El protocolo describe el método de carga de un tinte de calcio fluorescente a través del nervio cortado en las terminales nerviosas motoras del ratón. Además, se presenta un método único para registrar transitorios rápidos de calcio en las terminaciones nerviosas periféricas mediante microscopía confocal.
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Artículo de método
Registro de transitorios de calcio en unión neuromuscular de ratón con alta resolución temporal mediante microscopía confocal
En este artículo
Resumen
Resumen
La estimación del nivel de calcio presináptico es una tarea clave en el estudio de la transmisión sináptica, ya que la entrada de calcio en la célula presináptica desencadena una cascada de eventos que conducen a la liberación de neurotransmisores. Además, los cambios en los niveles de calcio presináptico median la actividad de muchas proteínas intracelulares y juegan un papel importante en la plasticidad sináptica. El estudio de la señalización del calcio también es importante para encontrar formas de tratar las enfermedades neurodegenerativas. La unión neuromuscular es un modelo adecuado para estudiar la plasticidad sináptica, ya que tiene un solo tipo de neurotransmisor. Este artículo describe el método para cargar un tinte sensible al calcio a través del haz de nervios cortado en las terminaciones nerviosas motoras de los ratones. Este método permite la estimación de todos los parámetros relacionados con los cambios intracelulares de calcio, como el nivel de calcio basal y el calcio transitorio. Dado que la afluencia de calcio desde el exterior de la célula hacia las terminales nerviosas y su unión / desunión al tinte sensible al calcio ocurre dentro del rango de unos pocos milisegundos, se requiere un sistema de imágenes rápido para registrar estos eventos. De hecho, las cámaras de alta velocidad se utilizan comúnmente para el registro de cambios rápidos de calcio, pero tienen parámetros de baja resolución de imagen. El protocolo presentado aquí para el registro transitorio de calcio permite una resolución espacio-temporal extremadamente buena proporcionada por microscopía confocal.
Introducción
El problema de medir las ondas rápidas de calcio en las células excitables es uno de los aspectos más importantes y desafiantes del estudio de la transmisión de señales en los sistemas nerviosos central y periférico. Los iones de calcio juegan un papel importante en el desencadenamiento de la liberación de neurotransmisores, la plasticidad sináptica y la modulación de la actividad de varias proteínas intracelulares 1,2,3,4,5. El estudio de la señalización del calcio también es importante para encontrar form....
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Protocolo
Los experimentos se realizaron en preparaciones nerviosas-musculares aisladas de elevador del auris largo (m. LAL) de los ratones BALB/C (20-23 g, 2-3 meses de edad)41. Los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con las directrices para el uso de animales de laboratorio de la Universidad Federal de Kazán y la Universidad Médica de Kazán, de conformidad con la Guía de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio. El protocolo experimental cumplió con los requisitos de la Directiva 86/609/CEE del Consejo de las Comunidades Europeas y fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Kazán.
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Resultados
Después de cargar la preparación con colorante de acuerdo con la técnica presentada, la mayoría de las sinapsis ubicadas cerca del muñón nervioso tenían un nivel suficiente de fluorescencia (ver Figura 2). Después de cargar la preparación con el tinte y aplicar el método descrito de registro y procesamiento de imágenes, se obtuvieron transitorios de calcio con la resolución espacial y temporal deseada (ver Figura 4). El transitorio de calcio se ha recuperado med.......
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Discusión
En este artículo se presenta el método para cargar colorante sensible al Ca2+ en terminaciones nerviosas de ratón a través del muñón nervioso y para registrar un transitorio rápido de calcio utilizando un microscopio confocal. Como resultado de la implementación de este método de carga, la mayoría de las sinapsis ubicadas cerca del muñón nervioso tenían un nivel suficiente de fluorescencia para permitir el registro de la entrada de calcio en las terminaciones nerviosas en respuesta a la estimulación de baja fr.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los estudios de fluorescencia de este trabajo se llevaron a cabo con el apoyo financiero de la Subvención de la Fundación Rusa de Ciencias (proyecto No. 19-15-00329). El método fue desarrollado bajo la financiación de la asignación del gobierno para FRC Kazan Scientific Center de RAS АААА-А18-118022790083-9. La investigación se desarrolló con el uso del equipo del Centro Federal de Investigación "Kazan Scientific Center of RAS". Los autores desean agradecer al Dr. Victor I. Ilyin por la lectura crítica de este manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Vidrio capilar | Clark Electromedical instruments, Reino Unido | GC150-10 | |
| Sistema de microscopio confocal y multifotónico Leica TCS SP5 MP | Leica Microsystems , Heidelberg, Alemania | ||
| Tirador de micropipetas Flaming/Brown P 97 | Sutter Instrument, EE. UU. | P-97 | |
| Regulador de flujo | KD Medical GmbH Productos hospitalarios, Alemania | KD REG | Set de infusión desechable con regulador de caudal |
| HEPES | Sigma-Aldrich, EE. UU. | H0887 | 100mL |
| Sistema de iluminación Leica CLS 150X | Leica Microsystems, Alemania | ||
| ImageJ | Institutos Nacionales de Salud, EE. UU. | ||
| http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html Las AF software | Leica Microsystems, Heidelberg, Alemania | ||
| Software Las X | Leica Microsystems, Heidelberg, Alemania | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
| Soporte magnético con tubo de succión | BIOSCIENCE TOOLS, EE. UU. | MTH-S | |
| Microspin FV 2400 | Biosan, Letonia | BS-010201-AAA | |
| Pines de Minutien | Fine Science Tools, Canadá | 26002-20 | |
| Multi-spin MSC 3000 | Biosan, Letonia | BS-010205-AAN | |
| Oregon Green 488 BAPTA-1 sal pentapotásica | Sondas moleculares, EE. UU | O6806 | 500 μ g |
| Pipeta Biohit, Rusia | 720210 | 0.5-10 µ L | |
| Punta de | pipeta Biohit, Rusia | 781349 | 10 y micro; L |
| Plastilina | productor | ||
| Agujas hipodérmicas de un solo uso | Bbraun | 100 Sterican | 0.4× 40 mm |
| Programa de hoja de cálculo | Microsoft, EE. UU. | Microsoft Office Excel | |
| Microscopio estereoscópico, Leica M80 | Leica Microsystems, Alemania | ||
| Electrodo de succión | Kazakov A. ELECTRODO DE SUCCIÓN SIMPLE PARA LA ESTIMULACIÓN ELÉCTRICA DE OBJETOS BIOLÓGICOS / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // Revista internacional de investigación. - 2015. - No. 9 (40) Parte 3. - Págs. 13-16. | http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/ | |
| Sylgard 184 elastómero | Dow Corning, EE. UU | ||
| . Jeringa | Productor | 0,5 mL | |
| Jeringa | Productor | 60 mL |
Referencias
- Llinas, R., Steinberg, I. Z., Walton, K. Presynaptic calcium currents and their relation to synaptic transmission: voltage clamp study in squid giant synapse and theoretical model for the calcium gate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (8), 2918-2922 (1976).
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Reimpresiones y permisos
