Name: Entrega de miRNA sintetizado artificialmente exógeno imitador al riñón utilizando nanopartículas de polietilenimina en varios modelos de ratón con enfermedad renal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Aprende a entregar miRNA sintetizado exógeno al riñón usando nanopartículas de polietilenimina en modelos de ratón. Este método inhibe la progresión de enfermedades renales sin provocar respuesta de interferón.

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Este trabajo fue parcialmente apoyado por JSPS KAKENHI (Subvención No. 21K08233). Agradecemos a Edanz (https://jp.edanz.com/ac) por editar los borradores de este manuscrito.

Todos los protocolos experimentales con animales fueron aprobados por el comité de ética animal de la Universidad Médica de Jichi y se realizaron de acuerdo con las pautas de uso y cuidado de animales experimentales de la Guía para animales de laboratorio de la Universidad Médica de Jichi. Aquí, demostramos la entrega de miRNA imita al riñón, lo que resulta en su sobreexpresión utilizando ratones UUO. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Jichi [Aprobación Nos. 19-12 para fibrosis renal, 17-024 para infección renal aguda (LRA) y 19-11 para nefropatía diabética].
1. Preparación del complejo PEI-NPs-miRNA-imitador
NOTA: Aquí, la preparación de PEI-NPs-miRNA-imita13,14,15 y PEI-NPs-control-miRNA (como control negativo) se describen para un ratón.
<ol><li>Prepare los siguientes elementos:<ol><li>Preparar 10 μL de PEI-NPs lineales.</li>
		<li>Preparar 50 μL de miRNAs sintetizados artificialmente disueltos en agua libre de nucleasas a una concentración de 100 μM (5 nmol miRNA disueltos en 50 μL de agua libre de nucleasa).</li>
		<li>Preparar 50 μL de miRNAs control sintetizados artificialmente (no objetivo) disueltos en agua libre de nucleasas a una concentración de 100 μM (5 nmol miRNA disueltos en 50 μL de agua libre de nucleasas).</li>
		<li>Preparar soluciones de glucosa al 5% y 10%. Asegurar la disponibilidad de tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y un mezclador de vórtice.</li>
	</ol></li>
	<li>Disolver 10 μL de PEI-NPs en 90 μL de solución de glucosa al 5% en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Luego, vortex el tubo suavemente y gira hacia abajo.</li>
	<li>Mezclar 50 μL de miRNAs sintetizados artificialmente (5 nmol) disueltos en agua libre de nucleasas (concentración de 100 μM) con 50 μM de solución de glucosa al 10% en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Luego, vortex el tubo suavemente y gira hacia abajo. Este proceso produce miARN disuelto en solución de glucosa al 5%.</li>
	<li>Mezclar 100 μL de PEI-NPs en solución de glucosa al 5% y 100 μL de miRNA imitador (5 nmol) en solución de glucosa al 5%. Luego, vortex el tubo suavemente y gira hacia abajo.</li>
	<li>Incubar la mezcla durante 15 min a temperatura ambiente (RT) para preparar un complejo estable de PEI-NPs-miRNA-imitador. Esta solución contiene PEI-NPs y miRNA imitador (5 nmol) en una proporción de nitrógenos (N) en el polímero a fosfato (P) en ácidos nucleicos (relación N/P) = 6 (Figura 1). NOTA: El complejo PEI-NPs-control-miRNA se puede preparar utilizando el mismo proceso descrito en los pasos 1.1-1.5 para todos los modelos de ratones con enfermedad renal descritos en este manuscrito (UUO, nefropatía diabética y LRA). Un volumen de inyección de PEI-NP-miRNAs-mimic es el mismo que 5 nmol de miRNAs-imitan conjugado con PEI-NPs en relación N/P = 6. La duración y frecuencia de inyección de cada imitación de PEI-NP-miRNAs depende del modelo de enfermedad en el que se aplica.</li>
</ol>2. Confirmación de la entrega significativa de miRNA imitador al riñón en ratones UUO por PEI-NP a través de la inyección de venas de la cola utilizando microscopía fluorescente
NOTA: Aquí, se elabora el método de administración de miRNA purificado artificialmente imitador al riñón, lo que indica el establecimiento de métodos terapéuticos para diversas enfermedades renales. En resumen, a los ratones UUO se les administró miARN marcado con ácido carboxílico cianina3 (Cy3) agregado a 100 μL de PEI-NP a través de la vena de la cola. El suministro a los riñones se confirmó con microscopía de fluorescencia. Se describe el imitador de miARN marcado con ácido carboxílico (Cy3) PEI-NPs-cianina3 (oligonucleótidos) para un ratón. Este método puede administrar significativamente miRNA imitador al riñón en varios modelos de ratón, como ratones UUO, ratones con enfermedad renal diabética y ratones AKI producidos por IRI. Aquí, utilizamos un modelo de ratón UUO para la demostración de video. El método de inducción de UUO fue descrito previamente en otra parte13. Siga estos protocolos dentro de los seis días posteriores a la cirugía UUO.
