Caracterización de células endoteliales de crecimiento sanguíneo (BOEC) de sangre periférica porcina

Abstract

El endotelio es una estructura dinámica integrada que desempeña un papel importante en muchas funciones fisiológicas como la angiogénesis, la hemostasia, la inflamación y la homeostasis. El endotelio también juega un papel importante en fisiopatologías como la aterosclerosis, la hipertensión y la diabetes. Las células endoteliales forman el revestimiento interno de los vasos sanguíneos y linfáticos y muestran heterogeneidad en estructura y función. Varios grupos han evaluado la funcionalidad de las células endoteliales derivadas de la sangre periférica humana con un enfoque en las células progenitoras endoteliales derivadas de células madre hematopoyéticas o células endoteliales maduras de crecimiento sanguíneo (o células formadoras de colonias endoteliales). Estas células proporcionan un recurso autólogo para la terapéutica y el modelado de enfermedades. Las células xenogénicas pueden proporcionar una fuente alternativa de terapéutica debido a su disponibilidad y homogeneidad logradas mediante el uso de animales genéticamente similares criados en condiciones similares. Por lo tanto, se ha presentado un protocolo robusto para el aislamiento y la expansión de células endoteliales de crecimiento sanguíneo altamente proliferativo de sangre periférica porcina. Estas células se pueden utilizar para numerosas aplicaciones, como ingeniería de tejidos cardiovasculares, terapia celular, modelado de enfermedades, detección de fármacos, estudio de la biología de las células endoteliales y cocultivos in vitro para investigar las respuestas inflamatorias y de coagulación en el xenotrasplante.

Introduction

El endotelio es una estructura altamente compleja y dinámica y un componente vital de la pared vascular. Recubre la superficie interna de los vasos sanguíneos para proporcionar una interfaz física entre la sangre circulante y los tejidos circundantes. Se sabe que esta estructura heterogénea realiza diversas funciones como angiogénesis, inflamación, vasoregulación y hemostasia 1,2,3,4. Las células endoteliales de la vena umbilical humana son un tipo de célula ampliamente estudiado para evaluar la funcionalidad de las células endoteliales. Sin embargo, la variabilidad del lote específica del paciente, el fenotipo inconsistente y la eficiencia mínima de división sugieren la necesidad de determinar una fuente celular que pueda mejorar todas estas características⁵.

Obtener una población homogénea de células endoteliales primarias puede ser técnicamente difícil, y las células endoteliales primarias no poseen una alta capacidad proliferativa⁶. Por lo tanto, para estudiar la regeneración vascular y evaluar los procesos fisiopatológicos, varios grupos han tratado de obtener y evaluar diferentes tipos de células endoteliales derivadas de sangre periférica, por ejemplo, células progenitoras endoteliales (CPE) o células endoteliales de crecimiento sanguíneo (BOEC)6,7,8,9 . Las EPC tempranas en forma de huso se originan a partir de células madre hematopoyéticas (HSC) y tienen una potencia de crecimiento limitada y una capacidad angiogénica limitada para producir células endoteliales maduras. Además, se parecen mucho a los monocitos inflamatorios. Además, su capacidad para diferenciarse aún más en células endoteliales funcionales, proliferantes y maduras sigue siendo discutible 6,7,9,10. El cultivo continuo de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) puede dar lugar a una población secundaria de células conocidas como EPC de crecimiento tardío, BOEC o células formadoras de colonias endoteliales (ECFC)6,7,9,10. Medina et al. en 2018, reconocieron las limitaciones de los EPC, la ambigüedad de su nomenclatura, junto con una falta general de concordancia con muchos tipos de células distintas agrupadas continuamente bajo EPC¹¹. En contraste, los BOEC han sido reconocidos por su papel en la reparación vascular, la salud y la enfermedad, y la terapia celular. El estudio adicional y el uso terapéutico de estas células se basarán en protocolos para derivar consistentemente estos tipos de células a partir de células progenitoras circulantes.

