Aquí, entregamos imitaciones exógenas de miARN sintetizadas artificialmente al riñón a través de la inyección de venas de cola de un vector no viral y nanopartículas de polietilenimina en varios modelos de ratón con enfermedad renal. Esto condujo a una sobreexpresión significativa de miARN objetivo en el riñón, lo que resultó en una progresión inhibida de la enfermedad renal en varios modelos de ratón.
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Artículo de método
Entrega de miRNA sintetizado artificialmente exógeno imitador al riñón utilizando nanopartículas de polietilenimina en varios modelos de ratón con enfermedad renal
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Resumen
Resumen
Los microARN (miARN), pequeños ARN no codificantes (21-25 bases) que no se traducen en proteínas, inhiben muchos ARN mensajeros diana (ARNm) al desestabilizar e inhibir su traducción en diversas enfermedades renales. Por lo tanto, la alternancia de la expresión de miARN por imitadores de miARN sintetizados artificialmente exógenos es una opción de tratamiento potencialmente útil para inhibir el desarrollo de muchas enfermedades renales. Sin embargo, debido a que la ARNasa sérica degrada inmediatamente los miARN exógenos administrados sistemáticamente imita in vivo, la entrega de miARN al riñón sigue siendo un desafío. Por lo tanto, son necesarios vectores que puedan proteger a los imitadores de miARN exógenos de la degradación por la ARNasa y entregarlos significativamente al riñón. Muchos estudios han utilizado vectores virales para administrar imitadores o inhibidores exógenos de miARN al riñón. Sin embargo, los vectores virales pueden causar una respuesta de interferón y/o inestabilidad genética. Por lo tanto, el desarrollo de vectores virales también es un obstáculo para el uso clínico de imitadores o inhibidores exógenos de miARN. Para superar estas preocupaciones con respecto a los vectores virales, desarrollamos un método de vector no viral para administrar imitadores de miARN al riñón utilizando la inyección en la vena de la cola de nanopartículas de polietilenimina (PEI-NP), lo que condujo a una sobreexpresión significativa de miARN objetivo en varios modelos de ratón de enfermedad renal.
Introducción
Los miRNAs, pequeños ARN no codificantes (21-25 bases) que no se traducen en proteínas, inhiben muchos ARN mensajeros diana (ARNm) desestabilizándolos e inhibiendo su traducción en diversas enfermedades renales 1,2. Por lo tanto, la terapia génica que emplea imitadores o inhibidores exógenos de miARN sintetizados artificialmente es una nueva opción potencial para inhibir el desarrollo de muchas enfermedades renales 3,4,5.
A pesar de la promesa de imitadores o inhibidores de miARN para la te....
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Protocolo
Todos los protocolos experimentales con animales fueron aprobados por el comité de ética animal de la Universidad Médica de Jichi y se realizaron de acuerdo con las pautas de uso y cuidado de animales experimentales de la Guía para animales de laboratorio de la Universidad Médica de Jichi. Aquí, demostramos la entrega de miRNA imita al riñón, lo que resulta en su sobreexpresión utilizando ratones UUO. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Jichi [Aprobación Nos. 19-12 para fibrosis renal, 17-024 para infección renal aguda (LRA) y 19-11 para nefropatía diabética].
1. Preparación del complejo PEI-NP....
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Resultados
Los miRNAs diana para fibrosis renal, nefropatía diabética y LRA descritos a continuación se seleccionaron en función de la investigación de microarrays, qRT-PCR y / o base de datos para aplicaciones de terapia génica. Para más detalles, consulte las publicaciones anteriores13,14,15.
Entrega y efectos del miRNA-146a-5p-imitador usando PEI-NPs en ratones con fibrosis renal
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Discusión
Usando el protocolo presentado en este manuscrito, los PEI-NP pueden administrar imitadores de miARN al riñón para inducir la sobreexpresión de miARN objetivo, lo que resulta en efectos del tratamiento en modelos de ratón in vivo de varias enfermedades renales, incluida la fibrosis renal, la enfermedad renal diabética y la LRA.
