Purificación de los canales potenciales del receptor transitorio de Drosophila endógeno

Resumen

Basado en el mecanismo de ensamblaje del complejo de proteínas INAD, en este protocolo, se desarrolló una estrategia modificada de purificación de afinidad más competencia para purificar el canal endógeno Drosophila TRP.

Resumen

La fototransducción de Drosophila es una de las vías de señalización acopladas a proteínas G más rápidas conocidas. Para asegurar la especificidad y eficiencia de esta cascada, el canal catiónico permeable al calcio (Ca²⁺), el potencial del receptor transitorio (TRP), se une estrechamente a la proteína del andamio, inactivación-no-post-potencial D (INAD), y forma un gran complejo proteico de señalización con proteína quinasa C específica del ojo (ePKC) y potencial del receptor de fosfolipasa Cβ/No A (PLCβ/NORPA). Sin embargo, las propiedades bioquímicas del canal TRP de Drosophila siguen sin estar claras. Basado en el mecanismo de ensamblaje del complejo de proteínas INAD, se desarrolló una estrategia modificada de purificación de afinidad más competencia para purificar el canal endógeno TRP. Primero, el fragmento NORPA 863-1095 marcado con histidina purificada (His) se unió a cuentas de Ni y se usó como cebo para derribar el complejo endógeno de proteína INAD de los homogeneizados de la cabeza de Drosophila. Luego, se agregó un fragmento excesivo de glutatión S-transferasa purificada (GST) marcado con TRP 1261-1275 a las cuentas de Ni para competir con el canal TRP. Finalmente, el canal TRP en el sobrenadante se separó del péptido TRP 1261-1275 excesivo mediante cromatografía de exclusión de tamaño. Este método permite estudiar el mecanismo de cierre del canal TRP de Drosophila desde ángulos bioquímicos y estructurales. Las propiedades electrofisiología de los canales TRP de Drosophila purificados también se pueden medir en el futuro.

Introducción

La fototransducción es un proceso en el que los fotones absorbidos se convierten en códigos eléctricos de las neuronas. Transmite exclusivamente opsinas y la siguiente cascada de señalización acoplada a proteína g tanto en vertebrados como en invertebrados. En Drosophila, mediante el uso de sus cinco dominios PDZ, la inactivación de la proteína de andamio-no-después del potencial D (INAD) organiza un complejo de señalización supramolecular, que consiste en un canal de potencial de receptor transitorio (TRP), potencial de receptor de fosfolipasa Cβ/No A (PLCβ/NORPA) y proteína quinasa C específica del ojo (ePKC)¹. La formación de este c....

Protocolo

1. Purificación de fragmentos de TRP etiquetados con GST y NORPA con su etiqueta

1. Purificar el fragmento TRP 1261-1275 etiquetado con GST
   1. Transformar el plásmido pGEX 4T-1 TRP 1261-1275¹⁰ en células de Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) utilizando el método de transformación de choque térmico CaCl₂ ²¹. Inocular una sola colonia en 10 mL de Luria Bertani (LB) mediana y crecer durante la noche a 37 °C. Luego, amplifique los 10 ml de cultivo de siembra en 1 L de LB medio a 37 ° C.
   2. Después de que la densidad óptica (OD₆₀₀) de las células alcance ....

Resultados

En este artículo, se demuestra un método de purificación de proteínas para purificar el canal endógeno de Drosophila TRP (Figura 1).

En primer lugar, se aplica la expresión y purificación de proteínas recombinantes para obtener las proteínas de cebo y de la competencia. Luego, un fragmento de TRP 1261-1275 marcado con GST se expresa en células de E. coli BL21 (DE3) en medio LB y se purifica utilizando perlas de glutatión y una columna de exclusió.......

