Análisis del modelo de ratón de la enfermedad de Parkinson inducido por vectores virales adenoasociados que codifican la α-sinucleína humana

Después de la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson es la segunda enfermedad neurodegenerativa más prevalente en todo el mundo. Las neuronas primarias afectadas en la enfermedad de Parkinson son las de la vía nigrostriatal, que producen dopamina y controlan el movimiento voluntario. Como consecuencia, el síntoma más característico asociado a este trastorno es la discapacidad motora. Esta patología también implica la deposición de agregados de proteínas en el cerebro, que están compuestos principalmente de α-sinucleína (αSyn)¹, una proteína citosólica asociada a terminales presinápticos. La evidencia ha demostrado que la generación de inclusiones patogénicas de αSyn se desencadena por un plegamiento incorrecto o por algunas modificaciones post-traduccionales de esta proteína².

En particular, se ha establecido una estrecha relación entre la patología αSyn y la pérdida de neuronas dopaminérgicas de la vía nigrostriatal en la enfermedad de Parkinson humana y modelos animales ^3,4. Comprender cómo se generan los agregados αSyn y cómo inducen la muerte neuronal representa un desafío significativo en el campo. Un grupo creciente de estudios ha demostrado que, al aumentar el estrés oxidativo, la disfunción mitocondrial es una de las principales causas de la generación de agregados αSyn². De hecho, varios genes asociados con el riesgo de enfermedad de Parkinson codifican proteínas involucradas en la función, morfología y dinámica mitocondrial ^5,6. Además, la disfunción lisosomal, que resulta en la acumulación de mitocondrias disfuncionales y αSyn mal plegadas, constituye otro evento importante que promueve la generación de agregados αSyn⁷.

La evidencia emergente ha indicado que, una vez que los agregados de αSyn se depositan en el cerebro, estas proteínas patógenas estimulan receptores tipo toll (TLR) en la microglía, desencadenando así la activación microglial y un ambiente inflamatorio inicial en la sustancia negra (SN)^8,9. Además, la evidencia indica que los agregados de αSyn son capturados y presentados por las células presentadoras de antígenos a las células T, induciendo una respuesta inmune adaptativa específica a αSyn^10,11. Estas células T específicas de αSyn se infiltran posteriormente en el cerebro y son reestimuladas por microglía activada, promoviendo así la secreción de factores neurotóxicos que evocan la muerte neuronal ^9,10. Curiosamente, varias líneas de evidencia han sugerido que los agregados αSyn se generan primero en el sistema nervioso entérico y luego se transportan a través del nervio vago hasta el tronco encefálico¹².

Varios modelos animales de la enfermedad de Parkinson se han utilizado durante muchos años, incluidos los inducidos por la administración de sustancias neurotóxicas (es decir, 6-hidroxidopamina, paraquat, rotenona, 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina) y aquellos que involucran condiciones genéticas (es decir, mutante α-sinucleína, quinasa de repetición 2 rica en leucina mutante)¹³ . A pesar de que los modelos que involucran neurodegeneración inducida por neurotoxinas replican algunos aspectos de la enfermedad de Parkinson, ninguno de ellos recapitula todos los aspectos esenciales de la enfermedad o no es progresivo¹³. Por otro lado, aunque los modelos genéticos de ratón que implican la expresión de versiones mutantes de la quinasa 2 repetida rica en leucina, las versiones mutantes de α-sinucleína o la sobreexpresión de α-sinucleína humana de tipo salvaje dan lugar a un deterioro motor y, en algunos casos, también al desarrollo de sinucleinopatía, no reproducen la neurodegeneración prominente de las neuronas dopaminérgicas nigrales, que es un aspecto esencial de la enfermedad de Parkinson^{13, 14}. Un tercer tipo de modelo animal de neurodegeneración ha logrado satisfacer la mayoría de los aspectos esenciales de la enfermedad de Parkinson, la entrega estereotáxica de vectores virales adenoasociados (AAV) que codifican la α-sinucleína humana (AAV-hαSyn)^14,15. Es importante destacar que los AAV permiten la transducción de neuronas con alta eficacia y a largo plazo en el cerebro adulto de los mamíferos. Además, se ha demostrado que la administración estereotáxica de AAV-hαSyn en el SN reproduce muchos de los aspectos esenciales de la enfermedad, incluida la patología αSyn, la activación microglial, la neurodegeneración y el deterioro motor 16,17,18,19,20. Este estudio presenta un análisis de cómo la dosis del vector viral y el tiempo después de la entrega del vector viral afectan la extensión de la expresión de hαSyn, la neurodegeneración y la neuroinflamación en la vía nigrostriatal, así como el grado de deterioro motor en el modelo de ratón de la administración estereotáxica unilateral de hαSyn en el SN.

