Métodos in vitro e in vivo para explorar la megacariopoyesis

François Lanza; Christian Gachet; Anita Eckly

doi:10.3791/63286

Artículo de método

Métodos in vitro e in vivo para explorar la megacariopoyesis

704 visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/63286

⸱

17 de noviembre de 2021

François Lanza¹ , Christian Gachet¹ , Anita Eckly¹

¹Université de Strasbourg, INSERM, EFS Grand Est, BPPS UMR-S 1255, FMTS, F-67065 Strasbourg, France

En este artículo

Resumen

ARTÍCULOS DISCUTIDOS:

1. Pongerard, A., Mallo, L., Gachet, C., Lanza, F., Strassel, C. La leucodepleción filtra las células CD34+ derivadas de ella como fuente celular para estudiar la diferenciación de megacariocitos y la formación de plaquetas. Revista de Experimentos Visualizados: JoVE. (171), E62499 (2021).

2. Kimmerlin, Q., Tavian, M., Gachet, C., Lanza, F., Brouard, N. Aislamiento de progenitores de megacariocitos de ratón. Revista de Experimentos Visualizados: JoVE. (171), E62498 (2021).

3. Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. Cultivo de megacariocitos en hidrogel 3D a base de metilcelulosa para mejorar la maduración celular y estudiar el impacto de la rigidez y el confinamiento. Revista de Experimentos Visualizados: JoVE. (171), E62511 (2021).

4. Scandola, C., Lanza, F., Gachet, C., Eckly, A. Exploración in situ de la megacariopoyesis murina mediante microscopía electrónica de transmisión. Revista de Experimentos Visualizados: JoVE. (171) E62494 (2021).

5. Guinard, I., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C., Eckly, A. Dinámica de formación de proplaquetas de explantes de médula ósea fresca de ratón. Revista de Experimentos Visualizados: JoVE. (171), E62501 (2021).

6. Bornert, A., Pertuy, F., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. Imágenes in vivo de dos fotones de megacariocitos y proplaquetas en la médula ósea del cráneo del ratón. Revista de Experimentos Visualizados: JoVE. (171), E62515 (2021)

Editorial

Las plaquetas son células sanguíneas pequeñas y anucleadas, esenciales para la hemostasia, que se derivan de los megacariocitos (MK) en la médula ósea (BM). Durante su diferenciación a partir de células madre hematopoyéticas, las MK se convierten en células gigantes en un complejo proceso de diferenciación y maduración que incluye poliploidización y maduración citoplasmática. En la etapa final de desarrollo, cuando las MK están en contacto con las células endoteliales, alcanzan su etapa madura y extienden largas extensiones citoplasmáticas, llamadas proplaquetas, hacia los vasos sanguíneos, que luego se fragmentan para dar lugar a plaquetas en el torrente sanguíneo ^1,2. Los mecanismos que regulan la maduración de MK y la formación de proplaquetas transendoteliales aún no se comprenden completamente. El objetivo de esta colección es reunir métodos complementarios que contribuyan a comprender mejor la biología de las MK in vitro e in vivo.

