Modelado de hemorragia intraventricular neonatal a través de la inyección intraventricular de hemoglobina

Resumen

Presentamos un modelo de hemorragia intraventricular neonatal utilizando crías de rata que imita la patología observada en humanos.

Resumen

La hemorragia intraventricular neonatal (Hiv) es una consecuencia común del nacimiento prematuro y conduce a lesión cerebral, hidrocefalia poshemorrágica (HPH) y déficits neurológicos de por vida. Si bien la PHH se puede tratar mediante procedimientos de derivación temporal y permanente del líquido cefalorraquídeo (LCR) (reservorio ventricular y derivación ventriculoperitoneal, respectivamente), no existen estrategias farmacológicas para prevenir o tratar la lesión cerebral inducida por la hemorragia intraventricular y la hidrocefalia. Se necesitan modelos animales para comprender mejor la fisiopatología de la hemorragia intraventricular y probar tratamientos farmacológicos. Si bien existen modelos de Hiv neonatal, aquellos que resultan confiablemente en hidrocefalia a menudo están limitados por la necesidad de inyecciones de gran volumen, lo que puede complicar el modelado de la patología o introducir variabilidad en el fenotipo clínico observado.

Estudios clínicos recientes han implicado a la hemoglobina y la ferritina en causar agrandamiento ventricular después de la hemorragia intraventricular. Aquí, desarrollamos un modelo animal sencillo que imita el fenotipo clínico de PHH utilizando inyecciones intraventriculares de pequeño volumen del producto de degradación sanguínea hemoglobina. Además de inducir de manera confiable el agrandamiento ventricular y la hidrocefalia, este modelo produce lesiones en la sustancia blanca, inflamación e infiltración de células inmunes en regiones periventriculares y de la sustancia blanca. Este artículo describe este método simple y clínicamente relevante para modelar la HPH-IVH en ratas neonatas mediante inyección intraventricular y presenta métodos para cuantificar el tamaño del ventrículo después de la inyección.

Introducción

La hemorragia intraventricular neonatal se origina en la matriz germinal, un sitio de división celular rápida que se encuentra adyacente a los ventrículos laterales del cerebro en desarrollo. Esta estructura altamente vascular es vulnerable a la inestabilidad hemodinámica relacionada con el nacimiento prematuro. La sangre se libera en los ventrículos laterales en la hemorragia de la matriz germinal (GMH)-FIV cuando los vasos sanguíneos frágiles dentro de la matriz germinal se rompen. En el caso de la Hiv de grado IV, el infarto hemorrágico periventricular también puede contribuir a la liberación de productos sanguíneos dentro del cerebro. ¹ La combinación de GMH-IVH puede causar PHH, particularmente después de hemorragia de alto grado (grados III y IV)¹. La PHH se puede tratar con la colocación de una derivación ventriculoperitoneal, pero la colocación de la derivación no revierte la lesión cerebral que puede ocurrir por la IVH. Aunque los cuidados intensivos neonatales modernos han reducido las tasas de Hiv², ^3, no existen tratamientos específicos para la lesión cerebral o hidrocefalia causada por la Hiv una vez que ha ocurrido. Una limitación significativa en el desarrollo de tratamientos preventivos para la lesión cerebral inducida por IVH y PHH es la comprensión incompleta de la fisiopatología de la IVH.

Recientemente, se ha demostrado que los niveles tempranos de LCR del producto clave de degradación sanguínea hemoglobina están asociados con el desarrollo posterior de PHH en neonatos con HVI⁴ de alto grado. Además, los niveles de LCR de proteínas de la vía de manipulación del hierro (hemoglobina, ferritina y bilirrubina) se asocian con el tamaño del ventrículo en la Hiv neonatal. Esto también se demostró en una cohorte multicéntrica de lactantes con PHH prematura, donde los niveles más altos de ferritina en el LCR ventricular se asociaron con un tamaño de ventrículo⁵ más grande.