Todos los estudios se realizaron en el marco de la 8ª edición de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Los protocolos experimentales fueron aprobados por el IACUC en la Fundación Ciencia & Vida, incluidos los que involucran anestesia, dolor, angustia y eutanasia (permiso número P-035/2022).

1. La cirugía estereotáxica

1. Preparación para la cirugía (aproximadamente 1 h)
   1. Para mantener un ambiente aséptico, use ropa quirúrgica adecuada durante toda la cirugía, incluyendo cubiertas de zapatos, una máscara quirúrgica, una barrera sanitaria, guantes y una gorra quirúrgica.
   2. Rocíe etanol al 70% sobre el ratón y todo el material quirúrgico para mantener un ambiente aséptico.
   3. Para inducir la analgesia, inyecte al ratón carprofeno 5 mg/kg por vía subcutánea (s.c.) cada 12 h²¹ comenzando 1 h antes de la cirugía y continuando hasta 3 días después de la cirugía.
   4. Para anestesiar al ratón, coloque al animal en una cámara de inducción. Abra el flujo de isoflurano a una velocidad del 0,5% y luego aumente lentamente hasta un 5% durante aproximadamente 5 minutos hasta que el ratón haya perdido su reflejo de enderezamiento²².
   5. Retire al animal de la cámara de inducción. Transfiera inmediatamente al animal a un circuito sin rerespiración con un cono nasal del tamaño adecuado. Mantenga la anestesia del ratón con isoflurano al 1% durante todo el tiempo de la cirugía.
   6. Confirme que el ratón está completamente anestesiado pellizcando su cola y patas. Cuando el ratón no reacciona al pellizcar la cola y las patas, significa que el ratón está completamente anestesiado.
   7. Afeitar la cabeza del ratón con tijeras. Limpiar la piel del ratón con un hisopo de algodón con clorhexidina al 2% y eliminar todo el vello.
   8. Fije la cabeza del ratón en el marco estereotáxico.
   9. Coloque un protector corneal en ambos ojos de ratón con un hisopo de algodón. Para prevenir la inducción de estrés en otros roedores, evite la presencia de cualquier otro ratón en la sala de cirugía²³.
2. La cirugía (aproximadamente 30 min)
   1. Limpie la cabeza del ratón con tres rondas de clorhexidina al 2% seguidas de etanol al 70%. Exponer el cráneo con material quirúrgico y hacer un orificio fino con un taladro en las siguientes coordenadas: anteroposterior −2,8 mm, y mediolateral 1,4 mm con respecto a la línea medial.
   2. Coloque la aguja de una jeringa de 10 μL en el orificio y mueva la aguja dentro del cerebro lentamente hasta llegar a -7,2 mm dorsoventral con respecto a la duramadre²⁴.
   3. Deje la aguja en la posición final durante 2 minutos para permitir que el tejido se asiente un poco, y luego inyecte 1 μL de AAV5-CBA-hαSyn (AAV-hαSyn), AAV5-CBA-eGFP (AAV-GFP) o vehículo (PBS a pH 7.4; cirugía simulada) en la sustancia negra derecha a una velocidad de 0.2 μL / 30 s.
   4. Deje la aguja en la misma posición durante 5 minutos después de la administración de vectores virales y luego retírela lentamente.
3. Postoperatorio (aproximadamente 5 min)
   1. Cierre la herida con una sutura estéril trenzada de seda no absorbible.
   2. Coloque el ratón en la jaula casera precalentada colocándolo sobre un colchón eléctrico calentado (25 °C).
      NOTA: El ratón debe mantenerse solo en la jaula doméstica hasta que pueda caminar sin dificultad y la herida haya cicatrizado.

2. Determinación del rendimiento del motor mediante la prueba del haz

1. Entrenamiento (aproximadamente 15 min por ratón)
   1. Doce semanas después de la cirugía estereotáxica, evalúe el rendimiento motor utilizando una versión simplificada de la prueba de haz descrita antes^{de 25}. Para este propósito, use una viga horizontal de 25 cm de largo y 3 cm de ancho. La superficie de la viga debe cubrirse con una rejilla metálica con cuadrados de 1 cm y elevada 1 cm por encima de la viga.
   2. Tome un video del ratón atravesando el haz de la superficie de la rejilla desde un extremo hasta el extremo opuesto del haz, donde se encuentra la jaula doméstica. Entrene el ratón durante 2 días antes de la determinación del rendimiento del motor.
   3. El primer día, entrena al ratón para que camine a través de la viga cinco veces sin la rejilla.
   4. En el segundo día, entrena al ratón para que camine a través del haz en presencia de la rejilla cinco veces.
2. La prueba (aproximadamente 5 min por ratón)
   1. Al tercer día, evalúe el rendimiento del motor. Para hacer esto, cuantifique el número de errores realizados por las patas izquierdas o por las patas derechas por separado viendo los videos en modo de cámara lenta.
      NOTA: Un error se define como cuando una pata no pisa correctamente la rejilla y, por lo tanto, se hace visible en el lado de la rejilla o entre la rejilla y la superficie del haz.

