Summary
Bu makalede, SARS-CoV-2 enfeksiyonuna veya aşılamasına karşı immün yanıttan kaynaklanan iki immünoglobulin izotipi (IgA, IgM veya IgG) için antikor titrelerindeki dinamik değişiklikleri izlemek için uygun bir yöntem açıklanmaktadır. Bu 'Multianalit Covid-19 İmmün Yanıt Paneli', 'çift kanallı' özelliğe sahip akış tabanlı bir multipleks okuyucu kullanılarak okunan kodlanmış mikrosferler üzerine inşa edilmiş üç dolaylı immünotahlil kullanır.
Abstract
Çoklu biyobelirteçleri uyum içinde sorgulamak için multipleks teknolojiler birkaç on yıldır mevcuttur; Bununla birlikte, aynı analit üzerindeki çoklu epitopları değerlendirme yöntemleri sınırlı kalmaktadır. Bu rapor, SARS-CoV-2 enfeksiyonuna veya aşılamasına karşı immün yanıt ile ilişkili yaygın immünoglobulin izotiplerinin (örneğin, IgA, IgM ve IgG) serolojik testi için çoklanmış bir immünoboncuk testinin geliştirilmesini ve optimizasyonunu açıklamaktadır. Analizler, çift kanal özelliğine sahip akış tabanlı, multipleks floresan okuyucu kullanılarak gerçekleştirildi. Optimizasyonlar, analit yakalama süresine, tespit antikor konsantrasyonuna ve tespit antikor inkübasyon süresine odaklanmıştır. Analitik tahlil performans özellikleri (örneğin, tahlil aralığı (kantitasyonun alt ve üst sınırları dahil); ve tahlil içi ve tahliller arası hassasiyet), 'çift kanallı' mod kullanılarak IgG / IgM veya IgA / IgM serotip kombinasyonu için birlikte oluşturulmuştur. IgG için 30 dakika, IgM için 60 dakika ve IgA için 120 dakika olan analit yakalama süreleri, çoğu uygulama için uygundu ve tahlil performansı ve verim dengesi sağladı. 30 dakika boyunca 4 μg / mL'de optimal tespit antikor inkübasyonları gözlenmiştir ve genel olarak mükemmel hassasiyet (yüzde varyans katsayısı (%CV) ≤% 20) ve gözlenen duyarlılık değerleri göz önüne alındığında, genel uygulamalar için önerilmektedir. IgG izotipinin dinamik aralığı, klinik uygulamalar için 1:500 seyreltme faktöründe sağlam titre değerlendirmelerini destekleyen her tahlil (Spike S1, Nükleokapsid ve Membran glikoproteinleri) için birkaç büyüklük sırasına yayılmıştır. Son olarak, optimize edilmiş protokol, SARS-CoV-2 aşı rejimini tamamlayan denekler (n = 4) için Spike S1 serokonversiyonun izlenmesine uygulandı. Bu kohort içinde, Spike S1 IgG seviyelerinin, ikinci doz uygulamasından sonraki 14 günde, IgM veya IgA izotiplerinden çok daha yüksek (~ 40 kat) sinyal yoğunluğunda maksimum titrelere ulaştığı gözlenmiştir. İlginçtir ki, büyük ölçüde konuya bağlı olan oldukça değişken Spike S1 IgG titre bozunma oranlarının gözlemlendiğini gözlemledik, bu da gelecekteki çalışmaların konusu olacaktır.
Introduction
Biyolojik örneklerde hastalıkla ilişkili çoklu biyobelirteçlerin eşzamanlı ölçümü, patolojik süreçlere tanımlayıcı ve öngörücü içgörüler sağlar. Enzime bağlı immünosorbent tahlilleri (ELISA'lar) gibi geleneksel tek analitli immünolojik prosedürler, hem klinik hem de araştırma ortamlarında kantitatif analizlerin temel taşı olsa da, bu tekniklerin verim, her ölçüm için gereken numune miktarı ve hastalık seyri boyunca sıklıkla iç içe geçmiş çoklu biyolojik elementlerin çalışmasını büyük ölçüde sınırlayan maliyet etkinliği ile ilgili önemli sınırlamalarıolabilir1 . Mikrosfer tabanlı çoklama teknolojisi, laboratuvar verimini artırmak, numune kıtlığını azaltmak ve maliyet tasarrufunu en üst düzeye çıkarmak için tekrarlayan testleri azaltmak için tahlilleri birleştirme kabiliyeti nedeniyle hem teşhis hem de araştırma tesisleri için vazgeçilmez bir platform haline gelmiştir 1,2,3,4. Son zamanlarda, bu çoklama gücünün daha da arttırılması, çift muhabir yeteneklerine sahip araçlarla tanıtıldı. Çift raporlayıcı özelliği, algılama için iki floresan kanal uygular ve aynı analit üzerinde birden fazla epitopun algılanmasına izin veren başka bir çoklama boyutu sağlar.
Şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2), mevcut koronavirüs hastalığı 2019 (COVID-19) pandemisinden sorumlu patojendir5. RT-PCR testi, hastalık seyrinin başlangıcında enfeksiyon doğrulaması için çok önemli olsa da, antikor titrelerinin serolojik incelemelerinin, bireylerin önceki bir maruziyet veya iyileşme ile ilgili doğru ve eksiksiz eleştirileri için zorunlu olduğu kanıtlanmıştır; bağışıklamaya bir yanıt; ve/veya Covid-19 aşılama etkinliğinin değerlendirilmesi 6,7.
Bu rapor, akış tabanlı, multipleks okuyuculu çift raporlama sistemi kullanan çoklu SARS-CoV-2 viral antijenleri için serokonversiyonun ölçülmesi için yöntemleri tanımlamaktadır. Spesifik olarak, Spike S1, Nükleokapsid ve Membran (aka Matrix) glikoproteinleri için testler içeren 3 pleks SARS-CoV-2 antijenleri paneli için iki antikor alt tipinin (IgG / IgM veya IgA / IgM olarak yapılandırılmış) eşzamanlı tespiti açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, uzunlamasına serokonversiyonun yakalanması için ideal bir girişim sağlar ve Covid-19 pandemisine karşı cephanelikte değerli bir araç sağlar.
Protocol
Tüm denekler, ORA protokolü uyarınca Rush Üniversitesi Tıp Merkezi'nin tam Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) onayı ile yazılı bilgilendirilmiş onam ile kaydedilmiştir 20101207 etik araştırma yürütülmesi için tüm kurumsal kılavuzlar gözetilmiştir. Kan, geleneksel flebotomi yoluyla lavanta vakumlayıcılarına (K2EDTA) toplandı ve önerilen protokollerle işlendi. Elde edilen plazma, değerlendirmeler yapılana kadar -80 ° C'de arşivlendi.
1. Antijen konjuge mikrosferlerin hazırlanması
- Kullanılan her şişe için benzersiz boncuk bölgelerine sahip üç farklı manyetik mikrosfer şişesi seçin, boncuk kimliğini ve lot bilgilerini kaydedin.
NOT: Her farklı mikrosfer bölgesi için aşağıdaki adımlar izlenecektir. Mikrosferler ışığa duyarlıdır ve ışığa uzun süre maruz kalmaktan korunmalıdır. Yıkama adımları sırasında, mikrosferleri rahatsız etmemeye dikkat edin. Rahatsız edilirse, ikinci bir 60 s ayrımına izin verin. - 60 s için mikrosfer stoğunu vorteks edin ve toplanmış boncukları ayırmak için kullanmadan önce 5 dakika boyunca sonikat yapın.
- 1,0 x 106 boncukları 1,5 mL düşük proteinli bağlayıcı mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
- Tüpü manyetik bir ayırıcıya yerleştirin ve 60 saniye boyunca ayırmanın gerçekleşmesine izin verin. Tüp hala manyetik ayırıcıdayken, boncuk peletini rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice çıkarın.
- Tüpü manyetik ayırıcıdan çıkarın, boncukları 100 μL HPLC sınıfı su ile yeniden askıya alın ve 30 s boyunca vorteks. Tüpü 60 s boyunca manyetik ayırıcıya geri yerleştirin ve daha sonra süpernatanı çıkarın. Bu yıkama protokolünü iki kez tekrarlayın.
- Tüpü manyetik ayırıcıdan çıkarın ve yıkanmış mikrosferleri 90 μL'de 100 mM Monobazik Sodyum Fosfat, pH 6.2 (Aktivasyon Tamponu) vorteks ile 30 s boyunca yeniden askıya alın.
- Mikrosferlere 10 μL 50 mg / mL Sulfo-NHS (Aktivasyon Tamponu ile seyreltilmiş) ekleyin ve 10 saniye boyunca yavaşça vorteks yapın. 10 μL 50 mg/mL EDC çözeltisi ekleyin (Aktivasyon Tamponu ile seyreltilmiş) ve 10 saniye boyunca yavaşça vorteks yapın. Mikrosferleri oda sıcaklığında (RT) 20 dakika boyunca her 10 dakikada bir yumuşak bir vorteks ile inkübe edin.
