Aislamiento y caracterización del ficobilisoma intacto en cianobacterias

Resumen

El protocolo actual detalla el aislamiento de los ficobilisomas de las cianobacterias por centrifugación a través de un gradiente de densidad de sacarosa discontinuo. Las fracciones de ficobilisomas intactos se confirman mediante el espectro de emisión fluorescente de 77K y el análisis SDS-PAGE. Las fracciones de ficobilisoma resultantes son adecuadas para la tinción negativa de TEM y el análisis de espectrometría de masas.

Resumen

En las cianobacterias, el ficobilisoma es un complejo de proteína de antena vital que cosecha luz y transfiere energía al fotosistema I y II para la fotoquímica. El estudio de la estructura y composición del ficobilisoma es de gran interés para los científicos porque revela la evolución y divergencia de la fotosíntesis en las cianobacterias. Este protocolo proporciona un método detallado y optimizado para romper las células de cianobacterias a bajo costo por un batidor de cuentas de manera eficiente. El ficobilisoma intacto se puede aislar del extracto celular mediante ultracentrifugación por gradiente de sacarosa. Este método ha demostrado ser adecuado tanto para cianobacterias modelo como no modelo con diferentes tipos de células. También se proporciona un procedimiento paso a paso para confirmar la integridad y la propiedad de las ficobiliproteínas mediante espectroscopia de fluorescencia 77K y SDS-PAGE teñido por sulfato de zinc y azul coomassie. El ficobilisoma aislado también puede ser sometido a análisis estructurales y compositivos adicionales. En general, este protocolo proporciona una guía de inicio útil que permite a los investigadores que no están familiarizados con las cianobacterias aislar y caracterizar rápidamente el ficobilisoma intacto.

Introducción

El ficobilisoma (PBS) es un enorme complejo pigmentario-proteico soluble en agua que se une al lado citoplasmático de los fotosistemas en las membranas tilacoides de las ^{cianobacterias1}. El PBS se compone principalmente de ficobiliproteínas coloreadas y proteínas enlazadoras ^incoloras1,2. Las ficobiliproteínas se pueden dividir en cuatro grupos principales: ficoeritrina, ficoeritrocianina, ficocianina y aloficocianina3. Los cuatro grupos principales absorben diferentes longitudes de onda de energía lumínica en el rango de 490-650 nm, que las clorofilas absorbiero....

Protocolo

La Synechocystis sp. PCC 6803, la cepa modelo tolerante a la glucosa, se obtuvo del Dr. Chu, Hsiu-An en la Academia Sinica, Taiwán. Leptolyngbya sp. JSC-1, el filamentoso no modelo, se obtuvo del Dr. Donald A. Bryant en la Universidad Estatal de Pensilvania, EE. UU.

1. Cultivo celular y cosecha

1. Inocular células Syn6803 o JSC-1 utilizando un bucle de inoculación metálico en un matraz cónico de 100 mL que contiene 50 mL de medio B-HEPES28. Cultive las células a 30 °C bajo fotones de 50 μmol ^{m-2 s-1} (LED de luz blanca) en 1% (v/v) de _CO2 con a....

Resultados

Las células Syn6803 y JSC-1 se cultivaron en matraces cónicos con agitación constante en medio B-HEPES a 30 °C, bajo una luz blanca LED (50 fotones μmol ^m-2s-1) en una cámara de crecimiento llena de 1% (v/v) de _CO2. En la fase de crecimiento exponencial (_OD750 = ~0.5), las células se subcultivaron en medio fresco con una densidad óptica final _OD750 = ~0.2. Después de alcanzar la fase de crecimiento exponencial tardío (_OD750 = 0,6-0,8), los cultivos fueron .......

Discusión

Este protocolo describe un método simple y estándar para aislar PBS intacto en dos tipos de cianobacterias, el modelo unicelular Syn6803 y el filamentoso no modelo JSC-1. Los pasos críticos del protocolo son la homogeneización celular y la ultracentrifugación en un gradiente de densidad discontinuo de sacarosa. En general, la interrupción de las células filamentosas es más complicada que las unicelulares. El aumento de la cantidad del material de partida (el peso húmedo del pellet celular) y la repetición del batido de p.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Perlas de vidrio de 0,1 mm	BioSpec	11079101	para extracción de PBS
Tubo de centridura de 13 mL	Ultracentrifugación	Hitachi	13PA
Tubo de centridura de 40 mL	Ultracentrifugación	Hitachi	40PA
Ácido acético	Merck	8.1875.2500	para el medio
			de tinción B-HEPES de Coomassie BlueUn medio cianobacteriano modificado a partir del medio BG-11
Azul brillante R-250	Sigma	B-0149	para la tinción con azul de Coomassie Azul
bromofenol	Wako Industrias químicas puras	2-291	tampón de carga de proteínas
Balanza electrónica	Radwag	WLC 2/A2/C/2	para la medición del peso húmedo de pellets de
células Espectrofotómetro de fluorescencia	Hitachi	F-7000	Espectrofotómetro
Glycerol	BioShop	Gly001.500	tampón
de carga de proteínas centrífuga refrigerada de alta velocidad	Hitachi	CR22N	para intercambio de tampón
Leptolyngbya sp. JSC-1			del Dr. Donald A. Bryant en la Universidad Estatal de Pensilvania, EE. UU.
Accesorio de medición de baja temperatura	Hitachi	5J0-0112	El accesorio incluye un contenedor Dewar transparente para espectroscopía de fluorescencia de 77K.
Metanol	Merck	1.07018,2511	para tinción Coomassie Blue
Microcentrífuga	Thermo Fisher	Pico 21	para extracción de PBS
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	Modelo 607	para extracción de PBS
Fosfato de potasio dibásico	PanReac AppliChem	121512.121	para extracción de PBS
Fosfato de potasio monobásico	PanReac AppliChem	141509.121	para extracción de PBS
Frasco con tapón de rosca	BioSpec	10832	para extracción de PBS
SmartView Pro Imager	Major Science	UVCI-2300	para la detección de señales de tinción de Znic
Dodecil sulfato de sodio	Tampón de carga de proteínas	Zymeset	BSD101
Sacarosa	Zymeset	BSU101	para aislamiento
de PBSSynechocystis sp. Cepa tolerante a la glucosa PCC 6803			del Dr. Chu, Hsiu-An en Academia Sinica, Taiwán
Tampón de carga de proteínas	Tris	BioShop	TRS 011.1
Triton X-100	BioShop	TRX 506.500	para extracción de PBS
Filtro centrífugo de membrana Ultra 10 K	Millipore	UFC901024	para el intercambio
de tamponesFiltro centrífugo de membrana Ultra 3 K	Millipore	UFC500324	para el intercambio de tampón
Ultracentrífuga	Hitachi	CP80WX	ultracentrifugación
Espectrofotómetro UV/Vis	Agilent	Cary 60	Espectrofotómetro
Sulfato de zinc	PanReac AppliChem	131787.121	para tinción de Znic
β-Mercaptoetanol	BioBasic	Tampón de carga de proteínas	MB0338

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