3. Procesamiento de tejidos

1. Perfusión transcárdica (aproximadamente 15 min por ratón)
   1. Para anestesiar al ratón, inyecte una mezcla de ketamina (80 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) por vía intraperitoneal (i.p.) utilizando una jeringa de 1 ml y una aguja de 27 G²⁶.
   2. Una vez que el ratón esté completamente anestesiado (confirmado como en el paso 1.1.6.), abra el tórax con material quirúrgico y exponga el corazón.
   3. Luego, inserte una aguja de 21 G (haga que la punta sea plana con un taladro) en el ventrículo izquierdo del corazón.
   4. Al acoplar la aguja a una tubería, perfunda 50 ml de PBS (pH 7.4) a una velocidad de 9.5 ml / min utilizando una bomba peristáltica.
2. Fijación y crioprotección del cerebro (aproximadamente 10 minutos por cerebro)
   1. Retire el cerebro con tijeras y pinzas, y luego fíjelo por inmersión en 5 ml de paraformaldehído al 4% en PBS (pH 7.4) a 4 ° C durante 24 h.
   2. Después, coloque el cerebro fijo en 15 ml de sacarosa al 30% a 4 ° C durante 48 h.
   3. Luego, coloque el cerebro en 4 ml de solución de crioprotección (20% de glicerina y 2% de DMSO en PBS) y guarde el cerebro a -80 ° C o úselo inmediatamente en el siguiente paso.
3. Obtención de cortes cerebrales (aproximadamente 20 min por cerebro).
   NOTA: Asegúrese de que el cerebro se coloque en un criostato en una posición adecuada para hacer cortes coronales.
   1. Para obtener rodajas SN, corte el cerebro en secciones de 40 μm de espesor a partir de -2,92 mm y terminando en -3,64 mm²⁴.
   2. Cosechar cada rebanada en un pocillo (que contenga 1 ml de solución de crioprotección) de una placa de 24 pocillos siguiendo un orden anteroposterior como se describió antes 25,27,28.
   3. Para realizar análisis inmunohistoquímicos (sección 4.) e inmunofluorescencia (sección 5.) en el SN, elija seis secciones coronales de SN tomadas a intervalos uniformes (120 μm) que cubran toda la extensión rostrocaudal del núcleo (720 μm en total), como se describió antes 25,27,28.
   4. Para obtener rebanadas estriatales, corte el cerebro en secciones de 40 μm de espesor a partir de +1.34 mm y terminando en -0.26 mm²⁴.
   5. Cosechar cada rebanada en un criotubo de 2 ml (que contiene 1 ml de solución de crioprotección) siguiendo un orden anteroposterior.
   6. Para realizar análisis inmunohistoquímicos (sección 4.) e inmunofluorescencia (sección 5.) en el cuerpo estriado, elija cinco secciones estriatales coronales tomadas a intervalos uniformes (320 μm) que cubran toda la extensión rostrocaudal del núcleo (1600 μm en total).