<ol><li>Prepare los siguientes elementos:<ol><li>Preparar 2 μL de PEI-NPs y 100 μL de oligonucleótidos de doble cadena marcados con Cy3 [imitador de miARN marcado con Cy3 (1 nmol; 10 μM)].</li>
		<li>Preparar soluciones de glucosa al 5% y 10%. Asegurar la disponibilidad de tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y un mezclador de vórtice.</li>
		<li>Use un tubo de centrífuga de plástico de 50 ml con un pequeño orificio en la tapa para aislar las venas de la cola de los ratones UUO.</li>
		<li>Para la microscopía de fluorescencia, prepare un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT), un criostato, nitrógeno líquido, solución salina tamponada con fosfato (PBS), jeringas de 1.0 ml con una aguja de 27 G y vidrio recubierto de silano. NOTA: Se puede preparar lectina Lotus tetragonolobus marcada con fluoresceína (un marcador de túbulo proximal) y 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para la tinción opcional de túbulos proximales y núcleos celulares.</li>
	</ol></li>
	<li>Disolver 2 μL de PEI-NPs en 98 μL de solución de glucosa al 10% en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Luego, vortex el tubo suavemente y gira hacia abajo.</li>
	<li>Añadir 100 μL de miARN marcado con Cy3 imitador a 100 μL de PEI-NPs en solución de glucosa al 10% (preparada en el paso 2.2). Luego, vortex el tubo suavemente y gira hacia abajo.</li>
	<li>Incubar la mezcla durante 15 min en RT para preparar un complejo estable de imitador de miARN marcado con PEI-NPs-Cy3.</li>
	<li>Coloque el ratón UUO de cabeza en un tubo de centrífuga de 50 ml sin anestesia, y luego coloque la cola a través del orificio preparado en la tapa.</li>
	<li>Llene una jeringa de 1,0 ml con una aguja de 27 G con 200 μL del complejo imitador de PEI-NPs-Cy3-miRNA.</li>
	<li>Inyecte PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic (200 μL) a través de la vena de la cola del ratón utilizando la jeringa de 1,0 ml con aguja de 27 G. NOTA: Limpie la vena de la cola con algodón saturado en etanol (70% -80%) para dilatar la vena de la cola y desinfectar el área de inyección.</li>
	<li>Una hora después de 200 μL de inyección del complejo imitador de PEI-NPs-Cy3-miRNA, anestesiar al ratón con isoflurano (4% -5%) utilizando un dispositivo anestésico apropiado para animales pequeños. Confirme la profundidad de la anestesia con una ausencia de reflejo de pellizco del dedo del pie. Mantener la anestesia con isoflurano (3%) durante toda la cirugía.</li>
	<li>Luego, haga una incisión en la piel, los músculos y las costillas con tijeras quirúrgicas y fórceps para exponer el corazón. Después de hacer una incisión en la aurícula derecha, inyecte PBS en el ventrículo izquierdo para extraer sangre por todo el cuerpo hasta que el color del riñón cambie a amarillo pálido (lo que indica que todo el cuerpo del ratón está perfundido con PBS). NOTA: La perfusión cardíaca se realiza para eliminar eficientemente la sangre en todo el cuerpo.</li>
	<li>Deje de tomar isoflurano y retire los riñones de los ratones y lávelos con PBS. Después de eso, retire las cápsulas renales de los riñones y lave los riñones dos veces con PBS.</li>
	<li>Incrustar las muestras de tejido renal en OCT compuesto y congelar en nitrógeno líquido.</li>
	<li>Utilice un criostato para preparar secciones (5 μm de espesor). Monte las secciones en portaobjetos de vidrio recubiertos de silano y fíjelos con paraformaldehído al 4%. NOTA: Los tejidos renales pueden teñirse opcionalmente con lectina Lotus tetragonolobus marcada con fluoresceína (2 mg/ml) a RT durante 2 h para los túbulos proximales, seguido de DAPI (30 nM en PBS) a RT durante 15 min para los núcleos celulares.</li>
	<li>Lave suavemente las diapositivas dos veces con PBS.</li>
	<li>Visualice la tinción de fluorescencia mediante microscopía de fluorescencia con un aumento de 100x y 400x y el software de imágenes adecuado.</li>
</ol>3. Confirmación de alteraciones del miARN diana después de la administración de miARN imitador al riñón por PEI-NP mediante inyección en la vena de la cola
<ol><li>Realizar una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) para confirmar las alteraciones del miARN objetivo. NOTA: Consulte el artículo publicado anteriormente para obtener detalles de qRT-PCR18,19,20. El sistema qRT-PCR utilizado para generar los resultados representativos que se proporcionan a continuación fue cambiado por el fabricante. La qRT-PCR debe realizarse de acuerdo con el protocolo más reciente del fabricante.</li>
</ol>

