro de 12 horas.
2. M. sexta crescimento larval, consumo de dieta e medidas de mortalidade
- Meça o crescimento larval (ou seja, tamanho e peso) com um equilíbrio analítico e mortalidade em intervalos de 2 dias após ser transferido para recipientes individuais até que a pupação seja reconhecida como a coloração marrom escura de uma camada de exocutíscal endurecida.
- Registre a massa inicial (em gramas) de cada grupo de larvas antes de introduzir as larvas em suas respectivas dietas e subtraia a massa das larvas em cada medição a partir da massa inicial para determinar ganhos de massa entre os estágios de desenvolvimento das larvas até que as larvas completem o estágio de pupação.
- Regisso número de dias entre as etapas instar de desenvolvimento para entender diferenças no prazo de desenvolvimento entre os estágios de crescimento das larvas até a pupação em cada dieta.
NOTA: Raspe a matéria fecal do recipiente para evitar qualquer contaminação do molde. Colete a matéria para testes futuros dependentes de propósitos de experimento (por exemplo, cálculo da taxa de acumulação de CBD, perfil microbiano). É importante manusear cuidadosamente o inseto durante os períodos frágeis de apólise ou ecdísis. Ao retirar as larvas de um recipiente, pegue delicadamente o corpo principal do inseto com uma ponta plana e fórceps largos e não force a remover a camada externa da pele quando um inseto está em processo de derramamento.
- Meça o consumo de dieta31 pesando a perda de dieta do recipiente entre 1ª larva instar e pupação. Registre os gramas iniciais da dieta no início do experimento e subtraia a quantidade inicial da quantidade restante da dieta quando as larvas entrassem na fase completa de pupação.
NOTA: A matéria fecal deve ser excluída da medição da dieta. A matéria fecal e outros detritos (ou seja, galpões de pele) podem ser facilmente removidos da mídia colocando o recipiente de cabeça para baixo. - Para medições de mobilidade, permita que o inseto submetido aclimata o ambiente da câmara por pelo menos 5 minutos e rastreie as distâncias31 que três grupos de 5º instar insetos (80-100 mm de comprimento) viajaram usando uma câmara automatizada e informatizada de condicionamento do medo (ver Tabela de Materiais).
- Analise a resposta de mobilidade31 através de vídeo gravado 60 quadros/s por 5 minutos usando um software de detecção de movimento (ver Tabela de Materiais) que gera um índice de movimento.
3. Análise estatística
- Analise as diferenças no crescimento larval (ou seja, tamanho e peso) e o índice de movimento por ANOVA unidirecional com o pós-teste de Tukey32.
- Use o teste de log-rank (Mantel-Cox)33 para comparações de curvas de sobrevivência.
NOTA: Todas as análises estatísticas foram realizadas por meio de software de análise estatística (ver Tabela de Materiais).
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Representative Results
Manduca sexta como um sistema modelo para examinar a toxicidade dos canabinóides
A Figura 1 retrata os principais componentes do experimento CBD usando o múmbrinho de tabaco Manduca sexta. Um grande número de insetos (>20) foram criados individualmente a 25 °C em um 12 h:12 h = luz: ciclo escuro. O tamanho, o peso e a mortalidade dos insetos foram medidos em intervalos de 2 dias para monitorar respostas de curto e longo prazo após tratamento de alta dose de CBD (2 mM).
A Figura 2 mostra os efeitos adversos do CBD no crescimento e desenvolvimento do inseto. Os insetos criados em uma dieta artificial (DA) apresentaram o melhor desempenho de crescimento. O controle do veículo que utilizou óleo de triglicerídeo de cadeia média (MCT) de 0,1% como agente dissolvido para o isolante CBD também mostrou crescimento normal sem efeitos prejudiciais. No entanto, uma alta dose de CBD (2 mM) induziu a perda de peso (Figura 2C) e levou a uma taxa de mortalidade maior do que as dos grupos de controle e veículos (Figura 2D).