4. Análisis inmunohistoquímico para cuantificar neuronas dopaminérgicas y microgliosis (aproximadamente 2 días)

1. Para el análisis inmunohistoquímico de rebanadas estriatales o nigrales, coloque el conjunto de cinco (estriado) o seis (SN) cortes del mismo cerebro en un pocillo de una placa de 24 pocillos.
2. Lavar las secciones 3x con 1 mL de PBS y luego incubar con 0.5 mL de 0.03% H₂O₂ en metanol a temperatura ambiente y con agitación durante 30 min para inactivar la actividad endógena de la peroxidasa.
3. Lavar las secciones 3x con 1 ml de PBS e incubar con 0,5 ml de solución bloqueadora (4% de suero de cabra, 0,05% de Tritón X-100 y 4% de BSA en PBS) a temperatura ambiente y con agitación durante 40 min.
4. Después, incubar con 0,5 ml de solución bloqueadora que contenga el anticuerpo primario (anti-tirosina hidroxilasa de conejo [TH] pAb diluido 1:1000 [ver Tabla 1]; o anticuerpo anti-Iba1 de conejo diluido 1:1000) a temperatura ambiente y con agitación durante la noche.
5. Lavar las secciones 3x con 1 mL de PBS e incubar con 0,5 mL de solución bloqueadora que contenga pAb anti-conejo de cabra biotinilada (1:500, ver Tabla 1) a temperatura ambiente y con agitación durante 2 h.
6. A continuación, lavar las secciones 3x con 1 ml de PBS e incubar con 0,5 ml de avidina conjugada con peroxidasa (1:5000, ver Tabla 1) en solución de bloqueo a temperatura ambiente y con agitación durante 90 min.
7. Lavar las secciones 3x con 1 ml de PBS e incubar con 0,5 ml de solución de sustrato (diaminobenzidina al 0,05% en tampón H₂O₂/Trizma-HCl al pH 7,6). Use guantes y una bata de laboratorio para este paso, ya que la diaminobencidina es un carcinógeno potencial.
8. Cuando la tinción específica sea evidente (típicamente 30 segundos para TH y 5 min para Iba1), saque la solución de sustrato y lave las secciones 3x con 1 ml de PBS a temperatura ambiente y con agitación. Realizar siempre la inmunotinción de lonchas de todos los cerebros incluidos en el mismo experimento de forma simultánea.
   NOTA: La tinción específica de TH es evidente cuando aparece la inmunotinción de TH en el área del SN, que muestra una forma característica en el cerebro. La marca específica de Iba1 se determina cuando aparece la inmunotinción de Iba1 en cortes cerebrales de control con formas microgliales típicas, que se confirman tras la observación al microscopio. De esta manera, se determina el tiempo exacto de exposición del sustrato para el análisis de IHC para cada experimento.
9. Monte las secciones cerebrales en portaobjetos de vidrio utilizando una solución de gelatina al 0,2% en 0,05 M Tris (pH 7,6). Coloque cada juego de cinco (estriado) o seis (SN) rebanadas obtenidas del mismo cerebro en orden rostrocaudal en el mismo portaobjetos de vidrio.
10. Cuantificar el número de neuronas TH⁺ en el SN.
    1. Para cuantificar las neuronas TH⁺ en el SN, adquiera fotos de las seis rebanadas con un aumento de 20x utilizando un microscopio de campo brillante, como se describió antes^de 25,27,28. Utilice el siguiente ajuste de color: temperatura de color 3200 K, rojo cian-40%, verde magenta 39%, amarillo-azul 54%, gamma 0.5, contraste 37, brillo 13, saturación 5.
    2. Utilizando el software Image J, seleccione el perímetro del SN pars compacta en el hemisferio analizado. Evite la selección de neuronas TH⁺ del área tegmental ventral (VTA).
    3. Después, pida al software que calcule el área seleccionada (típicamente 0.04-0.07 mm² / hemisferio, dependiendo de la posición rostrocaudal). Luego, usando la herramienta multipunto, etiquete cada neurona TH ⁺ con un punto.
    4. Usando la herramienta de puntos, pídale al software que cuente el número total de puntos. Con el número de puntos totales (neuronas TH⁺ ) y el área del SNpc, calcule la densidad de las neuronas TH⁺ /mm².
    5. Repita el mismo cálculo en ambos hemisferios en las seis rebanadas de SN y luego calcule la media de neuronas TH ⁺ / mm² en los lados ipsilateral y contralateral.
11. Cuantificar el número de microglía activada en el cuerpo estriado
    1. Para cuantificar la microglía activada en el cuerpo estriado, adquiera dos fotos en cada hemisferio para las cinco rodajas estriatales con un aumento de 20x utilizando un microscopio de campo brillante y los mismos ajustes indicados en el paso 4.10.1. Usando el software Image J, en cada foto (que muestra un área de 660 μm x 877 μm), etiquete con un punto cada celda expresando alta intensidad Iba1 y forma ameboide utilizando la herramienta multipunto. Usando la herramienta de puntos, pídale al software que cuente el número total de puntos.
    2. Con el número de puntos totales y el área de la foto, calcule la densidad de la microglía activada (células^altas Iba1 / mm²) como se realizó antes^{de 29}.

Tabla 1: Diluciones de anticuerpos. N/A, no aplicable. *, Solo se especifica si hay reactividades con ratón, rata y humano, independientemente de la reactividad con otras especies. **, Se especifica una sola dilución o un rango de dilución.