Las células primarias como los BOEC pueden ser utilizadas como sustituto para obtener células endoteliales maduras altamente proliferativas⁶. Los BOEC son fenotípicamente distintos de los EPC tempranos y exhiben características endoteliales típicas, como la morfología de los adoquines y la expresión de uniones adherentes y caveolas¹². El perfil genético de Hebbel et ^al.13,14,15 encontró que los BOEC o ECFC son las verdaderas células endoteliales, ya que promueven la formación de vasos microvasculares y grandes. Así, los BOEC pueden ser utilizados como herramienta para evaluar procesos fisiopatológicos y variación genética¹⁶. También se consideran una excelente fuente celular para la terapia celular para la regeneración vascular¹⁷. Por lo tanto, un protocolo estandarizado para derivar consistentemente estas células altamente proliferativas es esencial.

Mientras que los BOEC proporcionan una herramienta poderosa para estudiar la variación fisiopatológica y genética humana, una fuente más homogénea de BOEC puede proporcionar resultados experimentales y terapéuticos más sólidos y confiables. Se puede lograr una homogeneidad superior utilizando fuentes celulares xenogénicas derivadas de animales genéticamente similares criados en condiciones similares¹⁸. Si bien las fuentes de células xenogénicas son propensas a provocar una respuesta inmune del huésped, se están desarrollando estrategias de inmunomodulación con el objetivo de generar animales y productos animales inmunocompatibles, incluidas las células. Los cerdos, en particular, son una fuente abundante de sangre periférica y se usan comúnmente para estudiar dispositivos médicos y otras terapias debido a las similitudes anatómicas y fisiológicas con los humanos. Por lo tanto, este estudio refina el protocolo para el aislamiento y la expansión de BOEC altamente proliferativos de sangre periférica porcina. El protocolo detallado a continuación es un método sencillo y confiable para obtener una gran cantidad de BOEC a partir de un volumen relativamente pequeño de sangre. Los cultivos se pueden expandir a través de varios pasajes para generar millones de células a partir de una sola muestra de sangre.

Protocol

Todos los estudios en animales fueron aprobados por los respectivos Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Colegio Médico de Wisconsin y Mayo Clinic.

NOTA: En este estudio, se utilizaron cerdos domésticos cruzados Yorkshire/Landrace/Duroc (Sus domesticus), machos y hembras, 40-80 kg, 3-6 meses de edad.

1. Recolección de sangre periférica porcina

1. Preparar materiales.
   1. Diluir la solución de heparina a 100 U/ml en solución salina estéril.
   2. Agregue 3-4 ml de solución de heparina a cada uno de los dos tubos cónicos de 50 ml y dos jeringas de 60 ml.
   3. Extraiga la solución de heparina sin diluir (1,000 U/ml) en un tubo de extensión.
   4. Conecte una aguja de 19 G a un extremo del tubo de extensión lleno de heparina y una jeringa de 60 ml que contenga heparina al otro extremo.
2. Anestesiar a un cerdo de acuerdo con las políticas institucionales
   1. Administrar una inyección IM de atropina (0,05 mg/kg), tiletamina/zolazepam (2-5 mg/kg) y xilazina (2 mg/kg) para inducir la anestesia.
      NOTA: la anestesia adecuada se logra una vez que el animal está inconsciente y los músculos mandibulares no son rígidos.
   2. Coloque al animal en posición supina y coloque toallas enrolladas en ambos lados para proporcionar estabilidad.
   3. Aplique un ungüento oftálmico en los ojos para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia.
   4. Proporcione soporte térmico durante la anestesia, incluidas mantas, almohadillas térmicas y / o mesa de procedimiento calentada.
3. Limpie el área de la ingle femoral con la solución exfoliante de betadina.
4. Perfore la vena o arteria femoral con la aguja de 19 G y lentamente (~1-2 ml/s) extraiga 50 ml de sangre en la jeringa.
   NOTA: Dibujar demasiado rápido puede dañar las celdas.
5. Dejando la aguja en su lugar, doblar inmediatamente el tubo de extensión y desconectar la jeringa de 60 ml
6. Transfiera lentamente la sangre a un tubo cónico de 50 ml que contenga heparina.
7. Tapa herméticamente el tubo cónico de 50 ml, invierte suavemente unas cuantas veces para mezclar y colócalo en hielo.
8. Conecte la jeringa restante de 60 ml que contiene heparina al tubo de extensión, desenrosque el tubo de extensión y extraiga lentamente 50 ml adicionales de sangre en la jeringa.
9. Retire inmediatamente la aguja de la arteria o vena y extraiga lentamente la sangre restante del tubo de extensión a la jeringa.
10. Desconecte la jeringa de 60 ml del tubo de extensión y transfiera lentamente la sangre al tubo cónico restante de 50 ml que contiene heparina.
11. Tapa herméticamente el tubo cónico de 50 ml, invierte suavemente unas cuantas veces para mezclar y colócalo en hielo.
12. Aplique hemostasia de presión en el área de la ingle femoral del cerdo.
13. Recuperar el cerdo de acuerdo con las políticas institucionales. Monitoree continuamente al animal hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal y regrese al área regular de alojamiento / perrera.

