El presente protocolo describe un método para inducir lesiones específicas de tejido y altamente reproducibles en larvas de pez cebra utilizando un sistema de lesiones láser combinado con una plataforma microfluídica automatizada para el manejo de larvas.
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Artículo de método
Lesiones controladas semiautomatizadas inducidas por láser para estudiar la regeneración de la médula espinal en larvas de pez cebra
En este artículo
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Resumen
Resumen
Las larvas de pez cebra poseen un sistema nervioso central (SNC) completamente funcional con una alta capacidad regenerativa solo unos días después de la fertilización. Esto hace que este modelo animal sea muy útil para estudiar la lesión y regeneración de la médula espinal. El protocolo estándar para inducir tales lesiones es transectar la parte dorsal del tronco manualmente. Sin embargo, esta técnica requiere un entrenamiento extenso y daña tejidos adicionales. Se desarrolló un protocolo para lesiones inducidas por láser para eludir estas limitaciones, lo que permite una alta reproducibilidad e integridad de la transección de la médula espinal en muchos animales y entre diferentes sesiones, incluso para un operador no entrenado. Además, el daño tisular se limita principalmente a la propia médula espinal, lo que reduce los efectos de confusión de la lesión de diferentes tejidos, por ejemplo, piel, músculo y SNC. Además, las hemi-lesiones de la médula espinal son posibles. La preservación mejorada de la integridad del tejido después de una lesión por láser facilita las disecciones adicionales necesarias para análisis adicionales, como la electrofisiología. Por lo tanto, este método ofrece un control preciso de la extensión de la lesión que es inalcanzable manualmente. Esto permite nuevos paradigmas experimentales en este poderoso modelo en el futuro.
Introducción
A diferencia de los mamíferos, el pez cebra (Danio rerio) puede reparar su sistema nervioso central (SNC) después de una lesión1. El uso de larvas de pez cebra como modelo para la regeneración de la médula espinal es relativamente reciente. Ha demostrado ser valioso investigar los mecanismos celulares y moleculares subyacentes a la reparación2. Esto se debe a la facilidad de manipulación, el ciclo experimental corto (nuevas larvas cada semana), la transparencia óptica de los tejidos y el pequeño tamaño de las larvas, ideal para la microscopía de fluorescencia in vivo .
En el ....
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Protocolo
Todos los estudios en animales se llevaron a cabo con la aprobación del Ministerio del Interior del Reino Unido y de acuerdo con sus regulaciones, bajo la licencia de proyecto PP8160052. El proyecto fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Edimburgo. Para los análisis experimentales, se utilizaron larvas de pez cebra de hasta 5 días de edad de ambos sexos de las siguientes líneas transgénicas disponibles: Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP), Tg(Xla.Tubb:DsRed), Tg(betaactina:utrofina-mCherry), Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) y Tg(mnx1:gfp) (ver Archivo Complementario 1 sobre la generación de las líneas de pez cebra tran....
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Resultados
Validación de la transección de la médula espinal
Se realizaron investigaciones estructurales y funcionales para evaluar si el protocolo permite una transección completa de la médula espinal.
En primer lugar, para verificar que la pérdida de fluorescencia en el sitio de la lesión se debió a daño en el tejido neuronal y no al fotoblanqueo de fluorescencia de la iluminación láser, se realizó inmunotinción utilizando un anticuerpo contra la tubulina acetilada (ver Tabl.......
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Discusión
Existe una necesidad urgente de una comprensión más profunda de los procesos en juego durante la regeneración en el pez cebra. Este modelo animal ofrece muchos beneficios para la investigación biomédica, en particular para las lesiones de la médula espinal1. La mayoría de los estudios involucran lesiones manuales que requieren un operador bien entrenado e inducen daño multisular. Aquí se presenta un protocolo de lesiones con láser, que permite controlar las características de la lesión y reducir e.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por el BBSRC (BB/S0001778/1). CR está financiado por el Programa de Becas de Investigación Médica Princess Royal TENOVUS Scotland. Agradecemos a David Greenald (CRH, Universidad de Edimburgo) y Katy Reid (CDBS, Universidad de Edimburgo) por el amable regalo de peces transgénicos (Ver Archivo Complementario). Agradecemos a Daniel Soong (CRH, Universidad de Edimburgo) por el amable acceso al disco giratorio 3i confocal.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Software | |||
| Microscope software Zen Blue 2.0 | Carl Zeiss | ||
| ImageJ/FIJI | |||
| Studio Code | Microsoft | ||
| Microscopio y accesorios | |||
| ApoTome Microscopio | Carl Zeiss | ||
| C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) Lente de inmersión | Carl Zeiss | ||
| doble AxioCam 506 m Cámaras CCD | Carl Zeiss | ||
| Microscopio confocal de barrido láser LSM880 | Carl Zeiss | ||
| Módulo de disco giratorio CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Microscopio verticalAxio Examiner D1 | Carl Zeiss | ||
| Láser UV | Micropoint | ||
| VAST BioImager | Union Biometrica | ||
| Labware | |||
| 90 mm Placa de Petri | Thermo-Fisher | 101R20 | |
| Placa de 96 pocillos | Corning | 3841 | |
| Chemicals | |||
| Click-It EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10637 | |
| aminobenzoico-ácido-etil metil éster (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| feniltiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Anticuerpos | |||
| Burro anti-pollo Alexa Fluor 488 | Jackson | 703-545-155 | |
| Burro anti-ratón Cy3 | Jackson | 715-165-150 | |
| Anti-GFP de ratón | Abcam | AB13970 | |
| Anticuerpo acetilado anti-tubulina de ratón | Sigma | T6793 | |
| Transgénico líneas de pez cebra | |||
| Tg(beta-actina:utrophin-mCherry) | N/A | Establecido por David Greenhald, Universidad de Edimburgo | |
| Tg(mnx1:gfp) | N/A | Descrito por primera vez en [Flanagan-Steet et al. 2005] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed) | N/A | Descrito por primera vez en [Peri y Nusslein-Volhard 2008] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed; mpeg1:GFP) | N/A | Establecido por Katy Reid, Universidad de Edimburgo | |
| Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) | N/A | Establecido por David Greenhald, Universidad de Edimburgo |
Referencias
- Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Ohnmacht, J., et al. Spinal motor ne....
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
Posted by JoVE Editors on 4/07/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. The title was updated.
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Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
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Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