5. Análisis de inmunofluorescencia para evaluar la infiltración de células T en la vía nigrostriatal (aproximadamente 2 días)

1. Para el análisis de inmunofluorescencia de hαSyn o TH/GFP en rodajas estriatales o nigrales, junte el conjunto de cinco (estriado) o seis (SN) rebanadas del mismo cerebro en un pocillo de una placa de 24 pocillos.
   1. Lavar las secciones 3x con 1 mL de PBS y luego incubar con 0.5 mL de solución de bloqueo (0.3% Triton X-100, 0.05% tween20 y 5% BSA en PBS) a temperatura ambiente y con agitación durante 40 min.
   2. Después, incubar con 0,5 ml de solución bloqueadora que contenga el anticuerpo primario (conejo anti-TH pAb diluido 1:500; o anticuerpo anti-hαSyn de conejo diluido 1:150, ver Tabla 1) a temperatura ambiente y con agitación durante la noche.
2. Lavar las secciones 3x con 1 ml de PBS e incubar con 0,5 ml de solución bloqueadora que contenga anticuerpo secundario anti-conejo acoplado a AlexaFluor546 (1:500, ver Tabla 1) y 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; 1:1000) a temperatura ambiente y con agitación durante 2 h. Luego, lave las secciones 3x con 1 ml de PBS.
3. Monte las secciones cerebrales en diapositivas de vidrio como se describió anteriormente (paso 4.9.). Las imágenes se adquirieron con un microscopio de fluorescencia invertido acoplado a una unidad de fuente de alimentación.
4. Para el análisis de inmunofluorescencia de TH/CD4/GFP(Foxp3) en rodajas de nigral, coloque el conjunto de seis rebanadas (SN) del mismo cerebro en un pocillo de una placa de 24 pocillos. Lavar las secciones 3x con 1 mL de PBS y luego incubar con 0.5 mL de solución bloqueadora (0.5% Triton X-100, 0.5% gelatina de piel de pescado en PBS) a temperatura ambiente y con agitación durante 2 h.
5. Incubar con 0,5 ml de solución bloqueadora que contenga los anticuerpos primarios conejo anti-TH pAb (1:200, ver Tabla 1) y anti-CD4 de rata (1:250) a 4 °C y con agitación durante la noche.
6. Lavar las secciones 3x con 1 mL de PBS e incubar con 0,5 mL de solución de bloqueo que contenga anti-conejo acoplado a AlexaFluor 647 (1:500, ver Tabla 1) y anti-rata acoplado a AlexaFluor 546 (1:500) a temperatura ambiente y con agitación durante 2 h. Luego, lave las secciones 3x con 1 ml de PBS.
7. Coloque cada juego de seis rebanadas (SN) obtenidas del mismo cerebro en orden rostrocaudal en el mismo portaobjetos de vidrio y móntelas usando Fluoromount G. Adquiera imágenes usando un microscopio Leica DMi8. Utilice los ajustes del microscopio confocal indicados en la Tabla 2 para obtener imágenes del análisis de inmunofluorescencia.

Tabla 2: Ajustes de microscopio confocal utilizados para la adquisición de imágenes a partir del análisis de inmunofluorescencia.

6. Análisis estadístico

1. Para comparar los datos obtenidos de los lados ipsilateral y contralateral, use una prueba t de Student de dos colas emparejada.
2. Para comparar los datos obtenidos de ratones que recibieron AAV-hαSyn y de ratones que recibieron AAV-GFP o cirugía simulada, use una prueba t de Student de dos colas sin aparear. Considere diferencias significativas cuando los valores de P < 0,05.

Validar la correcta entrega de vectores AAV en las neuronas dopaminérgicas de la vía nigrostriatal
Para estudiar los procesos de neuroinflamación, neurodegeneración y deterioro motor promovido por la patología de la sinucleína, se utilizó un modelo de ratón de la enfermedad de Parkinson inducida por la administración estereotáxica unilateral de AAV que codifica hαSyn en el SN 16,17,30,31 (ver el diseño experimental en figura suplementaria 1 ). Para validar la correcta entrega de vectores AAV en las neuronas dopaminérgicas de la vía nigrostriatal, se inyectó AAV que codifica GFP (AAV-GFP) en el SN, y 12 semanas después, se analizó la fluorescencia GFP y la inmunorreactividad tirosina hidroxilasa (TH) en el SN y el cuerpo estriado por inmunofluorescencia. La fluorescencia asociada a GFP se observó exclusivamente en el lado ipsilateral, y hubo una colocalización significativa con inmunorreactividad TH tanto en el SN como en el estriado, lo que indica la correcta entrega de vectores AAV en las neuronas dopaminérgicas de la vía nigrostriatal (Figura 1).