2. Aislamiento de células mononucleares

1. Diluir la sangre 1:1 con solución salina tamponada con fosfato (PBS) en cuatro tubos cónicos de 50 ml.
   NOTA: Este trabajo debe realizarse en una campana de cultivo celular utilizando una técnica aséptica para evitar contaminar el cultivo celular.
2. Agregue 25 ml de solución de gradiente de densidad lista para usar a temperatura ambiente a ocho tubos cónicos de 50 ml.
3. Pipetear muy lentamente 25 ml de solución sanguinológica/salina a lo largo del interior de cada solución de gradiente de densidad que contenga 50 ml de tubo cónico sosteniendo el tubo en un ángulo agudo con respecto a la punta de la pipeta.
   NOTA: La solución de sangre debe colocar suavemente capas sobre la solución de gradiente de densidad y mantener una interfaz bien definida.
4. Centrifugar los tubos durante 30 min a 560 x g y temperatura ambiente (RT).
   NOTA: Para obtener los mejores resultados, desactive el freno de la centrífuga si es posible.
5. Utilice una pipeta delgada para recoger cuidadosamente la capa leucocitaria (capa turbia de células mononucleares por encima de la solución de gradiente de densidad y por debajo del plasma transparente) de cada tubo y distribuir uniformemente en dos nuevos tubos cónicos de 50 ml. Deseche la solución de gradiente de densidad que contiene tubos.
   NOTA: Recoja la mayor cantidad posible de la capa leucocitaria mientras recoge la menor cantidad posible de la solución de gradiente de densidad y el plasma.

3. Lavado y chapado de celdas

1. Cubra un plato de 6 pocillos con fibronectina.
   1. Haga una solución madre de fibronectina plasmática humana diluyéndola a 1 mg/ml en agua estéril. Conservar las alícuotas a -20 °C.
   2. Hacer 3,6 ml de una solución de trabajo de fibronectina diluyendo 600 μL de solución madre de fibronectina en 3 ml de PBS.
   3. Transfiera 600 μL de la solución de trabajo de fibronectina a cada pocillo de una placa de 6 pocillos y rocíe suavemente hasta que esté uniformemente recubierto.
   4. Espere 30 minutos para que la fibronectina cubra los pocillos y aspire suavemente la solución de cada pocillo.
2. Mientras espera a que la fibronectina se cubra, lave las células mononucleares
   1. Rellene los tubos con hasta 45 ml de PBS
   2. Centrífuga durante 5 min a 560 x g y 4 °C con freno bajo. Aspire el sobrenadante de ambos tubos.
   3. Resuspender cada pellet celular en 25 mL de PBS.
   4. Repita para lavar una segunda vez.
3. Resuspenda cada pellet celular en 5 ml de PBS y agregue 15 ml de solución de cloruro de amonio al 0,8% a cada tubo.
   NOTA: Este paso es lisar los glóbulos rojos restantes.
4. Incubar en hielo durante 10 min.
5. Lavar las celdas como antes rellenando los tubos con PBS y centrífuga durante 5 min a 560 x g y 4 °C con freno bajo. Aspire el sobrenadante de ambos tubos.
6. Resuspenda cada pellet celular en 25 mL de PBS y repita para lavar una segunda vez.
7. Resuspender cada pellet celular en 6 ml de medio de cultivo EGM-2 suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) y 1x solución antibiótica/antimicótica que contiene 10.000 U/ml de penicilina, 10 mg/ml de estreptomicina y 25 μg/ml de anfotericina.
   NOTA: El medio de cultivo EGM-2 consiste en un medio de cultivo EBM-2 suplementado con 200 μL de hidrocortisona, 2 ml de factor de crecimiento de fibroblastos humanos (hFGF-B), 500 μL de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), 500 μL de análogo recombinante del factor de crecimiento similar a la insulina (R₃ IGF-1), 500 μL de ácido ascórbico, 500 μL de factor de crecimiento epidérmico humano (hEGF), 500 μL de gentamicina/anfotericina y 500 μL de heparina por 500 ml.
8. Transfiera suavemente 2 ml de la suspensión celular a cada pocillo de la placa de 6 pocillos recubierta de fibronectina y balancee suavemente hasta que esté uniformemente recubierta.
   NOTA: El objetivo es sembrar tantas células como sea posible para maximizar el número de colonias endoteliales que se formarán.