Discusión

INAD, que contiene cinco dominios PDZ, es el organizador central de la maquinaria de fototransducción Drosophila. Estudios previos demostraron que INAD PDZ3 se une a la cola terminal C del canal TRP con una especificidad exquisita (K_D = 0,3 μM)¹⁸. El tándem INAD PDZ45 interactúa con el fragmento NORPA 863-1095 con una afinidad de unión extremadamente alta (K_D = 30 nM). Estos hallazgos proporcionan una base bioquímica sólida para diseñar la estrategia de purificación .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cepas bacterianas
BL21(DE3) Células competentes	Novagen	69450	Sobreexpresión
proteínasModelos experimentales
D.melanogaster: W1118 cepa	Bloomington Drosophila Stock Center	BDSC:3605	Drosophila < / preparación > cabeza
Material< / fuerte>
20/30/40 malla tamices de acero inoxidable	Jiufeng empresa de malla metálica	GB / T6003.1	Drosophila < / preparación > cabeza
30% Acrilamida-N, N y prime;-Metilenebisacrilamida (29: 1)	Preparación	A3291	SDS-PAGE
Persulfato de amonio	Invitrogen	HC2005	SDS-PAGE Preparación de gel
Cóctel Inhibidor de la proteasa	Roche	05892953001	Inhibidor de la proteasa
Coomassie azul brillante R-250	Sangon Biotech	A100472-0025	SDS-PAGE tinción en gel
DL-Ditiothreitol (DTT)	Sangon Biotech	A620058-0100	Preparación
de tampón de columna de exclusión por tamañoSal disódica de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)	Sangon Biotech	A500838-0500	Preparación de tampón de columna de exclusión por tamaño
Glycine	Sangon Biotech	A610235-0005	SDS-PAGE Preparación de tampón
Glutatión Sepharose 4 Fast Flow Cytiva		17513202	Cromatografía de afinidad
Imidazol	Sangon Biotech	A500529-0001	Tampón de elución preparación para la columna de
Ni Isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG)	Sangon Biotech	A600168-0025	Inducción de la sobreexpresión de proteínas
LB Caldo en polvo	Sangon Biotech	A507002-0250	E.coli. cultivo celular
L-Glutatión reducido (GSH)	Sigma-aldrich	G4251-100G	Preparación de tampón de elución para perlas
de glutatiónPerlas de Ni-Sepharose excel	Cytiva 17371202		Cromatografía de afinidad
N-Dodecil beta-D-maltósido (DDM)	Sangon Biotech	A610424-001	Detergente para la purificación de proteínas
N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamina (TEMED)	Sigma-aldrich	T9281-100ML	SDS-PAGE preparación de gel
PBS	Sangon Biotech	E607008-0500	Tampón de homogeneización para células PMSF de E.coli.
	Lablead	P0754-25G	Inhibidor de la proteasa Marcador
proteínas preteñido	Thermo Scientific	26619/26616	Escalera de proteínas preteñida
Columna de exclusión de tamaño (grado de preparación)	Cytiva	28989336	HiLoad 26/60 Superdex 200 Columna de
exclusión de tamaño (grado analítico)	Cytiva	29091596	Superose 6 Increase Columna 10/300 GL
Cloruro de sodio	Sangon Biotech	A501218-0001	Preparación de tampón de purificación de proteínas
Dodecil sulfato de sodio (SDS)	Sangon Biotech	A500228-0001	SDS-PAGE Preparación de gel/tampón
Tris base	Sigma-aldrich	T1503-10KG Preparación de	tampón de purificación de proteínas
Centrifugado de ultrafiltración columna	Millipore	UFC901096/801096	Concentración
proteínasEquipment
Analytical Balance	DENVER	APX-60	Metage of Drosophila head
Centrífuga refrigerada de sobremesa de alta velocidad para tubos de centrifugación cónicos de 15 ml y 50 ml	Eppendorf	5810R	Concentración de proteínas
Centrífuga refrigerada de alta velocidad de sobremesa Tubos de centrifugación de 1,5 ml	Eppendorf	5417R	Centrifugación de lisado de cabeza de Drosophila después de la homogeneización
Columna de flujo por gravedad vacía (diámetro interior = 1,0 cm)	Bio-Rad	738-0015	Purificación de proteínas TRP
Columna de flujo por gravedad vacía (diámetro interior = 2,5 cm)	Bio-Rad	738-0017	Purificación de cebos y proteínas de la competencia a partir de E.coli.
Gel Sistema	de documentación Bio-Rad	Universal Hood II Gel Doc XR Imaging	SDS-PAGE
Centrífuga refrigerada de alta velocidad	Beckman coulter	Avanti J-26 XP	Centrifugación de células E.coli./lisado celular
Homogeneizador de alta presión	UNION-BIOTECH	UH-05	Homogeneización de células E.coli.
Tanque de nitrógeno líquido	Taylor-Wharton	CX-100	Drosophila head Preparación Sistema de
purificación de proteínas	Cytiva	AKTA purificador Purificador	proteínas
(-80° C)	Thermo	900GP	em>Drosophila head
Preparación Espectrofotómetro	MAPADA	UV-1200	OD600 medición de células E.coli.
Espectrofotómetro	Thermo Scientific	NanoDrop 2000c	Determinación de la concentración de proteínas
Ultracentrífuga	Beckman Coulter	Optima XPN-100	Ultracentrifugación

de de gel de plomo de de de <