En este estudio, desarrollamos un modelo clínicamente relevante de lesión cerebral inducida por IVH e hidrocefalia utilizando inyección de hemoglobina en los ventrículos cerebrales, lo que permite la cuantificación de la lesión cerebral y la PHH y la prueba de nuevas estrategias terapéuticas (Figura 1)^{6, 7}. Este modelo de IVH utiliza cachorros de rata neonatal, que se colocan bajo anestesia general durante la duración del procedimiento. Se realiza una incisión en la línea media en el cuero cabelludo y se utilizan coordenadas derivadas de los puntos de referencia del cráneo, el bregma o lambda, para apuntar a los ventrículos laterales para la inyección. La inyección lenta con una bomba de infusión libera hemoglobina en el ventrículo. Este protocolo es fácil de usar, versátil y puede modelar diferentes componentes de IVH que resultan en PHH.

Protocolo

NOTA: Todos los protocolos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de las instituciones. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, reactivos, equipos y software utilizados en este protocolo.

1. Preparación de soluciones de hemoglobina y LCR

1. Prepare una solución artificial estéril de LCR (aCSF) agregando 500 μL de la solución de aCSF a un microtubo de 1,5 ml y guárdela en hielo.
2. Prepare una solución estéril de hemoglobina de 150 mg/ml agregando 75 mg de hemoglobina a 500 μL de aCSF en un microtubo de 1,5 ml y guárdela en hielo.

2. Preparación del animal para inyección

1. Gire la almohadilla térmica a la configuración media para mantener la temperatura corporal de la rata.
2. Anestesiar ratas postnatales del día 4 (P4) en una cámara de inducción llena de isoflurano al 3%.
   NOTA: Confirme la anestesia suficiente usando la respuesta de pellizco del dedo del pie / cola cada 15 minutos. Monitoree la anestesia con observación visual del color del tejido, la temperatura corporal y la frecuencia respiratoria.
3. Administrar alivio del dolor con una inyección subcutánea de carprofeno de 5 mg/kg a la rata anestesiada.
4. Coloque la rata anestesiada propensa en el aparato estereotáctico con la nariz colocada en el adaptador de anestesia con un flujo constante de isoflurano al 1,5%.
5. Apriete las barras auditivas sin ruptura en el meato auditivo externo para asegurar la cabeza.
   NOTA: Aplique ungüento veterinario para mantener los ojos hidratados si los ojos están abiertos a la edad de la inyección.
6. Limpie el cabezal, alternando con aplicadores estériles con punta de algodón empapados en betadina y etanol al 70%.
   1. Toque el aplicador empapado en betadina en el centro del cuero cabelludo y extienda la betadina en círculos, moviéndose hacia afuera.
   2. Repita el paso 2.6.1.1 con el aplicador empapado en etanol.
   3. Repita los pasos 2.6.1.1 y 2.6.1.2 3x.
7. Aplique una cortina quirúrgica estéril para proteger el campo quirúrgico.
8. Usando un bisturí estéril, haga una incisión de 0,3 cm verticalmente por el centro de la cabeza para exponer el bregma del cráneo.
   NOTA: Si inyecta desde la lambda, exponga la lambda del cráneo en lugar de la bregma.
9. Use un aplicador estéril con punta de algodón para secar el área.

3. Configuración del inyector estereotáctico

1. Extraiga la solución de hemoglobina preparada en el paso 1.2 en una jeringa estéril de 0,3 ml con una aguja de 30 G y coloque la jeringa en el sistema de inyección estereotáctica.
   NOTA: Si genera condiciones de control, extraiga una solución de LCR preparada en el paso 1.1 en una jeringa estéril de 0,3 ml y proceda con el protocolo.
2. Encienda la interfaz del inyector estereotáctico y haga clic en el botón Configuración para ingresar los ajustes de volumen y velocidad de inyección.
   1. Haga clic en Volumen y establezca el volumen en 20.000 nL (20 μL).
   2. Haga clic en Velocidad de infusión y establezca la velocidad en 8.000 nL /min (8 μL/min).
3. Salga de Configuración haciendo clic en el botón Restablecer punto de venta.
4. Enjuague la punta de la aguja haciendo clic en el botón Infundir hasta que surja una pequeña gota de solución de hemoglobina en la punta de la aguja.
5. Absorba suavemente la solución de hemoglobina de la punta de la aguja con un aplicador estéril con punta de algodón.