- LC/MS sınıfı su yerine 50 mM MES, pH 5.0 (Kaplin Tamponu) ile 1.4-1.5 yıkama adımlarını toplam iki yıkama için tekrarlayın.
- Tüpü manyetik ayırıcıdan çıkarın ve boncukları 100 μL Kaplin Tamponu ile vorteks ile 30 s boyunca yeniden askıya alın ve ardından hemen istenen miktarda protein ekleyin.
- Kaplin Arabelleği ile toplam hacmi 150 μL'ye getirin. Vorteks ile kuplaj reaksiyonunu 30 sn boyunca karıştırın ve RT'de rotasyonla 2 saat inkübe edin.
NOT: Burada tanımlanan tahliller için, konjugasyonlar aşağıdaki protein konsantrasyonları ile gerçekleştirilmiştir: Spike S1: 5 μg; Nükleokapsid: 5 μg; Membran: 12.5 μg. - LC/MS sınıfı su yerine Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)-%1 Keçi Serumu Albümini, %0,01 Polisorbat-20 (Söndürme Tamponu) ile toplam iki yıkama için 1.4 numaralı yıkama adımını tekrarlayın. Yıkanmış mikrosferleri, vorteks tarafından% 0.05 sodyum azid içeren 100 μL Söndürme Tamponunda 30 saniye boyunca yeniden askıya alın.
NOT: Başka bir prosedüre geçmeden önce boncukların en az 6 saat boyunca tamamen söndürmesine izin verin. - Otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak kurtarılan mikrosferlerin sayısını sayın. Gözlemlenen boncuk konsantrasyonunu kaydedin.
- Birleştirilmiş mikrosferleri karanlıkta 4 ° C'de soğutun.
2. Prosedürler
- Tahlil performansı (Temel protokol)
- Birleştirilmiş mikrosferleri 30 s için vorteks ile yeniden askıya alın ve ~ 60-90 s için sonikat yapın.
- Her bir boncuk kolloidinin gerekli miktarını ilgili tüpten çıkarın ve boncuk kolloidlerini yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde birleştirin.
- Tüpü manyetik bir ayırıcıya yerleştirin ve 60 saniye boyunca ayırmanın gerçekleşmesine izin verin. Tüp hala manyetik ayırıcıdayken, boncuk peletini rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice çıkarın.
- Boncukları separatörden çıkarın, boncukları 100 μL PBS-1% sığır serum albümini,% 0.01 Polisorbat-20 (Tahlil Tamponu) ve 30 s vorteks ile yeniden askıya alın. Tüpü manyetik bir ayırıcıya yerleştirin ve 60 saniye boyunca ayırmanın gerçekleşmesine izin verin. Bu yıkama protokolünü (yani, 2.1.3-2.1.4 adımları) iki kez tekrarlayın
- Her hedef için 1 μL başına 100 mikrosferlik bir nihai konsantrasyon oluşturmak için uygun hacimde bir Tahlil Tamponu ekleyerek 3 pleks çalışma mikrosfer karışımının konsantrasyonunu ayarlayın.
- Adım 2.1.5'te hazırlanan mikrosfer karışımının Aliquot 12.5 μL'si, 384 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna veya 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 25 μL.
- Plazma/serum örneklerini Tahlil Tamponunda 500 kat seyreltin. Standart numuneleri istenen titrasyona göre hazırlayın.
- Boş numune olarak 12,5 μL Tahlil Tamponu ekleyin ve seyreltilmiş numunenin veya standardın her birini, 384 kuyucuklu bir numune plakasının belirlenmiş her bir kuyucuğuna veya boş, seyreltilmiş numunenin veya standardın 25 μL'sini 96 delikli bir numune plakasının her bir kuyucuğuna ekleyin.
- Plakayı alüminyum bir conta veya folyo ile örtün ve 700 rpm'ye ayarlanmış bir plaka çalkalayıcıda RT'de 1 saat boyunca inkübe edin.
NOT: Seyreltme eğrileri için şematik Tablo 1'de verilmiştir. - Adım 2.1.11'de belirtildiği gibi Tahlil Tamponu ile 4 μg / mL'de bir anti-insan tespit antikorları (ikincil antikor çözeltileri) çözeltisi hazırlayın.
- Süper Parlak 436 (SB) / Keçi-anti-insan IgA, Fikoeritrin (PE) Konjugat 4 μg / mL'de antikorları tespit eder; veya Keçi-anti-insan IgM, SB Konjugat / Keçi-anti-insan IgG, PE Konjugat 4 μg / mL'de antikorları tespit eder.
