Técnica modificada para el uso de corazones murinos neonatales en la preparación de Langendorff

Resumen

El presente protocolo describe la canulación aórtica y la perfusión retrógrada del corazón murino neonatal ex vivo . Una estrategia de dos personas, utilizando un microscopio de disección y una aguja de calibre pequeño embotada, permite una canulación confiable. La cuantificación de la tensión contráctil longitudinal se logra utilizando un transductor de fuerza conectado al ápice del ventrículo izquierdo.

Resumen

El uso del corazón perfundido retrógrado ex vivo ha sido durante mucho tiempo una piedra angular de la investigación de la isquemia-reperfusión desde su desarrollo por Oskar Langendorff hace más de un siglo. Aunque esta técnica se ha aplicado a ratones en los últimos 25 años, su uso en esta especie se ha limitado a animales adultos. El desarrollo de un método exitoso para cannular consistentemente la aorta murina neonatal permitiría el estudio sistemático del corazón perfundido retrógrado aislado durante un período crítico de desarrollo cardíaco en una especie genéticamente modificable y de bajo costo. La modificación de la preparación de Langendorff permite la canulación y el establecimiento de la reperfusión en el corazón murino neonatal al tiempo que minimiza el tiempo isquémico. La optimización requiere una técnica de dos personas para permitir la canulación exitosa de la aorta de ratón recién nacido utilizando un microscopio de disección y una aguja modificada disponible comercialmente. El uso de este enfoque establecerá de manera confiable la perfusión retrógrada en 3 minutos. Debido a que la fragilidad del corazón del ratón neonatal y el tamaño de la cavidad ventricular impiden la medición directa de la presión intraventricular generada con un balón, es necesario el uso de un transductor de fuerza conectado por una sutura al ápice del ventrículo izquierdo para cuantificar la tensión contráctil longitudinal. Este método permite a los investigadores establecer con éxito una preparación aislada del corazón murino del recién nacido perfundido por flujo constante, lo que permite el estudio de la biología cardíaca del desarrollo de manera ex vivo . Es importante destacar que este modelo será una herramienta poderosa para investigar las respuestas fisiológicas y farmacológicas a la isquemia-reperfusión en el corazón neonatal.

Introducción

Las preparaciones cardíacas ex-vivo han sido un elemento básico de los estudios fisiológicos, fisiopatológicos y farmacológicos durante más de un siglo. A partir del trabajo de Elias Cyon en la década de 1860, Oskar Langendorff adaptó el modelo de rana aislada para la perfusión retrógrada, presurizando la raíz aórtica para proporcionar flujo coronario con un perfusato oxigenado¹. Usando su adaptación, Langendorff pudo demostrar una correlación entre la circulación coronaria y la función mecánica². El corazón perfundido retrógrado ex vivo, más tarde apodado epónimo la técnica de Langendorff, ha seguido s....

Protocolo

Se obtuvieron las aprobaciones del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico de la Universidad de Columbia para todos los métodos descritos. Para el estudio se utilizaron ratones machos de tipo salvaje C57Bl / 6 postnatal del día 10.

1. Preparación del aparato de Langendorff

1. Para minimizar la complejidad, utilice perfusato oxigenado no recirculante dentro del aparato de Langendorff (consulte la Tabla de materiales) a través de flujo constante o presión constante.
   1. Utilice el tampón Krebs-Henseleit (KHB), que contiene 120 mmol/L de NaCl, 4,7 mmol/L de KCl, ....

Resultados

Se utilizaron ratones P10 para modelar un punto de tiempo en la infancia humana^26,27. Quince corazones de ratón recién nacidos C57Bl/6 aislados fueron cosechados y canulados con éxito. Los corazones fueron perfundidos con un flujo continuo de 2.5 mL ^min-1 de KHB oxigenado calentado. Se midieron los parámetros metabólicos, incluida la extracción de glucosa, el consumo de oxígeno, la producción de lactato y los parámetros fisiológicos como la frecuencia .......

Discusión

El presente trabajo describe la canulación aórtica exitosa y la perfusión retrógrada en el corazón aislado de ratón recién nacido. Es importante destacar que permite a los investigadores superar las barreras que la edad murina joven y el pequeño tamaño del corazón presentaban anteriormente⁸. Si bien no es complejo en diseño, el enfoque requiere un grado significativo de habilidad técnica. Los pasos clave que inevitablemente desafiarán incluso a los investigadores más competentes técnicamente serán.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Aparato Langendorff para roedores	Radnoti	130102EZ
Catéter de 24 G	BD 381511
aguja de 26 g en jeringa de 1 mL combo	BD	309597
5-0 Sutura de seda	Ethicon	S1173
Bio Amp	ADInstruments	FE135
Bio Cable	ADInstrumentos	MLA1515
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901-100G
Agua de calefacción circulante Baño	Haake	DC10
tijera de iris curvo	Medline
	Nikon	SMZ-2B
encontrar tijeras de resorte	Kent
fuerza	INS600127 ADInstrumentos	MLT1030/D
glucosa	Sigma-Aldrich	G8270-100G
Heparina	Sagent	400-01
Tubo de alta presión	Edwards Lifesciences	50P184
pinza de vendaje para iris	Kent INS650915-4
Estilo joyero curvo pinza fina	Miltex	17-307-MLTX
KCl	Sigma-Aldrich	P3911-25G
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662-25G
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506-500G
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888-25G
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-25G
Bomba de rodillos	Gilson	Minipuls 3
tijeras de disección rectas	Kent	INS600393-G
Alambre de estimulación cardíaca temporal	Ethicon	TPW30
Transductor de fuerza de amplio rango	ADInstrumentos	MLT1030/A

26 G aguja de acero BD 305111 Microscopio de disección MDS10033Z Transductor de