4. Inyección animal

1. Coloque el bregma como cero en el sistema de inyección estereotáctica ajustando las posiciones mediolateral y anteroposterior de la jeringa antes de bajar la punta de la aguja de la jeringa enrojecida para tocar suavemente el cráneo en el bregma.
   NOTA: Si inyecta desde lambda, establezca lambda como cero.
2. Identifique las coordenadas de su elección.
   1. Si inyecta desde el bregma, en ratas P4 descritas aquí, use 1.5 mm lateral, 0.4 mm anterior y 2.0 mm de profundidad de bregma.
   2. Si inyecta desde la lambda, use las siguientes coordenadas para ratas P4: 1.1 mm lateral, 4.6 mm anterior y 3.3 mm de profundidad desde lambda.
3. Levante la aguja de la jeringa 1 cm por encima del cráneo para despejar el cuero cabelludo. Cuando se levante la jeringa, proceda a establecer las coordenadas mediolateral y anteroposterior.
4. Baje la aguja de la jeringa para tocar suavemente el cráneo. Compruebe que la aguja está tocando el cráneo.
5. Establezca la coordenada dorsoventral durante un período de 30 s.
   NOTA: Al ajustar la coordenada dorsoventral, la aguja perforará el cráneo. Se debe tener cuidado para asegurar que la jeringa pase a través del cráneo sin deformar el cráneo. La deformación del cráneo se evita retirando lentamente la aguja a lo largo de la coordenada dorsoventral si se produce deformación, y luego colocando la aguja de nuevo a lo largo de la misma trayectoria. Esto permite que la aguja pase a través del orificio en el cráneo con menos fuerza y sin deformación.
6. En la interfaz del inyector estereotáctico, haga clic en el botón Ejecutar para comenzar la inyección.
7. Una vez finalizada la inyección, deje la aguja de la jeringa en su lugar durante 2 minutos para minimizar el reflujo de la solución.
8. Extraiga la jeringa lentamente a lo largo de la coordenada dorsoventral durante 2 minutos hasta que la punta de la aguja esté 2 cm por encima del cuero cabelludo.
9. Gire el brazo del inyector estereotáctico lejos del campo operatorio.

5. Cuidados postoperatorios

1. Cierre el cuero cabelludo con una sutura de monofilamento 6-0. Haga una sutura interrumpida simple en el centro de la incisión de 0,3 cm.
2. Retire al cachorro de la anestesia y colóquelo en un área segura en la almohadilla térmica.
3. Devuelva el roedor a la jaula de la casa para recuperarse de la anestesia bajo el cuidado de su madre.
   NOTA: El retorno oportuno al cuidado de la presa reduce la mortalidad postoperatoria temprana.
4. Monitoree a los animales para la anestesia mediante la pérdida del reflejo de enderezamiento cada hora después de la cirugía durante 3 h.
5. Controle a los animales diariamente durante 7 días para la actividad normal, la ingesta de alimentos y el aumento de peso. Controle el sitio de la incisión para la cicatrización de heridas, el cierre y la reaparición del pelaje en el sitio de la cirugía.
   NOTA: En el raro caso de que se observen cambios neurológicos como convulsiones, depresión central o disminución del apetito durante el monitoreo, eutanasia al animal usando perfusión intravascular o dislocación cervical bajo anestesia.
6. Para prevenir la infección una vez que la sutura está cerrada y la herida está sanando, aplique triple antibiótico tópico en el sitio de la incisión.

6. Adquisición y cuantificación de MRI

1. Realice una resonancia magnética en un escáner de animales pequeños de 4.7T o 9.4T.
2. Gire la almohadilla térmica a la configuración media para mantener la temperatura corporal de la rata.
3. Inducir la anestesia en una cámara utilizando isoflurano al 3%.
   NOTA: Confirme la anestesia suficiente usando la respuesta de pellizco del dedo del pie / cola cada 15 minutos. Monitoree la anestesia con observación visual del color del tejido, la temperatura corporal y la frecuencia respiratoria.
4. Coloque la rata anestesiada propensa en la resonancia magnética con la nariz colocada en el adaptador de anestesia con un flujo constante de isoflurano al 1,5%.
5. Realice imágenes ponderadas en T2 seleccionando una secuencia de eco de giro rápido ponderada en T2.
   1. Si utiliza un escáner de resonancia magnética de 4,7 T, introduzca los siguientes parámetros en el software de resonancia magnética: tiempo de repetición = 3.000 ms, tiempo de eco = 27,50 ms, número de promedios = 3, campo de visión = 18,0 mm x 18,0 mm, matriz = 128 x 128, número de cortes axiales = 24, espesor = 0,50 mm.
   2. Si utiliza un escáner de resonancia magnética de 9,4T, introduzca los siguientes parámetros en el software de resonancia magnética: tiempo de repetición = 5.000 ms, tiempo de eco = 66,00 ms, espaciado de eco = 16,50 ms, número de promedios = 2, repeticiones = 1, factor raro = 8, campo de visión = 16,0 mm x 16,0 mm, matriz = 256 x 256, número de cortes axiales = 32, grosor = 0,50 mm.
6. Haga clic en el botón Continuar para iniciar la secuencia.