NOT: 384 delikli bir plaka formatı için, hazırlanan ikincil antikor çözeltisinin 12,5 μL/kuyucuğu gereklidir ve 96 delikli plaka formatı için 25 μL/kuyucuk gereklidir. - Plakayı manyetik bir ayırıcıya yerleştirin, hızlı bir şekilde yıkayın ve sıvıyı kuyucuklardan çıkarmak için biyolojik tehlike kabının üzerine zorla ters çevirin. Plaka hala ters çevrilmişken, plakayı kalın bir kağıda karşı zorla dokunun.
- Her bir kuyucuğu 100 μL Tahlil Tamponu ile yıkayın ve daha önce açıklandığı gibi biyolojik tehlike kabı üzerinde kuvvetli bir şekilde ters çevirerek sıvıyı çıkarın. Toplam iki yıkama için bu adımları (2.1.12-2.1.13) tekrarlayın. Kullanılmış tüm kağıt parçalarını biyolojik tehlike kabına atın.
- 384 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 12.5 μL ikincil antikor çalışma çözeltisi veya 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 25 μL ekleyin. Plakayı alüminyum bir conta veya folyo ile örtün ve 700 rpm'ye ayarlanmış bir plaka çalkalayıcıda RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
- 2.1.12-2.1.13 yıkama adımlarını tekrarlayın
- 384 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 75 μL Tahlil Tamponu veya 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 100 μL ekleyin. Plakayı alüminyum bir conta veya folyo ile örtün ve RT'de 700 rpm'ye ayarlanmış bir plaka çalkalayıcıda 5 dakika boyunca inkübe edin.
- Sistem kılavuzuna göre cihaz analizörü aracılığıyla 60 μL'yi analiz edin.
- Numune yakalama inkübasyon süresinin optimizasyonu
- Adım 2.1.9'daki 30 dakika, 60 dakika ve 120 dakikalık kuluçka sürelerini kullanarak bölüm 2.1'deki adımları uygulayın.
NOT: Kuluçkalar, farklı plakalarla veya adım 2.1.6'da adım 2.1.9'a geçme zamanına kadar duraklatılarak gerçekleştirilebilir. İstenilen kuluçka sürelerine ulaşmak. - Üreticinin tavsiyelerine göre tahlil karışımının 60 μL'sini kullanarak analizör üzerindeki plaka okumaya devam edin.
- Adım 2.1.9'daki 30 dakika, 60 dakika ve 120 dakikalık kuluçka sürelerini kullanarak bölüm 2.1'deki adımları uygulayın.
- Sekonder antikor konsantrasyonunun optimizasyonu
- Bu prosedürü, aşağıdaki gibi değiştirilmiş sekonder antikor çalışma çözeltisindeki (Adım 2.1.10-2.1.11'de hazırlanan) reaktiflerin nihai konsantrasyonları hariç, bölüm 2.1'de ayrıntılı olarak açıklandığı şekilde uygulayın:
Keçi-anti-insan (veya tavşan) IgM, 8, 4, 2, 1 ve 0.5 μg / mL'de SB-konjugat tespit antikorları.
Keçi-anti-insan (veya tavşan) IgA, 8, 4, 2, 1 ve 0.5 μg / mL'de PE-konjugat tespit antikorları.
Keçi-anti-insan (veya tavşan) IgG, 8, 4, 2, 1 ve 0.5 μg / mL'de PE-konjugat tespit antikorları.
Keçi-anti-insan (veya tavşan) IgG, PE-konjugat / Keçi-anti-insan (veya tavşan) IgM, 8, 4, 2, 1 ve 0.5 μg / mL'de SB-konjugat tespit antikorları.
Keçi-anti-insan (veya tavşan) IgA, PE-konjugat / Keçi-anti-insan (veya tavşan) IgM, 8, 4, 2, 1 ve 0.5 μg / mL'de SB-konjugat tespit antikorları. - Üreticinin tavsiyelerine göre tahlil karışımının 60 μL'sini kullanarak analizör üzerindeki plaka okumaya devam edin.
- Bu prosedürü, aşağıdaki gibi değiştirilmiş sekonder antikor çalışma çözeltisindeki (Adım 2.1.10-2.1.11'de hazırlanan) reaktiflerin nihai konsantrasyonları hariç, bölüm 2.1'de ayrıntılı olarak açıklandığı şekilde uygulayın:
- Sekonder antikor inkübasyon süresinin optimizasyonu
- Bu prosedürü, bölüm 2.1'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, adım 2.1.14'te tanımlanan 15 dakika, 30 dakika, 60 dakika ve 120 dakikalık kuluçka süresi ile gerçekleştirin.