No dia 24, o tamanho médio das larvas alimentadas em AD foi de 63,9 mm (n = 20-22). No entanto, o tamanho das larvas criadas em AD contendo 2 mM de CBD foi de 50,7 mm, o que foi ~21% menor do que as larvas cultivadas em AD (linha vermelha na Figura 2C)31. No dia 24, o peso médio da larva criada em DP foi de 6,5 g, 2,2 vezes maior que o das larvas criadas em DP com 2 mM de CBD (n = 12-16, p < 0,00001)31. Notavelmente, a alta dose de CBD (2 mM) aumentou significativamente a taxa de mortalidade até 40%, enquanto os grupos de controle e veículos apresentaram apenas uma taxa de mortalidade de 20% (Figura 2D)31. Os resultados indicaram que a alta dose de CBD (2 mM) na dieta é prejudicial ao desenvolvimento de insetos e se correlaciona com o aumento da mortalidade.
Manduca sexta como um sistema modelo para explorar funções terapêuticas desconhecidas de canabinoides
A Figura 2 mostrou que o sistema do modelo de insetos monitora efetivamente quaisquer efeitos prejudiciais do CBD monitorando suas alterações morfológicas e fisiológicas. O resultado preliminar indicou que >1% de etanol (EtOH) está negativamente relacionado ao seu crescimento, mobilidade, consumo de dieta e taxa de sobrevivência. Para examinar se o CBD melhora a mobilidade e o comportamento alimentar dos insetos nas larvas M. sexta intoxicadas pelo EtOH, a quantidade total de dieta consumida pelos insetos e a distância que viajaram por 10 minutos foram medidas a partir de insetos cultivados em três condições de alimentação (AD + 1% EtOH e AD + 1% EtOH + 1 mM CBD). A Figura 3A mostra que M. sexta larva criada em AD contendo 1 mM de CBD consumiu pelo menos 3,1 vezes mais massa dietética do que aquelas criadas na dieta etoh-adicionada31. No entanto, o consumo alimentar dos insetos criados em 2 mM de mídia adicionada ao CBD não foi significativamente diferente dos de larvas criadas em dietas somente etoh (p > 0,05)31.
A mobilidade larval também foi rastreada para examinar se o CBD afetou sua mobilidade quando intoxicado com EtOH. O índice móvel é apresentado como o percentual (%) do congelamento. Figura 3B compara o índice móvel de M. sexta larva criada em condições diferentes. Os resultados mostram que 1% das larvas tratadas com EtOH não afetaram a mobilidade (p > 0,05). A administração de 1 mM CBD também não afetou a mobilidade (p > 0,05)31. Os tratamentos de 2% etoh revelaram-se letais para m. sexta larvas; portanto, nenhum índice de mobilidade foi registrado. Com a adição da alta dose de CBD (2 mM) em AD contendo 2% de EtOH, a mobilidade permaneceu baixa (80% de congelamento)31.
Figura 1: O processo resumido do uso de minhocas de tabaco Manduca sexta lagartas no estudo canabidiol. (A) Ovos de minhoca eclodiram em um recipiente grande separado com uma camada de dieta artificial. (B) Uma seringa foi usada para encher o recipiente para evitar que qualquer dieta grude nas laterais dos recipientes. (C) Uma 2ª minhoca de tabaco instar em um tubo de ensaio de 50 mL com pano de queijo. (D) Uma terceira minhoca de tabaco instar. (E) Comprimento de múmbrinho (mm) e peso (g) foram medidos em escala. (F) 5ª minhoca de tabaco instar que sofre ecdysis e pronta para a pupação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Efeitos do canabidiol (CBD) sobre o crescimento e mortalidade da minhoca de tabaco Manduca sexta. (A) Lagartas de minhoca de tabaco em 5º, 3º instar e filhotes precoces. O tamanho (B), peso (C) e mortalidade (D) de M. sexta quando alimentado com dieta artificial (AD), AD + 0,1% de triglicerídeos de cadeia média (MCT) e AD + 0,1% de MCT + 2 mM de CBD. Para análises estatísticas sobre o crescimento e a taxa de sobrevivência de insetos, foram utilizados um ANOVA unidirecional com o teste de múltiplas comparações de Tukey (n = 20-22, p < 0,05) e teste de Mantel-Cox (n = 20-22, p < 0,05) respectivamente. A figura é adaptada do Reference31. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Os efeitos do Canabidiol (CBD) no comportamento e mobilidade da alimentação de insetos. (A) Consumo diet de lagartas de múcula de tabaco criadas em dieta artificial (AD), AD + 1-2% de etanol (EtOH) e AD + 1-2% de EtOH + 1-2mM de CBD (ANOVA unidirecional, comparação múltipla de Tukey em p < 0,05). (B) Mobilidade de insetos. A mobilidade é retratada como congelamento %. indica p < 0,01. A figura é adaptada do Reference31. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O estudo de alimentação demonstrou que altas doses de CBD (2 mM) inibiram o crescimento do inseto e aumentaram a mortalidade31. O modelo de insetos também mostrou sensibilidade ao etanol; no entanto, o CBD efetivamente desintoxicou a toxicidade do etanol, aumentando sua taxa de sobrevivência, consumo de dieta e comportamentos de busca de alimentos para níveis semelhantes ao grupo controle (Figura 3A,B)31. O sistema de modelo de insetos descrito é composto por três passos críticos: (1) garantir que os ovos de M. sexta sejam eclodidos uniformemente em tamanho e tempo, (2) preparando a mídia de crescimento que são homogeneamente misturadas com canabinoides a uma concentração direcionada, e (3) manter a mídia de crescimento livre de contaminação fúngica, mantendo o nível ideal de umidade em 40%-60%. O sistema de modelo de insetos nos permitiu abordar a questão da pesquisa no prazo de 25 dias, desde a preparação da mídia até a coleta e interpretação dos dados. Mais importante, o sistema de insetos produziu resultados consistentes de grandes espécimes.
Para garantir o sucesso das larvas M. sexta cultivadas, é essencial manter a umidade relativa do ar entre 40%-60% dentro do recipiente. Se um recipiente não conseguir segurar a alta umidade, uma dieta artificial contendo os canabinoides será dessecada rapidamente, causando o término precoce do experimento devido à morte dos insetos. No entanto, em um sistema fechado, a alta umidade fornece uma condição ideal para o surto fúngico, que é difícil de erradicar. Os autores sugerem o uso de uma tampa perfurada ou pano de queijo para fornecer circulação de ar suficiente, minimizando a perda de água da mídia. Em um ambiente natural, as lagartas preferem se alimentar do lado abaxial de uma folha onde a umidade é maior, apresentando menos trichomes do que a área de superfície da folha34. Assim, colocar um recipiente de cabeça para baixo foi excepcionalmente útil ao fornecer uma área de refúgio ou uma vara de madeira rastejante. Isso também ajuda a remover a matéria fecal da área de mídia e facilita a coleta dos resíduos para outros ensaios.
Como os receptores canabinóides estão ausentes em invertabrates35, a múmen de tabaco M. sexta pode não ser adequada para estudos terapêuticos mediados pelo sistema endocanabinóide. No entanto, com os inúmeros benefícios demonstrados em nosso estudo piloto, o inseto deve ser considerado um novo sistema modelo para investigar as funções farmacológicas dos canabinoides, particularmente estudos envolvendo farmacocinéticas não-cb mediadas por receptores. O ciclo de vida relativamente curto de M. sexta permite que os pesquisadores entendam os impactos de uma dieta contendo canabinoides ao longo de várias gerações, permitindo um design experimental em organismos de modelos de mamíferos mais altos.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo Instituto de Pesquisa da Cannabis da Universidade do Estado do Colorado-Pueblo e do Ministério da Ciência e TIC (2021-DD-UP-0379) e pela cidade de Chuncheon (CânhamO P&D e industrialização, 2020-2021).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analytic balance | Mettler Instrument Corp. | AE100S | |
| Cannabidiol isolate (>99.4%) | Lilu's Garden | ||
| Cheesecloth | VWR INTERNATIONAL | 470150-438 | |
| Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes | VWR | 89093-192 | |
| Ethyl Alcohol, 200 Proof | Sigma-Aldrich | EX0276-1 | |
| Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
| Insect rearing chamber | Darwin Chambers | INR034 | |
| Medium chain triglycerides (MCT) oil | Walmart | ||
| Motion detection software (Actimetrics) | Coulbourn Instruments | ||
| Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm) | VWR INTERNATIONAL | 688161 | |
| Tobacco hormworm artificial diet | Carolina Biological Supply Company | Item # 143908 | Ready-To-Use-Hornworm-Diet |
| Tobacco hormworm eggs | Carolina Biological Supply Company | Item # 143880 | Unit of 30-50 |
References
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