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<li>Bushati, N., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">microRNA functions.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).</li>
<li>Simpson, K., Wonnacott, A., Fraser, D. J., Bowen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNAs+in+diabetic+nephropathy%3A+From+biomarkers+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Diabetes+Reports%22%5BJournal%5D)">microRNAs in diabetic nephropathy: From biomarkers to therapy.</a> Current Diabetes Reports. 16 (3), 35(2016).</li>
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<li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+microRNAs+for+the+treatment+of+renal+fibrosis+and+CKD%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD.</a> Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).</li>
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<li>Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+silent+treatment%3A+siRNAs+as+small+molecule+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs.</a> Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).</li>
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<li>Yanai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+evaluation+of+microRNA+expressions+in+mouse+kidney+with+unilateral+ureteral+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR evaluation of microRNA expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61383(2020).</li>
<li>Aomatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+detection+method+for+microRNAs+in+the+kidney+of+an+ischemic+kidney+injury+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A quantitative detection method for microRNAs in the kidney of an ischemic kidney injury mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), e61378(2020).</li>
<li>Kushibiki, T., Nagata-Nakajima, N., Sugai, M., Shimizu, A., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+anti-fibrotic+activity+of+plasmid+DNA+expressing+small+interference+RNA+for+TGF-beta+type+II+receptor+for+a+mouse+model+of+obstructive+nephropathy+by+cationized+gelatin+prepared+from+different+amine+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%3A+Official+Journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Enhanced anti-fibrotic activity of plasmid DNA expressing small interference RNA for TGF-beta type II receptor for a mouse model of obstructive nephropathy by cationized gelatin prepared from different amine compounds.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 110 (3), 610-617 (2006).</li>
<li>Xia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+renal+tubulointerstitial+fibrosis+by+small+interfering+RNA+targeting+heat+shock+protein+47%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Suppression of renal tubulointerstitial fibrosis by small interfering RNA targeting heat shock protein 47.</a> American Journal of Nephrology. 28 (1), 34-46 (2008).</li>
<li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+transfer+of+hepatocyte+growth+factor+to+skeletal+muscle+prevents+changes+in+rat+kidneys+after+5%2F6+nephrectomy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%3A+Official+Journal+of+the+American+Society+of+Transplantation+and+the+American+Society+of+Transplant+Surgeons%22%5BJournal%5D)">In vivo gene transfer of hepatocyte growth factor to skeletal muscle prevents changes in rat kidneys after 5/6 nephrectomy.</a> American Journal of Transplantation: Official Journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 2 (9), 828-836 (2002).</li>
<li>Hamar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+interfering+RNA+targeting+Fas+protects+mice+against+renal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Small interfering RNA targeting Fas protects mice against renal ischemia-reperfusion injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (41), 14883-14888 (2004).</li>
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</ol>

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Usando el protocolo presentado en este manuscrito, los PEI-NP pueden administrar imitadores de miARN al riñón para inducir la sobreexpresión de miARN objetivo, lo que resulta en efectos del tratamiento en modelos de ratón in vivo de varias enfermedades renales, incluida la fibrosis renal, la enfermedad renal diabética y la LRA.
El método para preparar el complejo de PEI-NPs y miRNA imitan es muy simple. La superficie cargada positivamente de los PEI-NPs atrapa la imitación de miRNA cu...