Figura 1: Análisis de la administración de AAV-GFP en la vía nigrostriatal. Los ratones recibieron AAV-GFP (1 x 1010 vg / ratón) y 12 semanas después fueron sacrificados, y TH se inmunoteñó en (A) el SN (las barras de escala son 118 μm) y (B) el cuerpo estriado (las barras de escala son 100 μm). La fluorescencia asociada a TH y GFP se analizó mediante microscopía de epifluorescencia. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Se muestran imágenes representativas de tinción combinada o simple de TH (rojo), GFP (verde) y DAPI (azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Establecimiento de la dosis del vector viral administrado para inducir neurodegeneración y deterioro motor en el modelo de ratón de la enfermedad de Parkinson inducida por AAV-hαSyn
Para probar la dosis de AAV-hαSyn requerida para inducir una sobreexpresión significativa de hαSyn que promueve la neurodegeneración de las neuronas dopaminérgicas nigral, se inyectaron diferentes dosis (1 x 108 genomas virales [vg]/ratón, 1 x 109 vg/ratón, o 1 x 1010 vg /ratón) de AAV-hαSyn, y 12 semanas después, se evaluó la inmunorreactividad hαSyn y el grado de inmunorreactividad TH en la vía nigrostriatal. Aunque la inmunorreactividad hαSyn fue evidente con todas las dosis probadas en el SN (Figura 2), solo los ratones que recibieron 1 x 1010 vg/ratón presentaron inmunorreactividad hαSyn evidente en el cuerpo estriado (Figura 3). Además, los ratones que recibieron 1 x10 10 vg / ratón de AAV-hαSyn mostraron una pérdida significativa de neuronas dopaminérgicas en el SN (Figura 4A, B). Aunque los ratones que recibieron 1 x10 10 vg/ratón de AAV-GFP mostraron un bajo grado (~20%) de pérdida neuronal (Figura 4A, B), los ratones que recibieron la misma dosis de AAV-hαSyn presentaron un grado significativamente mayor de neurodegeneración de neuronas dopaminérgicas nigral (Figura 4C). En consecuencia, se realizaron más experimentos utilizando 1 x 1010 vg / ratón de AAV-hαSyn. Además, se determinó el grado de deterioro motor en ratones que recibieron diferentes dosis de AAV-hαSyn mediante el uso de la prueba de haz (Figura 5A), como se describió antes25. Se detectó una reducción significativa en el rendimiento del motor exclusivamente con 1 x10 10 vg/ratón de AAV-hαSyn en la prueba de haz tanto al comparar el número de errores cometidos por las almohadillas derecha e izquierda (Figura 5B) como al comparar el número total de errores de ratones que recibieron AAV-hαSyn en comparación con ratones que recibieron el vector de control AAV-GFP (Figura 5C). En consecuencia, se realizaron más experimentos utilizando 1 x 1010 vg / ratón de AAV-hαSyn.