La expansión y diferenciación in vitro de MK se usa ampliamente para estudiar los mecanismos subyacentes a la biogénesis plaquetaria. En el protocolo de Pongerard et al., los autores describen un protocolo de cultivo estandarizado para la diferenciación de MK de progenitores hematopoyéticos CD34⁺ humanos. Destacan especialmente que los filtros de leucocitos disponibles en los centros de sangre son una fuente excepcional para la recolección de células CD34⁺. Su artículo contiene varias pautas esenciales sobre cómo extraer células CD34⁺, cómo evaluar su pureza y la importancia de su densidad de siembra. Los autores también proponen un método de pipeteo calibrado, cinco veces seguidas, para liberar plaquetas funcionales de manera eficiente. Las aplicaciones interesantes de este método son la posibilidad de evaluar compuestos farmacológicos o manipular genéticamente células CD34⁺ utilizando un método de edición del genoma CRISPR-Cas9 ^3,4. Para estudios con ratones, Kimmerlin et al. presentan una estrategia de clasificación celular para purificar progenitores de MK en cantidades suficientes compatibles con ensayos moleculares y celulares. Los autores discuten los méritos de usar la cresta ilíaca como fuente de médula ósea que contiene un gran número de progenitores hematopoyéticos y de realizar un agotamiento magnético de dos pasos de las células no deseadas antes de la clasificación celular utilizando una combinación de marcadores de superficie celular. Una ventaja importante de este método es la reducción del número de animales necesarios para obtener progenitores MK altamente purificados que, por ejemplo, pueden ser de interés para los investigadores que estudian la jerarquía de los progenitores hematopoyéticos y su diferenciación. En este contexto, Boscher et al. describen un método para cultivar progenitores en un medio 3D compuesto por un 2% de metilcelulosa para imitar mejor el entorno in vivo. De hecho, estos autores han demostrado previamente que los MKs cultivados en hidrogel 3D alcanzan un mayor estado de maduración y una mayor capacidad para formar progenitores en comparación con los cultivados en medio líquido⁵. En este protocolo se destacan pasos críticos como el volumen adecuado de metilcelulosa para obtener una rigidez óptima del medio, el número de células que deben ser equivalentes en cada condición experimental y el riesgo de contaminación. Para la verificación funcional del nivel de maduración, los autores explican cómo resuspender las células cultivadas en gel en medio líquido al tercer día de cultivo y cómo fijar las células para su futuro análisis mediante inmunotinción, citometría de flujo o microscopía electrónica. La microscopía electrónica de transmisión (TEM) es el enfoque de imagen de elección para proporcionar una ultraestructura de alta resolución de MK. Aquí, Scandola et al. comparten un protocolo para analizar la ultraestructura de los MK en su entorno natural de BM, y para cuantificar su densidad celular y puntuar las diferentes etapas de maduración. Los autores utilizan TEM para analizar los eventos celulares que ocurren cuando los MK interactúan con la pared sinusoidal, como sus protuberancias cortas invasivas similares a podosomas que penetran en el endotelio⁶. Una limitación del método es que la fase inicial del compromiso de MK no se puede analizar debido a la falta de características ultraestructurales específicas de estas células inmaduras. Como se señaló, este enfoque de imágenes tiene la ventaja de utilizar pequeñas muestras de BM que permiten realizar múltiples estudios con un solo ratón. Como ejemplo, las otras muestras de médula ósea se pueden utilizar para la técnica de explante de médula ósea que se presenta en esta colección de Guinard et al. para estudiar la extensión dinámica de las plaquetas de las MK. La fuerza de este método radica en el uso de MK que se han desarrollado en la BM, evitando así cualquier posible interpretación errónea resultante de artefactos de diferenciación celular en cultivo. De hecho, esto se ha documentado previamente en ratones con inactivación de MYH9 restringida por MK, donde se encontraron resultados divergentes in vitro y ex vivo⁷. Los autores también destacan la naturaleza simple, reproducible y rápida de este enfoque. Una nota interesante de su protocolo es la capacidad de utilizar microscopios equipados con software de navegación para facilitar el seguimiento / cuantificación de MK que extienden las plaquetas. Un método complementario del modelo de explante es la obtención de imágenes de dos fotones de MK en el cráneo del ratón. La singularidad de esta técnica es la capacidad de estudiar in vivo el comportamiento dinámico de los MK marcados con fluorescencia en la médula ósea y visualizar la extensión de las plaquetas. Este protocolo tiene la ventaja de ser mínimamente invasivo, con intervenciones quirúrgicas limitadas, evitando así reacciones inflamatorias que se han reportado que afectan la formación de proplaquetas. Como señalan Bornert et al., una limitación de este método es la estrecha profundidad que se puede obtener debido a la densidad del hueso, lo que también impone el uso de ratones más jóvenes. Esta técnica se puede aplicar a ratones modificados genéticamente para estudiar el papel de los genes de interés en la formación de plaquetas in vivo. Por ejemplo, los autores utilizaron esta técnica para demostrar que el papel de los microtúbulos en el alargamiento de las plaquetas difiere entre las condiciones in vitro e in vivo ⁸.

El desarrollo anormal de MK y la producción de plaquetas pueden provocar trombocitopenia o trombocitemia, lo que aumenta el riesgo de sangrado o trombosis, respectivamente. Los esfuerzos continuos para diseccionar los mecanismos moleculares que gobiernan la biogénesis plaquetaria aumentarán nuestra capacidad para desarrollar estrategias novedosas para el tratamiento de la trombocitopenia y la trombocitemia. En el campo de la investigación transfusional, estos esfuerzos sentarán las bases para producir plaquetas cultivadas como alternativa transfusional en situaciones seleccionadas⁹.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), la Unión Europea a través del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) y por Grant ANR-17-CE14-Megaplatprod a H.d.S y ANR-18-CE14-PlatForMechanics a C.L.

Referencias

Boscher, J., et al. Blood platelet formation at a glance. Journal of Cell Science. 133 (20), 244731(2020).
Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
Strassel, C., et al. Aryl hydrocarbon receptor-dependent enrichment of a megakaryocytic precursor with a high potential to produce proplatelets. Blood. 127 (18), 2231-2240 (2016).
Montenont, E., et al. CRISPR-edited megakaryocytes for rapid screening of platelet gene functions. Blood Advances. 5 (9), 2362-2374 (2021).
Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (11), 2987-3001 (2020).
Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. 106 (5), 1368-1380 (2021).
Strassel, C., Gachet, C., Lanza, F. On the way to in vitro platelet production. Transfusion Clinique et Biologique. 25 (3), 220-227 (2018).

Reimpresiones y permisos

Explorar más artículos

Megakaryocyte Differentiation Platelet Formation CD34+ Cells Mouse Megakaryocyte Progenitors 3D Methylcellulose-based Hydrogel Cell Maturation Murine Megakaryopoiesis Transmission Electron Microscopy Proplatelet Formation Dynamics Two-photon Imaging Bone Marrow Explants