Los miRNAs, pequeños ARN no codificantes (21-25 bases) que no se traducen en proteínas, inhiben muchos ARN mensajeros diana (ARNm) desestabilizándolos e inhibiendo su traducción en diversas enfermedades renales 1,2. Por lo tanto, la terapia génica que emplea imitadores o inhibidores exógenos de miARN sintetizados artificialmente es una nueva opción potencial para inhibir el desarrollo de muchas enfermedades renales 3,4,5.
A pesar de la promesa de imitadores o inhibidores de miARN para la terapia génica, la administración a órganos diana sigue siendo un gran obstáculo para que los experimentos in vivo desarrollen su potencial clínico. Debido a que los imitadores o inhibidores de miARN sintetizados artificialmente están sujetos a degradación inmediata por la RNasa sérica, su vida media se acorta con la administración sistémica in vivo6. Además, la eficiencia de los imitadores o inhibidores de miARN para atravesar la membrana plasmática y el citoplasma transfecto es generalmente mucho menor sin vectores apropiados 7,8. Estas líneas de evidencia sugieren que se requiere el desarrollo del sistema de administración de miRNA imitadores o inhibidores para el riñón, para permitir su uso en entornos clínicos y convertirlos en una nueva opción de tratamiento para pacientes con diversas enfermedades renales.
Los vectores virales se han utilizado como portadores para administrar imitadores o inhibidores exógenos de miARN al riñón 9,10. A pesar de haber sido desarrollados para la bioseguridad y la eficacia de la transfección, los vectores virales aún pueden causar una respuesta de interferón y/o inestabilidad genética11,12. Para superar estas preocupaciones, desarrollamos un sistema de administración de miRNA imita el riñón utilizando nanopartículas de polietilenimina (PEI-NPs), un vector no viral, en varios modelos de ratón de enfermedad renal13,14,15.
Los PEI-NP son NP lineales basados en polímeros que pueden entregar oligonucleótidos de manera efectiva, incluidos los imitadores de miARN, al riñón, y se consideran preferibles para preparar vectores no virales debido a su seguridad y biocompatibilidad a largo plazo13,16,17.
Este estudio demuestra los efectos de la administración sistemática de miARN exógeno con PEI-NP a través de la inyección de venas de cola en ratones modelo de fibrosis renal producidos por obstrucción unilateral del uréter (UUO). Además, demostramos los efectos de la administración sistemática de miRNA exógeno con PEI-NPs a través de la inyección de venas de la cola en ratones modelo de enfermedad renal diabética (ratones db / db: C57BLKS / J Iar -+Lepr db / +Leprdb) y ratones modelo de lesión renal aguda producidos por lesión renal por isquemia-reperfusión (IRI).