El método para preparar el complejo de PEI-NPs y miRNA imitan es muy simple. La superficie cargada positivamente de los PEI-NPs atrapa la imitación de miRNA cu.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue parcialmente apoyado por JSPS KAKENHI (Subvención No. 21K08233). Agradecemos a Edanz (https://jp.edanz.com/ac) por editar los borradores de este manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 4',6-diamidino-2-fenilindol para la tinción en el núcleo | Thermo Fisher Scientific | D-1306 | |
| Tampón RPE | Qiagen | 79216 | Tampón |
| Tampón RWT | Qiagen | 1067933 | Tampón de lavado 1 |
| Control-miRNA-mimic (miARN sintetizado artificialmente) | Thermo Fisher Scientific | No asignado | 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3' (sentido) 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisentido) |
| Oligonucleótidos de doble cadena marcados con Cy3 | Takara Bio Inc. | ||
| Lectina Lotus tetragonolobus marcada con fluoresceína | Vector Laboratories Inc | FL-1321 | |
| In vivo-jetPEI | Polyplus | 101000021 | |
| MicroAmp Optical Placa de reacción de 96 pocillos para qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | placa de reacción de 96 pocillos |
| Película adhesiva óptica MicroAmp | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Película adhesiva para placa de reacción de 96 pocillos |
| miRNA-146a-5p mimic (miRNA sintetizado artificialmente) | Thermo Fisher Scientific | No asignado | 5'-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sentido) 5'-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisentido) |
| miRNA-146a-5p cebador | Qiagen | MS00001638 | No disponible porque Qiagen ha cambiado los kits de qRT-PCR (del sistema de PCR miScript miRNA al sistema de PCR miRNA LNA miRCURY a partir de mayo de 2021) |
| miRNA-181b-5p mimic (miRNA sintetizado artificialmente) | Diseño de genes | No asignado | 5'-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3' |
| cebador miRNA-181b-5p | Qiagen | MS00006083 | No disponible porque Qiagen ha cambiado los kits de qRT-PCR (del sistema de PCR miScript miRNA al sistema de PCR miRNA LNA miRCURY a partir de mayo de 2021) |
| miRNA-5100-mimic (miARN sintetizado artificialmente) | Diseño génico | No asignado | 5'-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′ |
| miRNA-5100-primer | Qiagen MS00042952 | No disponible porque Qiagen ha cambiado los kits de qRT-PCR (de miScript miRNA PCR system a miRCURY LNA miRNA PCR System a partir de mayo de 2021) | |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Columna de espín anclada a membrana en un tubo de recolección de 2,0 mL |
| miScript II RT kit Qiagen | 218161 | No disponible porque Qiagen ha cambiado los kits de qRT-PCR (del sistema de PCR miScript miRNA al sistema de PCR miRNA miRCURY LNA a partir de mayo de 2021) | |
| Kit de PCR miScript SYBR Green | Qiagen | 218073 | No disponible porque Qiagen ha cambiado los kits de qRT-PCR (del sistema de PCR miScript miRNA al sistema de PCR miRNA miRCURY LNA a partir de mayo de 2021) |
| Trituradora QIA | Qiagen | 79654 | Columnas de centrifugación de biopolímeros en un tubo |
| de recolección de 2,0 mlQIAzol Reactivo de lisis | Qiagen | 79306 | Reactivo de lisis a base de fenol/guanidina |
| QuantStudio 12K Flex Flex Sistema de PCR en tiempo real | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Instrumento de PCR en tiempo real |
| QuantStudio 12K Flex Software versión 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Software de instrumentos de PCR en tiempo real |
| Agua libre de RNasa | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2 cebador | Qiagen | MS00033740 | No disponible porque Qiagen ha cambiado los kits de qRT-PCR (del sistema de PCR miScript miRNA al sistema de PCR miRNA miRCURY LNA a partir de mayo de 2021) |
| Tissue-Tek OCT (compuesto de temperatura de corte óptima) | Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. | No asignado |
Referencias
- Mohr, A. M., Mott, J. L. Overview of microRNA biology. Seminars in Liver Disease. 35 (1), 3-11 (2015).
- Bushati, N., Cohen, S. M. microRNA functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).
- Simpson, K., Wonnacott, A., Fraser, D. J., Bowen, T.
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Reimpresiones y permisos