Figura 2: Análisis de la expresión de α-sinucleína humana en el SN de ratones tratados con diferentes dosis de AAV-hαSyn. Los ratones recibieron AAV-hαSyn en (A) 1 x 1010 vg/ratón, (B) 1 x 109 vg/ratón, o (C) 1 x 108 vg/ratón y 12 semanas después fueron sacrificados, y la expresión de hαSyn se analizó por inmunofluorescencia en el SN mediante microscopía de epifluorescencia. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Se muestran imágenes representativas de tinción combinada o simple de hαSyn (rojo) o DAPI (azul). Las barras de escala son de 118 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Análisis de la expresión de α-sinucleína humana en el cuerpo estriado de ratones tratados con diferentes dosis de AAV-hαSyn. Los ratones recibieron AAV-hαSyn en (A) 1 x 1010 vg /ratón, (B) 1 x 109 vg/ratón, o (C) 1 x 108 vg/ratón) y 12 semanas después fueron sacrificados, y la expresión de hαSyn se analizó por inmunofluorescencia en el cuerpo estriado mediante microscopía de epifluorescencia. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Se muestran imágenes representativas de tinción combinada o simple de hαSyn (rojo) o DAPI (azul). Las barras de escala son de 100 μm. El inserto en la esquina superior derecha de las imágenes combinadas muestra un área de interés en un aumento más alto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Pérdida de neuronas dopaminérgicas del SN en ratones tratados con diferentes dosis de AAV-hαSyn o vector control. Los ratones recibieron AAV-hαSyn (1 x10 10 vg/ratón, 1 x 109 vg/ratón, o 1 x 108 vg/ratón) o AAV-GFP (1 x 1010 vg/ratón) y 12 semanas después fueron sacrificados, y la TH fue analizada en el SNpc por inmunohistoquímica. (A) Imágenes representativas. Barras de escala, 100 μm. (B,C) La densidad de neuronas se cuantificó como el número de neuronas TH+/mm2. Los datos representan la media ± SEM. n = 3-8 ratones por grupo. (B) Se realizó una comparación de los lados ipsilateral con los contralaterales utilizando la prueba t de Student emparejada de dos colas. (C) Se realizó una comparación de los lados ipsilaterales de ratones que recibieron1 x 10 10 vg/ratón de AAV-hαSyn o AAV-GFP. (B,C) Mientras que las barras blancas indican la cuantificación de las neuronas TH+ en el lado ipsilateral de los ratones que reciben AAV-hαSyn, las barras verdes indican la cuantificación de las neuronas TH+ en el lado ipsilateral de los ratones que reciben AAV-GFP. Las barras grises indican la cuantificación de las neuronas TH+ en el lado contralateral del grupo correspondiente. Las comparaciones se realizaron mediante una prueba t de Student de dos colas sin aparear. *p < 0,05; **p < 0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Análisis del rendimiento motor en ratones tratados con diferentes dosis de AAV-hαSyn. Los ratones recibieron diferentes dosis (1 x 1010 vg / ratón, 1 x 109 vg / ratón, o 1 x 108 vg / ratón) de AAV-hαSyn o AAV-GFP, y 12 semanas después, el rendimiento del motor se evaluó mediante la prueba de haz. (A) Imagen de un ratón caminando sobre la viga. (B) El número de errores cometidos por miembros izquierdos (contralaterales) versus miembros derechos (ipsilaterales) se cuantificó en los grupos de ratones que recibieron AAV-hαSyn. (C) Se comparó el número total de errores entre diferentes grupos experimentales que recibieron la misma dosis de AAV-hαSyn o AAV-GFP. Los datos representan la media ± SEM. n = 3-5 ratones por grupo. Las comparaciones fueron realizadas por (B) una prueba t de Student de dos colas emparejada o por (C) una prueba t de Student de dos colas no emparejada. *p < 0,05; **p < 0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Establecimiento de la cinética del modelo de enfermedad de Parkinson inducido por AAV-αSyn
Después de determinar la dosis adecuada de AAV-hαSyn utilizada para inducir un nivel significativo de neurodegeneración y deterioro motor, se realizaron experimentos para definir el inicio de la sobreexpresión de hαSyn. Para este propósito, los ratones fueron tratados con 1 x 1010 vg / ratón de AAV-hαSyn o cirugía simulada. El grado de expresión de hαSyn se analizó en el SN una vez por semana durante las semanas 2-5 después de la cirugía estereotáxica (ver el diseño experimental en la Figura Suplementaria 2). Los resultados muestran que, a pesar de que la expresión de hαSyn se detectó en niveles bajos tan pronto como 2 semanas después de la cirugía, los grupos de hαSyn aparecieron en la semana 5 después de la cirugía estereotáxica (Figura 6).

Figura 6: Análisis del curso temporal de la expresión de α-sinucleína humana en el SN de ratones tratados con AAV-hαSyn. Los ratones recibieron AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/ratón) o simplemente la cirugía estereotáxica simulada, y la expresión de hαSyn en el SN se analizó (A) 2 semanas, (B) 3 semanas, (C) 4 semanas, o (D) 5 semanas después mediante inmunofluorescencia mediante microscopía de epifluorescencia. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Se muestran imágenes representativas de tinción combinada o simple de hαSyn (rojo) o DAPI (azul). Barras de escala, 100 μm. El inserto en la esquina superior derecha de las imágenes combinadas muestra un área de interés en un aumento más alto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Posteriormente, se realizaron experimentos para determinar los puntos de tiempo adecuados para analizar la neuroinflamación y la infiltración de células T en el sistema nervioso central (SNC) después de la administración estereotáxica de AAV-hαSyn. Para determinar el pico de activación microglial después del tratamiento de ratones con AAV-hαSyn, se evaluó la extensión de las células que expresan altos niveles de Iba1 en el cuerpo estriado una vez por semana durante las semanas 2-15 después de la cirugía estereotáxica. Los resultados muestran un aumento significativo en la activación microglial del lado ipsilateral en comparación con el lado contralateral de ratones 15 semanas después del tratamiento con AAV-hαSyn (Figura 7). El número de células Treg (CD4+ Foxp3+) infiltradas en el SNpc también se evaluó en diferentes puntos temporales después de la administración estereotáxica de AAV-hαSyn por inmunofluorescencia seguida de la observación de microscopía confocal. Los resultados muestran que el pico de infiltración de Treg en el SNpc fue a las 11 semanas después de la cirugía, mientras que la extensión de Treg infiltrándose en esta área del cerebro fue menor en la semana 8 o la semana 13 después de la cirugía (Figura 8). No se detectaron linfocitos T CD4+ infiltrados en el cuerpo estriado (datos no mostrados). En conjunto, estos resultados indican que, utilizando 1 x 1010 vg/ratón de AAV-hαSyn, el punto de tiempo más adecuado para analizar la neuroinflamación es la semana 15 después de la cirugía estereotáxica, mientras que un punto de tiempo adecuado para analizar la infiltración de células T en el SNC parece ser la semana 11 después del tratamiento con AAV-hαSyn.

