Evaluación funcional de la quinesina-7 CENP-E en espermatocitos mediante inhibición in vivo , inmunofluorescencia y citometría de flujo

Resumen

Este artículo informa una inhibición in vivo de CENP-E a través de cirugía abdominal e inyección testicular de GSK923295, un modelo valioso para la división meiótica masculina. Usando los ensayos de inmunofluorescencia, citometría de flujo y microscopía electrónica de transmisión, mostramos que la inhibición de CENP-E da como resultado una desalineación cromosómica e inestabilidad del genoma en espermatocitos de ratón.

Resumen

En eucariotas, la meiosis es esencial para la estabilidad del genoma y la diversidad genética en la reproducción sexual. Los análisis experimentales de los espermatocitos en los testículos son críticos para las investigaciones del ensamblaje del huso y la segregación cromosómica en la división meiótica masculina. El espermatocito de ratón es un modelo ideal para estudios mecanicistas de meiosis, sin embargo, faltan métodos efectivos para el análisis de espermatocitos. En este artículo, se informa un método práctico y eficiente para la inhibición in vivo de kinesina-7 CENP-E en espermatocitos de ratón. Se presenta un procedimiento detallado para la inyección testicular de un inhibidor específico GSK923295 a través de cirugía abdominal en ratones de 3 semanas de edad. Además, aquí se describen una serie de protocolos para la recolección y fijación de tejidos, tinción de hematoxilina-eosina, inmunofluorescencia, citometría de flujo y microscopía electrónica de transmisión. Aquí presentamos un modelo de inhibición in vivo mediante cirugía abdominal e inyección testicular, que podría ser una técnica potente para estudiar la meiosis masculina. También demostramos que la inhibición de CENP-E da como resultado una desalineación cromosómica y detención en metafase en los espermatocitos primarios durante la meiosis I. Nuestro método de inhibición in vivo facilitará los estudios mecanicistas de la meiosis, servirá como un método útil para las modificaciones genéticas de las líneas germinales masculinas y arrojará luz sobre futuras aplicaciones clínicas.

Introducción

La meiosis es uno de los eventos más importantes, altamente rígidos y conservados evolutivamente en los organismos eucariotas, y es esencial para la gametogénesis, la reproducción sexual, la integridad del genoma y la diversidad genética ^1,2,3. En los mamíferos, las células germinales experimentan dos divisiones celulares sucesivas, meiosis I y II, después de una sola ronda de replicación del ADN. A diferencia de las cromátidas hermanas en la mitosis, los cromosomas homólogos duplicados se emparejan y segregan en dos células hijas durante la meiosis I ....

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Fujian (número de protocolo SYXK 2016-0007). Todos los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con las directrices pertinentes del Cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (publicaciones de los NIH número 8023, revisadas en 1978).

1. Construcción de modelos de ratón de inhibición de CENP-E mediados por GSK923295

1. Esterilizar los instrumentos quirúrgicos a 121 °C durante 30 min. Irradiar el banco de trabajo ultralimpio quirúrgico con u....

Resultados

Hemos construido con éxito un modelo de inhibición in vivo de CENP-E de testículos de ratón mediante cirugía abdominal e inyección testicular de GSK923295¹⁹. Los pasos técnicos clave de este método se muestran en la Figura 1. Después de la inyección testicular de GSK923295 durante 4 días, los testículos se cosecharon para análisis adicionales. En el grupo control, la onda espermatogénica en los túbulos seminíferos fue regular y organizada (

Discusión

En este estudio, hemos establecido un modelo de inhibición in vivo de CENP-E de testículos de ratón utilizando la cirugía abdominal y la microinyección de GSK923295. La cirugía abdominal y el método de inyección testicular utilizados en este estudio tienen las siguientes ventajas. En primer lugar, no se limita a la edad de los ratones. Los experimentadores pueden realizar la inyección testicular en una etapa temprana, por ejemplo, en ratones de 3 semanas o más jóvenes. En segundo lugar, GSK923295 tiene un efecto.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,25% Tripsina-EDTA	Gibco 25200056
1 ml Jeringa	Varias marcas comerciales disponibles		Estéril.
Tubo de centrífuga de 1,5 mL	Axygen	MCT-150-C
Tubo de centrífuga de 50 mL	Corning	430828
placa de Petri de 6 cm	Corning	430166
etanol al 95%	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10009164
anticuerpo policlonal de tubulina de conejo	Beyotime	AF0001	Para ensayos de inmunofluorescencia. Úselo a 1:100.
anticuerpo monoclonal anti-histona H3 (fosfo S10)	Abcam	ab267372	para ensayos de inmunofluorescencia. Úselo a 1:100.
anticuerpo policlonal anti-TUBA4A de conejo	Sangon Biotech	D110022	Para ensayos de inmunofluorescencia. Úselo a 1:100.
Anticuerpo monoclonal anti-SYCP3 para conejo	Abcam	ab175191	Para ensayos de inmunofluorescencia. Úselo a 1:100.
Portaobjetos de microscopio de adhesión	CITOTEST 188105
Alexa fluor 488 marcado con flúor anticuerpo anti-conejo	Beyotime	A0423	Sencodary. Úselo a 1:500.
Sulfato de aluminio y potasio	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10001060
Etanol anhidro	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	100092690
Medio de montaje antidecoloración	Beyotime	P0131	Evite el fotobleching de señales fluorescentes.
BD FACS Canto II BD	Biosciences	FACS Canto II
Albúmina sérica bovina	Sinopharm Reactivo químico Co., Ltd
	Eppendorf	5424BK745380
Hidrato de cloral	Sinopharm Reactivo químico Co., Ltd	80037516
Ácido cítrico	Shanghai Reactivo de experimento Co., Ltd	122670
Colagenasa	Sangon Biotech	A004194-0100
Cubreobjetos	CITOTEST	10212020C	20 × 20 mm. Espesor 0,13-0,16 mm.
DAPI	Beyotime	C1006
Tinte de tinte	Varias marcas comerciales disponibles	91347802
Eosina Y, soluble en alcohol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	71014460
Ether	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10009318
Formaldehído - solución acuosa	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10010018
GSK923295	MedChemExpress	HY-10299
Hematoxilina, anhidro	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	71020784
ICR ratón	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd
Image J software	Institutos Nacionales de Salud	https://imagej.nih.gov/ij/	Análisis de imágenes fluorescentes.
Ultramicrótomo Leica	Leica
EM UC-7 ultramicrótomo	Leica	EM UC7
Modfit MFLT32	Verity Software House		Para el análisis de los resultados de la citometría de flujo.
Esmalte de uñas	Varias marcas comerciales disponibles
Goma neutra	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10004160
Nikon Ti-S2 Microscopio	Nikon	Ti-S2
Ácido pícrico	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	J60807
Rheodyne	Sangon Biotech	F519160-0001	10 μ l rheodyne
Parafina en rodajas	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	69019461
Yodato de sodio	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	80117214
Instrumentos quirúrgicos	Varias marcas comerciales disponibles		para la cirugía abdominal. Esterilizar a 121 ° C, 20 min.
Microscopio electrónico de transmisión	FEI	Tecnai G2
Citrato trisódico dihidratado	Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd	173970
Triton X-100	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	30188928	Diluir en PBS estéril para hacer una solución de trabajo al 0,25%.
Tween 20	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	30189328	diluir en PBS estéril para hacer una solución de trabajo al 0,1%.
Paraformaldehído	Sinopharm Reactivo Químico Co., Ltd	80096618
Xileno	Sinopharm Reactivo Químico Co., Ltd	10023418