7. Procesamiento y análisis de imágenes

1. Utilice datos nativos ponderados en T2 para analizar el volumen cerebral. Utilice software de segmentación para delinear manualmente los ventrículos laterales⁶. Haga clic en Modo Pincel y seleccione el estilo de pincel cuadrado . Ajuste el tamaño del pincel a 1. Haga clic en Inspector de diseño y seleccione vista axial. Haga clic en zoom para ajustar. Coloque el cursor sobre la imagen; Trazar y llenar el espacio del ventrículo lateral.
2. Haga clic en Segmentación en la barra de herramientas | Volumen y estadísticas para ver los volúmenes segmentados.

Resultados

El éxito de la inyección se confirmó por medios radiológicos e inmunohistoquímicos. Los animales que se sometieron a inyección de hemoglobina desarrollaron ventriculomegalia aguda moderada cuando se evaluaron mediante resonancia magnética (Figura 2A), con ventrículos laterales significativamente más grandes a las 24 h y 72 h después de la inyección de hemoglobina en comparación con los animales inyectados en LCR (Figura 2B, C). Si bien no hubo d...

Discusión

Este modelo de Hiv que utiliza inyección de hemoglobina permite el estudio de la patología de la Hiv específicamente mediada por la hemoglobina. Para estudios complementarios, la hemoglobina también se puede administrar fácilmente in vitro y no confunde los ensayos bioquímicos para proteínas producidas por microglia / macrófagos que están presentes en la sangre total.

Las principales teorías de IVH-PHH incluyen la obstrucción mecánica de la circulación del LCR, la interrupción de los ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jeringa de insulina de 0,3 mL BD	Microfine + Jeringa de insulina	230-4533	jeringas de 0,3-0,5 mL funcionarán
Microtubo de 1,5 mL	USA Scientific	1615-5500	Nº de lote K194642H -3 511
4.7T Resonancia magnética	Agilent/Varian	4.7T/33 cm	Agilent/Varian Sistema de resonancia magnética DirectDrive 4.7-T (200-MHz)
6-0 sutura monofilamento	ETHICON	667G
9.4T Resonancia magnética	Bruker	BioSpec 94/20	Utilizado en este protocolo sin la criosonda
Balanza analítica	CCURIS Instruments	W3200-320
CSF artificial (aCSF)	Tocris Bioscience	3525	Nº de lote: 72A
Betadine	Purdue Products L.P.	301005-00	NDC 67618-150-09
Carprofeno (inyectable)	Zoetis Inc.	PI 4019448	Rimadyl
Ethanol	Decon Laboratories	2701
Almohadilla térmica	Sunbeam	E12107-819	UL 612A, Z-1228-001
Hemoglobina	MP Biomedicals	100714	LOTE NO. SR02321
Isoflurano	Piramal Cuidados críticos	NDC 66794-017-25
Vaporizador de isoflurano	VETEQUIP	911103
Luz para el aislamiento estereotáxico	Dolan-Jenner	industries Fiber-Lite MI-150
Bomba de jeringa de microinyección	World Precision Instruments	MICRO21	Serial 184034 T08K
software de resonancia magnética	Bruker BioSpin	Paravision 360 3.2
Oxígeno	Airgas Healthcare	UN1072	NÚMERO DE LOTE S1432080XA02
Ratas	Sprague DawleyCharles River Laboratories	Código de cepa: 001
Instrumento estereotáctico	Instrumentos KOPF Modelo	900LS Lazy Susan
Aplicador estéril con punta de algodón	Fischerbrand	23-400-118
Cuchilla quirúrgica	covetrus	#10
Triple antibiótico tópico	Pomada antibiótica triple NDC	51672-2120-1
software de cuantificación del volumen ventricular	ITK-SNAP	ITK-SNAP 4.0.0 beta