Se describe una metodología coherente de imágenes de dispersión Raman para visualizar y cuantificar compuestos farmacéuticos dentro de la piel. Este artículo describe la preparación del tejido de la piel (humano y ratón) y la aplicación de formulación tópica, la adquisición de imágenes para cuantificar los perfiles de concentración espaciotemporal y el análisis farmacocinético preliminar para evaluar la administración tópica de fármacos.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Visualización y cuantificación de compuestos farmacéuticos dentro de la piel utilizando imágenes de dispersión Raman coherente
En este artículo
Resumen
Resumen
La farmacocinética cutánea (cPK) después de la aplicación de formulación tópica ha sido un área de investigación de particular interés para que los científicos reguladores y de desarrollo de fármacos comprendan mecánicamente la biodisponibilidad tópica (BA). Las técnicas semiinvasivas, como el pelado con cinta, la microdiálisis dérmica o la microperfusión dérmica de flujo abierto, cuantifican la cPK a macroescala. Si bien estas técnicas han proporcionado un vasto conocimiento de cPK, la comunidad carece de una comprensión mecanicista de la penetración y permeación de ingredientes farmacéuticos activos (API) a nivel celular.
Un enfoque no invasivo para abordar la cPK a microescala es la imagen de dispersión Raman (CRI) coherente, que se dirige selectivamente a las vibraciones moleculares intrínsecas sin la necesidad de etiquetas extrínsecas o modificación química. CRI tiene dos métodos principales: la dispersión Raman anti-Stokes (CARS) coherente y la dispersión Raman estimulada (SRS), que permiten la cuantificación sensible y selectiva de API o ingredientes inactivos. CARS se utiliza típicamente para derivar información estructural de la piel o visualizar el contraste químico. Por el contrario, la señal SRS, que es lineal con la concentración molecular, se utiliza para cuantificar las API o los ingredientes inactivos dentro de las estratificaciones de la piel.
Aunque el tejido de ratón se ha utilizado comúnmente para cPK con CRI, la BA tópica y la bioequivalencia (BE) deben evaluarse en última instancia en el tejido humano antes de la aprobación regulatoria. Este trabajo presenta una metodología para preparar e visualizar la piel ex vivo para ser utilizada en estudios cuantitativos farmacocinéticos de CRI en la evaluación de BA y BE tópicos. Esta metodología permite una cuantificación de API confiable y reproducible dentro de la piel humana y de ratón a lo largo del tiempo. Se cuantifican las concentraciones dentro de los compartimentos ricos en lípidos y pobres en lípidos, así como la concentración total de API a lo largo del tiempo; estos se utilizan para estimaciones de BA a micro y macroescala y, potencialmente, BE.
Introducción
Las metodologías para evaluar la cPK después de la aplicación de medicamentos tópicos se han expandido de los estudios clásicos de pruebas de permeación in vitro (IVPT) 1,2,3,4,5 y la extracción con cinta 6,7,8 a metodologías adicionales como la microperfusión de flujo abierto o la microdiálisis dérmica 9,10,11
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
El uso de tejido de oreja de ratón desnudo fue aprobado por el Comité de Uso y Cuidado de Animales Institucionales del Hospital General de Massachusetts (IACUC), mientras que el uso de tejido de piel humana fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Hospital General de Massachusetts (IRB). De acuerdo con los protocolos de la IACUC, se obtuvieron ratones recién sacrificados de colaboradores con colonias de ratones desnudos. El tejido humano se obtuvo de procedimientos electivos de abdominoplastia en el Hospital General de Massachusetts a través de un protocolo aprobado. Además, los tipos específicos de tejido distintos de la piel abdominal se adquirieron a....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Las imágenes se consideran exitosas si el tejido no se ha movido significativamente en dirección axial (<10 μm) o lateral al finalizar el experimento (Figura 4). Esta es una indicación inmediata si la medición de SRS para la API de interés no es representativa de la profundidad inicial, para la cual la cuantificación es específica de la capa. Esto se mitiga mediante la obtención de imágenes de pilas z para cada posición XY de interés, con la compensación de la resolución temporal. Si se u.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
La evaluación de BA/BE tópico es un área de investigación que requiere un enfoque multifacético, ya que ningún método único puede caracterizar completamente la cPK in vivo . Este protocolo presenta una metodología para la evaluación del BA/BE de un fármaco tópico basada en imágenes Raman coherentes. Uno de los primeros puntos que podrían pasarse por alto es qué tan delgadas deben ser las muestras de piel, especialmente para las imágenes SRS de transmisión cuantitativa. Si la piel es demasiado gruesa (es deci.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
CLE es un inventor de patentes para microscopía CARS que han sido licenciadas a múltiples fabricantes de microscopios. Todos los demás autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer al Dr. Fotis Iliopoulos y Daniel Greenfield del Grupo Evans por su discusión y revisión de este manuscrito. Además, los autores desean agradecer el apoyo de LEO Pharma. La figura 2 se creó con BioRender.com.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tissue Preparation | |||