<table><tbody><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindol para la tinción en el núcleo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D-1306</td><td></td></tr><tr><td>Tampón RPE</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>Tampón</td></tr> 2 <tr><td>Tampón RWT</td><td>Qiagen</td><td>1067933</td><td>Tampón de lavado 1</td></tr><tr><td>Control-miRNA-mimic (miARN sintetizado artificialmente)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>No asignado</td><td>5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3' (sentido) 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3&prime; (antisentido)</td></tr><tr><td>Oligonucleótidos de doble cadena marcados con Cy3</td><td>Takara Bio Inc.</td><td></td><td></td>MIR7900</tr><tr><td>Lectina Lotus tetragonolobus marcada con fluoresceína</td><td>Vector Laboratories Inc</td><td>FL-1321</td><td></td></tr><tr><td>In vivo-jetPEI</td><td>Polyplus</td><td>101000021</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical Placa de reacción de 96 pocillos para qRT-PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4316813</td><td>placa de reacción de 96 pocillos</td></tr><tr><td>Película adhesiva óptica MicroAmp</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td>Película adhesiva para placa de reacción de 96 pocillos</td></tr><tr><td>miRNA-146a-5p mimic (miRNA sintetizado artificialmente)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>No asignado</td><td>5'-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3&prime; (sentido) 5'-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3&prime; (antisentido)</td></tr><tr><td>miRNA-146a-5p cebador</td><td>Qiagen</td><td>MS00001638</td><td>No disponible porque Qiagen ha cambiado los kits de qRT-PCR (del sistema de PCR miScript miRNA al sistema de PCR miRNA LNA miRCURY a partir de mayo de 2021)</td></tr><tr><td>miRNA-181b-5p mimic (miRNA sintetizado artificialmente)</td><td>Diseño de genes</td><td>No asignado</td><td>5'-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3'</td></tr><tr><td>cebador miRNA-181b-5p</td><td>Qiagen</td><td>MS00006083</td><td>No disponible porque Qiagen ha cambiado los kits de qRT-PCR (del sistema de PCR miScript miRNA al sistema de PCR miRNA LNA miRCURY a partir de mayo de 2021)</td></tr><tr><td>miRNA-5100-mimic (miARN sintetizado artificialmente)</td><td>Diseño génico</td><td>No asignado</td><td>5'-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3&prime;</td></tr><tr><td>miRNA-5100-primer</td><td>Qiagen MS00042952</td><td></td><td>No disponible porque Qiagen ha cambiado los kits de qRT-PCR (de miScript miRNA PCR system a miRCURY LNA miRNA PCR System a partir de mayo de 2021)</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>Columna de espín anclada a membrana en un tubo de recolección de 2,0 mL</td></tr><tr><td>miScript II RT kit Qiagen</td><td>218161</td><td></td><td>No disponible porque Qiagen ha cambiado los kits de qRT-PCR (del sistema de PCR miScript miRNA al sistema de PCR miRNA miRCURY LNA a partir de mayo de 2021)</td></tr><tr><td>Kit de PCR miScript SYBR Green</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td>No disponible porque Qiagen ha cambiado los kits de qRT-PCR (del sistema de PCR miScript miRNA al sistema de PCR miRNA miRCURY LNA a partir de mayo de 2021)</td></tr><tr><td>Trituradora QIA</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>Columnas de centrifugación de biopolímeros en un tubo</td></tr> <tr><td>de recolección de 2,0 mlQIAzol Reactivo de lisis</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>Reactivo de lisis a base de fenol/guanidina</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex Flex Sistema de PCR en tiempo real</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>Instrumento de PCR en tiempo real</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex Software versión 1.2.1.</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>Software de instrumentos de PCR en tiempo real</td></tr><tr><td>Agua libre de RNasa</td><td>Qiagen</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>RNU6-2 cebador</td><td>Qiagen</td><td>MS00033740</td><td>No disponible porque Qiagen ha cambiado los kits de qRT-PCR (del sistema de PCR miScript miRNA al sistema de PCR miRNA miRCURY LNA a partir de mayo de 2021)</td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT (compuesto de temperatura de corte óptima)</td><td>Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.</td><td>No asignado</td><td></td></tr></tbody></table>

entrega de mirna sintetizado artificialmente exógeno imitador al riñón utilizando nanopartículas de polietilenimina en varios modelos de ratón con enfermedad renal

Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models

Los microARN (miARN), pequeños ARN no codificantes (21-25 bases) que no se traducen en proteínas, inhiben muchos ARN mensajeros diana (ARNm) al desestabilizar e inhibir su traducción en diversas enfermedades renales. Por lo tanto, la alternancia de la expresión de miARN por imitadores de miARN sintetizados artificialmente exógenos es una opción de tratamiento potencialmente útil para inhibir el desarrollo de muchas enfermedades renales. Sin embargo, debido a que la ARNasa sérica degrada inmediatamente los miARN exógenos administrados sistemáticamente imita in vivo, la entrega de miARN al riñón sigue siendo un desafío. Por lo tanto, son necesarios vectores que puedan proteger a los imitadores de miARN exógenos de la degradación por la ARNasa y entregarlos significativamente al riñón. Muchos estudios han utilizado vectores virales para administrar imitadores o inhibidores exógenos de miARN al riñón. Sin embargo, los vectores virales pueden causar una respuesta de interferón y/o inestabilidad genética. Por lo tanto, el desarrollo de vectores virales también es un obstáculo para el uso clínico de imitadores o inhibidores exógenos de miARN. Para superar estas preocupaciones con respecto a los vectores virales, desarrollamos un método de vector no viral para administrar imitadores de miARN al riñón utilizando la inyección en la vena de la cola de nanopartículas de polietilenimina (PEI-NP), lo que condujo a una sobreexpresión significativa de miARN objetivo en varios modelos de ratón de enfermedad renal.

