El protocolo describe el aislamiento, el cultivo y el perfil de las células endoteliales de la arteria mesentérica humana. Además, se proporciona un método para preparar la arteria humana para la transcriptómica espacial. La proteómica, la transcriptómica y los ensayos funcionales se pueden realizar en células aisladas. Este protocolo se puede reutilizar para cualquier arteria de tamaño mediano o grande.
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Artículo de método
Aislamiento y perfil de células endoteliales arteriales mesentéricas primarias humanas a nivel de transcriptoma
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células endoteliales (CE) son cruciales para la función vascular y de todo el cuerpo a través de su respuesta dinámica a las señales ambientales. Dilucidar el transcriptoma y el epigenoma de las CE es primordial para comprender sus funciones en el desarrollo, la salud y la enfermedad, pero está limitado en la disponibilidad de células primarias aisladas. Las tecnologías recientes han permitido el perfil de alto rendimiento del transcriptoma y el epigenoma de la CE, lo que ha llevado a la identificación de subpoblaciones de células de la CE previamente desconocidas y trayectorias de desarrollo. Si bien los cultivos de EC son una herramienta útil en la exploración de la función y la disfunción de la EC, las condiciones de cultivo y los múltiples pasajes pueden introducir variables externas que alteran las propiedades de la EC nativa, incluida la morfología, el estado epigenético y el programa de expresión génica. Para superar esta limitación, el presente artículo demuestra un método para aislar las CE primarias humanas de las arterias mesentéricas de donantes con el objetivo de capturar su estado nativo. Las CE en la capa íntima se disocian mecánica y bioquímicamente con el uso de enzimas particulares. Las células resultantes se pueden usar directamente para la secuenciación de ARN a granel o ARN unicelular o enchapadas para cultivo. Además, se describe un flujo de trabajo para la preparación de tejido arterial humano para transcriptómica espacial, específicamente para una plataforma disponible comercialmente, aunque este método también es adecuado para otras técnicas de perfilado de transcriptoma espacial. Esta metodología se puede aplicar a diferentes vasos recolectados de una variedad de donantes en estados de salud o enfermedad para obtener información sobre la regulación transcripcional y epigenética de la CE, un aspecto fundamental de la biología celular endotelial.
Introducción
Al revestir la luz de los vasos sanguíneos, las células endoteliales (CE) son reguladores cruciales del tono vascular y la perfusión tisular. Las CE son notables en su capacidad para reaccionar al entorno extracelular y adaptarse a los cambios en la dinámica y composición del flujo sanguíneo. Estas respuestas dinámicas están mediadas a través de una red de eventos de señalización intracelular, incluyendo modulaciones transcripcionales y post-transcripcionales con resolución espacio-temporal. La desregulación de estas respuestas está implicada en muchas patologías, incluyendo pero no limitado a enfermedades cardiovasculares, diabetes y cáncer
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Protocolo
Se realizaron estudios de tejidos humanos en especímenes no identificados obtenidos del Centro de Recursos de Células de Islotes del Sur de California en City of Hope. Los consentimientos de la investigación para el uso de tejidos humanos postmortem se obtuvieron de los familiares de los donantes, y la aprobación ética para este estudio fue otorgada por la Junta de Revisión Institucional de City of Hope (IRB No. 01046).
1. Disociación física (tiempo estimado: 1-2 h)
- Coloque una arteria fresca en un plato de 10 cm y lávese con solución salina tamponada con fosfato (D-PBS) estéril de Dulbecco.
- Con pinzas e....
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Resultados
El análisis de las CE de la arteria mesentérica utilizando una combinación de disociación mecánica y enzimática o criopreservación para su uso en varios ensayos aguas abajo se representa aquí (Figura 1). Las CE se pueden perfilar en las arterias mesentéricas utilizando los siguientes pasos: A) disociación mecánica de la íntima junto con la digestión de la colagenasa a las células de cultivo; B) generación de suspensión unicelular para scRNA-seq; o C) las secciones transversales de la arteria.......
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Discusión
El flujo de trabajo presentado detalla un conjunto de técnicas para perfilar las CE a partir de una sola pieza de arteria humana con resolución espacial y de una sola célula. Hay varios pasos críticos y factores limitantes en el protocolo. Una clave para el perfil del transcriptoma es la frescura del tejido y la integridad del ARN. Es importante mantener los tejidos en hielo tanto como sea posible antes del procesamiento para minimizar la degradación del ARN. Por lo general, los tejidos post mortem se procesan entre 8-14.......