| Autoclavable | Biohazard Bags FisherBrand | 22-044562 | Como se menciona en el texto: biohazard bags https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562& searchType=RAPID& matchedCatNo=22044562 |
| Tampones de cultivo celular: Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 1x | Corning | MT21030CV | Como se menciona en el texto: PBS https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv& searchType= RAPID& emparejadoCatNo=21-030-cv |
| Bisturíes Desechables | Exel International | 14-840-00 | Como se menciona en el texto: bisturí https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true |
| Alta Precisión 45&grados; Pinzas/Pinzas de Ángulo de Punta Ancha | Fisherbrand | 12-000-132 | Como se menciona en el texto: forceps https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword= |
| Kimwipes Limpiadores de Tareas Delicadas, 1 Capa | Kimberly-Clark Professional Kimtech Science | 06-666 | Como se menciona en el texto: limpiador de tareas https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666 |
| Parafilm M Película de envoltura de laboratorio | Bemis | 13-374-12 | Como se menciona en el texto: parafilm https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412 |
| Placa de Petri (35 mm x 10 mm) | Fisherbrand | FB0875711YZ | Como se menciona en el texto: placa de Petri pequeña https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true |
| Placa de Petri (60 mm x 15 mm) | Fisherbrand | FB0875713A | Como se menciona en el texto: placa de Petri grande https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true |
| Tijeras quirúrgicas | Roboz | NC9411473 | Como se menciona en el texto: tijeras https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC& searchType=RAPID& emparejadoCatNo=RS-5915SC |
| fuerte>Láser/microscopio | |||
| 650/60 nm Filtro de paso de banda única BrightLine | Semrock | Como se menciona en el texto: Filtro CARS - Vibraciones CH2 (filtro de 645 nm/60 nm) | |
| Caja de control IX2-UCB | Olympus | Como se menciona en el texto: Caja de control | |
| D700/30m | Chroma | Como se menciona en el texto: Filtro CARS - banda deuterada https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m | |
| DeepSee Insight | Spectra-Physics | Como se menciona en el texto: Laser https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser | |
| Consola digital portátil de potencia óptica y medidor | de energía ThorLabs | PM100D | Como se menciona en el texto: medidor de potencia https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
| Fluoview Software | Olympus | Como se menciona en el texto: Software de control de microscopio | |
| Portaobjetos de microscopio esmerilados | FisherBrand | Como se menciona en el texto: portaobjetos de microscopio https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446 | |
| FV1000 | Olympus | Como se menciona en el texto: Microscopio | |
| Cámara de incubación | Tokai Hit | GM-800 | Como se menciona en el texto: cámara de incubación |
| Sensor de potencia de fotodiodo de esfera integradora | ThorLabs | S142C | Como se menciona en el texto: fotodiodo https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
| Fuente de alimentación FV31-PSU | Olympus | Como se menciona en el texto: Fuente de alimentación | |
| Precision 4063, 80MHz Generador de funciones de doble canal | BK Precision | Como se menciona en el texto: generador de funciones | |
| ProScan – Automatización de microscopios de precisión | Instrumentos | Como se menciona en el texto: controlador de etapa https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation | |
| Espaciadores de imágenes SecureSeal | Grace Biolabs | 654004 | Como se menciona en el texto: espaciador https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/ |
| Kit de detección SRS APE | Como se menciona en el texto: Detector SRS | ||
| UPLSAPO 20X NA:0.75 | Olympus | Como se menciona en el texto: 20X Objetivo https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/ | |
| Lípidos/Imágenes de fármacos | |||
| Plato de 35 mm, n.º 0 Cubreobjetos sin recubrimiento, 14 mm Diámetro de vidrio | MatTek Corporation | NC9711297 | Como se menciona en el texto: Plato con fondo de vidrio https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297 |
| Aplicadores con punta de algodón | FisherBrand | Como se menciona en el texto: Aplicador con punta de algodón | |
| Distriman Pipeta de desplazamiento postivo | Gilson | Como se menciona en el texto: Pipeta de desplazamiento positivo https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword= | |
| Distriman Puntas de pipeta de desplazamiento positivo | Gilson | Como se menciona en el texto: Consejos para pipeta https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true | |
| Análisis de datos | |||
| FIJI | Código abierto | Como se menciona en el texto: FIJI/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/ | |
| Jupyter-Lab | abierto | Como se menciona en el texto: JupyterLab https://jupyter.org/ | |
| Rstudio | Código abierto | Como se menciona en el texto: Rstudio https://www.rstudio.com/ |
Referencias
- Finnin, B., Walters, K. A., Franz, T. J. In vitro skin permeation methodology. In Transdermal and topical drug delivery: principles and methodology. Transdermal and topical drug delivery: principles and practice. Benson, H. E., Watkinson, A. C. , John Wiley & Sons. Hoboken NJ USA. 85-108 (2012).
- Shin, S. H., et al.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