Los miRNAs diana para fibrosis renal, nefropatía diabética y LRA descritos a continuación se seleccionaron en función de la investigación de microarrays, qRT-PCR y / o base de datos para aplicaciones de terapia génica. Para más detalles, consulte las publicaciones anteriores13,14,15.
Entrega y efectos del miRNA-146a-5p-imitador usando PEI-NPs en ratones con fibrosis renal<sup ...

Aquí, entregamos imitaciones exógenas de miARN sintetizadas artificialmente al riñón a través de la inyección de venas de cola de un vector no viral y nanopartículas de polietilenimina en varios modelos de ratón con enfermedad renal. Esto condujo a una sobreexpresión significativa de miARN objetivo en el riñón, lo que resultó en una progresión inhibida de la enfermedad renal en varios modelos de ratón.

Entrega de miRNA sintetizado artificialmente exógeno imitador al riñón utilizando nanopartículas de polietilenimina en varios modelos de ratón con enfermedad renal

microRNAs&#160;(miRNAs), small noncoding RNAs (21-25 bases) that are not translated into proteins, inhibit lots of target messenger RNAs (mRNAs) by ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la terapia de microARN al riñón, lo que sigue siendo un desafío. La principal ventaja de esta técnica es que permite la terapia de microARN que imita al riñón sin causar una respuesta de interferón o inestabilidad genética. Comience disolviendo 10 microlitros de PEI-NP en 90 microlitros de solución de glucosa al 5% en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros.Luego vortex el tubo suavemente y gira hacia abajo. Mezclar 50 microlitros de miRNAs sintetizados artificialmente disueltos en 100 micromolares de agua libre de nucleasa con 50 micromolares de solución de glucosa al 10% en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Vortex el tubo suavemente y gira hacia abajo.Este proceso produce miARN disuelto en solución de glucosa al 5%. Luego mezcle 100 microlitros de PEI-NP en solución de glucosa al 5% y 100 microlitros de miRNA imitan en una solución de glucosa al 5%. Vortex el tubo suavemente y gira hacia abajo.Incubar la mezcla durante 15 minutos a temperatura ambiente para preparar un complejo estable de imitación de miARN PEI-NPs. Disuelva dos microlitros de PEI-NP en 98 microlitros de solución de glucosa al 10% en un tubo d

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Investigación

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Medicine

Medicina

En este video, presentamos el protocolo para la inyección hidrodinámica de plásmidos en la pelvis renal del riñón de ratón para la transfección de ácidos nucleicos. Esta técnica permite la administración de plásmidos específicos de órganos mediante la utilización del principio de alta presión hidrostática, que impulsa con fuerza los plásmidos al sitio específico sin causar lesiones tisulares.

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En este artículo se describe un protocolo de hibridación in situ optimizado para la detección colorimétrica de expresión de microARN en secciones de riñón fijas con formalina.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación de los tejidos del riñón y fijados con formalina

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Describimos un método para evaluar la expresión del microRNA en los riñones de ratones con obstrucción ureteral unilateral (UUO) mediante la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa de transcripción inversa. Este protocolo es adecuado para el estudio de perfiles de expresión de microARN renal en ratones con UUO y en el contexto de otras condiciones patológicas.

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Los microARN están implicados en la patogénesis de la nefropatía por IgA. Hemos desarrollado un método fiable para detectar los niveles de expresión de microARN en los riñones de un modelo de ratón con nefropatía IgA (ratones HIGA). Este nuevo método facilitará la comprobación de la participación de los miRNAs en la nefropatía por IgA.

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Aprende a entregar miRNA sintetizado exógeno al riñón usando nanopartículas de polietilenimina en modelos de ratón. Este método inhibe la progresión de enfermedades renales sin provocar respuesta de interferón.

Entrega de miRNA sintetizado artificialmente exógeno imitador al riñón utilizando nanopartículas de polietilenimina en varios modelos de ratón con enfermedad renal (Video) | JoVE Journal

Entrega de miRNA sintetizado artificialmente exógeno imitador al riñón utilizando nanopartículas de polietilenimina en varios modelos de ratón con enfermedad renal

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