4. Cultivo celular

1. Incubar las celdas a 37 °C, 5% de_CO2 y 100% de humedad.
2. Al día siguiente, agregue suavemente 1 ml de medio de cultivo fresco a cada pocillo.
   NOTA: es importante ser cuidadoso para no alterar las células que se adhieren libremente al recubrimiento de fibronectina.
3. Al día siguiente, realice un cambio de medio de cultivo aspirando suavemente 1,5 ml de medio de cultivo de cada pocillo y reemplazándolo con 1,5 ml de medio de cultivo fresco.
4. En cada uno de los próximos 5 días, realice suavemente un cambio completo del medio de cultivo en cada pocillo (2 ml de medio de cultivo fresco por pocillo).
5. Después de eso, cambie suavemente el medio de cultivo tres veces por semana.
6. Visualice regularmente los cultivos celulares bajo microscopía de luz de baja potencia (objetivo 4x).
   NOTA: Las colonias de células endoteliales de crecimiento sanguíneo adherente (BOEC) comenzarán a aparecer en los pozos 7-10 días después de la placa. Los tipos de células no adherentes se descartarán con cambios en el medio, y otros tipos de células adherentes se disiparán gradualmente a medida que crezcan las colonias BOEC.
7. Pasar los BOEC a un matraz T-75 recubierto de fibronectina cuando ~70%-80% confluente y continuar cambiando el medio de cultivo tres veces por semana.
   NOTA: La densidad de siembra se puede controlar pasando colonias a un matraz T25. Los pasajes posteriores no requieren recubrimiento de fibronectina, y los cambios en el medio de cultivo se pueden reducir a dos veces por semana.
8. Las células de los pasajes 1-3 pueden usarse para experimentos o transferirse a un medio de congelación y almacenarse en nitrógeno líquido para su uso futuro.

Results

La morfología de las células cultivadas se observó desde el inicio del cultivo hasta que se observaron colonias BOEC (Figura 1). Una población más pequeña de células adherentes comenzó a adherirse a las placas de cultivo y crecer, mientras que las células no adherentes se eliminaron con cambios en el medio de cultivo (Figura 1B). Las colonias aparecieron por primera vez el día 6 como una colección de células endoteliales que proliferan radialmente hacia afuera d...

Discussion

Los BOEC son una poderosa herramienta que puede ser utilizada en diversos enfoques científicos y terapéuticos ^7,8,16. Los BOEC se han utilizado para analizar la expresión génica de la CE para dilucidar los factores clave responsables del desarrollo de enfermedades vasculares y cáncer 5,19,20,21. Los BO...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aguja de 19 G	Covidien	1188818112
tubos cónicos de 50 mL	Corning	352098
placa de 6 pocillos	BD Falcon	353046
jeringas de 60 mL	Covidien	8881560125
Solución de cloruro de amonio (0,8%)	Stemcell Technologies	07850
Solución antibiótica/antimicótica (100x)	Gibco	15240-062
Centrífuga	Thermo Scientific	75-253-839
EGM-2 medio	de cultivo Lonza Walkersville	CC-3162
Tubo de extensión	Hanna Pharmaceutical Supply Co.	03382C6227
Suero fetal bovino (FBS)	Atlas Biologicals	F-0500-A
Ficoll-Paque 1077	Cytiva	17144003	Solución de gradiente de densidad
Heparina sódica inyectable (1.000 unidades/mL)	Pfizer	00069-0058-01
Fibronectina plasmática humana	Gibco	33016-015
Ice	N/A	N/A
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Gibco	10010-023
Juego de pipetas	Eppendorf	2231300004
Agua estéril	Gibco	15230-162
Pipeta fina	Celltreat Scientific	229280