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Divulgaciones
S.Z. es fundador y miembro de la junta directiva de Genemo, Inc.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH R01HL108735, R01HL145170, R01HL106089 (a Z.B.C.); DP1DK126138 y DP1HD087990 (a S.Z.); una subvención de la Fundación Ella Fitzgerald y un Proyecto de la Familia Wanek (a Z.B.C.); y una subvención de la red de semillas del Atlas de Células Humanas (a Z.B.C. y S.Z.). La investigación reportada en esta publicación incluyó el trabajo realizado en el Núcleo de Genómica Integrativa en City of Hope con el apoyo del Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio P30CA033572. Los autores desean agradecer al Dr. Ismail Al-Abdullah y al Dr. Meirigeng Qi del equipo de trasplante....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL | USA Scientific | 1615-5500 | |
| plato de 10 cm | Genesee Scientific | 25-202 | |
| agujas 23G | BD | 305145 | |
| 2-metilbutano | Thermo Fisher | AC327270010 | |
| 40 µ filtro m | Fisher | 14100150 | |
| 4200 Sistema TapeStation | Agilent Technologies | G2991BA | |
| tubo de 5 mL | Thermo Fisher | 14282300 | |
| placa de 6 pocillos | Greiner Bio-One | 07-000-208 | |
| Factor de fijación | Aplicaciones celulares | 123-500 | Reactivo de fijación en el protocolo |
| Cera negra | Se puede utilizar cualquier cera negra comercial | ||
| albúmina sérica bovina tratada con choque térmico | Fisher | BP1600-100 | |
| CaCl2 | Fisher | BP510 | |
| Centrífuga | Eppendorf | ||
| Cloroformo | Fisher | C607 | |
| Colagenasa D | Roche | 11088866001 | |
| CriostatoCepillos Leica | |||
| Cryostat | |||
| D-PBS | Thermo Fisher | 14080055 | |
| etanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Suero fetal bovino | Fisher | 10437028 | |
| Hemocitómetro | Fisher | 267110 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-100g | |
| Tampón de muestra D1000 de alta sensibilidad | Agilent Technologies | 5067-5603 | |
| Cinta de pantalla D1000 de alta sensibilidad | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| Incubadora | mantenida a 37 ° C 5% CO2 | ||
| Isopropanol | Fisher | BP26324 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| Medio de nitrógeno | |||
| 199 | Sigma Aldrich | M2520-10X | |
| Bombonero | |||
| Microscopio | Leica | Para evaluar la morfología celular | |
| Medio de cultivo endotelial microvascular | Aplicaciones celulares | 111-500 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Agitador orbital | Eppendorf | ||
| Temperatura óptima de corte compuesto | Fisher | 4585 | |
| Criomoldes de plástico | Fisher | 22363553 | |
| Cinta | de cribado de ARNAgilent Technologies | 5067-5576 | |
| Cribado de ARN Tampón de muestra de cinta | Agilent Technologies | 5067-5577 | |
| RNasa ZAP | Thermo Fisher | AM9780 | |
| Agua sin RNasa | Takara | RR036B | Agua sin RNasa (2) en kit |
| Pinza estéril de 12" de | F.S.T | 91100-16 | |
| Pinza fina estéril | F.S.T | 11050-10 | |
| Tijeras finas estériles | F.S.T | 14061-11 | |
| Superfrost PLUS Gold Slides | Reactivo Fisher | 1518848 | |
| TRIzol | Fisher 15596018 | ||
| Trypan Blue | Corning | MT25900CI | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) rojo fenol | Thermo Fisher | 12605010 | Enzima de disociación celular en el protocolo |
| Kit de accesorios de Visium | 10X Genomics | PN-1000215 | |
| Visium Gateway Package, 2rxns | 10X Genomics | PN-1000316 | |
| Visium Spatial Gene Expression Slide & Kit de reactivos, 4 rxns | 10X Genomics | PN-1000184 |
Referencias
- Thorin, E., Shreeve, S. M. Heterogeneity of vascular endothelial cells in normal and disease states. Pharmacology & Therapeutics. 78 (3), 155-166 (1998).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinic....
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Reimpresiones y permisos