Figura 7: Análisis del curso temporal de la activación microglial en ratones inoculados con AAV-hαSyn. Los ratones recibieron AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/ratón), y la activación microglial se evaluó mediante análisis inmunohistoquímico de Iba1 en el cuerpo estriado en diferentes puntos temporales después de la cirugía. (A) Se muestran imágenes generales representativas del análisis inmunohistoquímico de Iba1 de ratones sacrificados 5 semanas, 10 semanas o 15 semanas después de la inoculación con AAV-hαSyn. Barras de escala, 110 μm. (B) La densidad de la microglía activada se cuantificó como el número de células que expresan altos niveles de Iba1 y forma ameboide por área. Los datos representan la media ± SEM. n = 3 ratones por grupo. Se utilizó una prueba t de Student pareada de dos colas para determinar las diferencias estadísticas entre iba1 ipsilateral y contralateral en cada grupo. *p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Análisis del curso temporal de la infiltración de linfocitos T CD4+ en el SN de ratones inoculados con AAV-hαSyn. Los ratones reporteros Foxp3gfp recibieron AAV-hαSyn (1 x 1010 vg/ ratón). La presencia de células T CD4+ que expresan Foxp3 y la presencia de neuronas TH+ se analizaron en diferentes puntos temporales (semana 8, semana 11 y semana 13 después de la cirugía) en el SN por inmunofluorescencia. (A) Se muestran imágenes representativas para la inmunotinción única o la fusión. Barras de escala, 100 μm. (B) Se cuantificó el número de células T CD4+ Foxp3+ por área en el SN. Los datos representan el SEM medio ± de 3 ratones por grupo. *p<0.05, células T de Foxp3+ CD4+ ipsilaterales versus contralaterales mediante la prueba t de Student de dos colas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Diseño experimental para evaluar el efecto de diferentes dosis de vectores AAV sobre la patología de la sinucleína, la neurodegeneración y el deterioro motor. Los ratones machos C57BL/6 de tipo salvaje fueron anestesiados y recibieron inoculación estereotáxica de diferentes dosis (1 x 10 10 vg/ratón, 1 x 109 vg/ratón, o 1 x 108 vg/ratón) de AAV codificando α-sinucleína humana (AAV-hαSyn) o eGFP (AAV-GFP) bajo el control del promotor CBA en la sustancia negra derecha (SN). Después de 12 semanas, la expresión de GFP y hαSyn en el SN y el cuerpo estriado (Str) se evaluaron por inmunofluorescencia (IF), las células de tirosina hidroxilasa positiva (TH +) se cuantificaron mediante inmunohistoquímica (IHC) en el SN, y el rendimiento motor se evaluó mediante la prueba de haz. El número de ratones en cada grupo experimental se indica entre paréntesis. * indica los grupos en los que un ratón murió antes de los análisis. Cada análisis indica entre paréntesis el número de la figura del cuerpo del papel donde se muestran los resultados correspondientes. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Diseño experimental para determinar la cinética de la infiltración de células T, la neuroinflamación y la expresión de hαSyn. Los ratones reporteros Foxp3gfp fueron anestesiados y recibieron inoculación estereotáxica de AAV (1 x 10 10 vg / ratón) que codifica α-sinucleína humana (AAV-hαSyn) bajo el control del promotor CBA en la sustancia negra derecha (SN) o cirugía simulada (PBS). Los ratones fueron sacrificados en diferentes puntos temporales, y la expresión de hαSyn en el SN y el cuerpo estriado se evaluó mediante inmunofluorescencia (IF), GFP (Foxp3), CD4 y las células de tirosina hidroxilasa positiva (TH+) se cuantificaron por IF en el SN, y la expresión de Iba1 se analizó mediante inmunohistoquímica (IHC) en el cuerpo estriado (Str). Se indica el número de ratones en cada grupo experimental. Se indica el rango de puntos de tiempo incluidos en cada análisis. Cada análisis indica entre paréntesis el número de la figura del cuerpo del papel donde se muestran los resultados correspondientes. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de intereses financieros o no financieros en competencia.