- Üreticinin tavsiyelerine göre tahlil karışımının 60 μL'sini kullanarak analizör üzerindeki plaka okumaya devam edin.
- Konu numunelerin optimize edilmiş çift kanallı analizlerle değerlendirilmesi
- Covid-19 aşısı (yani ikinci doz) uygulamasının tamamlanmasına bağlı olarak -21, -11, -1/0, +14, +28, +60, +90 ve +120 günlerinde denek plazma örnekleri (n = 4) toplayın.
NOT: 0. Gün, aşılamanın tamamlandığı zaman noktasını temsil eder. - Temel Protokolü (bölüm 2.1.) kullanarak tüm tahlilleri IgG/IgM veya IgA/IgM çift kanallı tahlil olarak gerçekleştirin.
- Sonuçları, her bir spesifik immünoglobulin ve tahlil için gözlenen maksimum Medyan Floresan Yoğunluğu (MFI) değerine normalleştirin.
- Covid-19 aşısı (yani ikinci doz) uygulamasının tamamlanmasına bağlı olarak -21, -11, -1/0, +14, +28, +60, +90 ve +120 günlerinde denek plazma örnekleri (n = 4) toplayın.
Representative Results
Tipik tahlil sonuçları ve performans değerlendirmeleri
İmmünoboncuk tahlilleri, Şekil 1'de sunulan panellerin her birinde gösterildiği gibi, birkaç (log) büyüklük sırasına göre değerlendirildiğinde genellikle bir sigmoidal eğri sağlar. Kullanıcı, tüm kantitasyon aralığını belirlemek için multipleks içindeki her analit için en uygun konsantrasyon aralığını deneysel olarak tanımlamalı ve aşırı uçları (kantitasyonun alt sınırına [LLOQ] veya kantitasyonun üst sınırına [ULOQ] yaklaşan alanlar) aşırı örneklememeyi sağlamalıdır. Bununla birlikte, bir tahlil için gereken gerçek aralık, hedef analitlerin biyolojik bir matristeki (yani 'bilinmeyenler') belirli bir seyreltme faktöründeki dağılımı ile belirlenir. Ayrıca, standart eğriler tipik olarak 4 veya 5 parametrik bir uyum algoritması ile doğrusal regresyon yoluyla yorumlansa da, belirli bir eğrinin doğrusal kısmı tipik olarak doğrusal (y = mx + b) bir niceleme modeli ile nicel doğrulukta en büyük güveni sağlar. Kalibrasyon eğrisini, belirli bir seyreltme faktöründe bilinmeyen bir için gözlemlenen değerlerle eşleştirmek, nicel tahlil geliştirmede amaç olmalıdır.
Bu bağlamda, Spike S1, Nükleokapsid ve Membran antikorlarının her biri için, Spike S1 ve Nucleocapsid için 1 μg / mL ile 0.000064 μg / mL ve Membran için 5 μg / mL ve Membran için 5 μg / mL ve 0.00032 μg / mL arasında değişen 1:5 seri seyreltme serisine dayanan 7 noktalı bir standart eğri değerlendirilmiştir. Her tahlil için alt tespit sınırı (LLOD), arka planından ayırt edilebilir bir sinyal veren en düşük analit konsantrasyonu olarak tanımlanmıştır. LLOD, daha önce 8,9, LLOD = LoB + 1.645 (SDdüşük konsantrasyonlu numune) olarak tanımlanan denklemle tanımlanabilir. LoB, boşluğun alt sınırıdır ve sıfır değeri beklendiğinde boşluktan üretilen "görünür" analit konsantrasyonudur ve bu denklem kullanılarak tespit edilebilir LoB = Ortalama boş + 1.645 (SDboş)8. Bu yönteme dayanarak, Spike S1 testi için MFI değerleri 134.38 ile 20191.2 arasında değişmiş, 134.38 MFI 0.00024 μg / mL'yi temsil etmekte ve LLOD olarak tanımlanmaktadır. Membran testi için pratik MFI aralığı 52.24 ila 4764.9 idi, 52.24 MFI 0.004885 μg / mL olarak hesaplandı ve LLOD olarak atandı. Nükleokapsid testi için MFI aralığı 517.9 ila 19666.34 idi ve 517.9, LLOD olan 0.00024 μg / mL olarak belirtildi. Algılamanın üst sınırı (ULOD), MFI'daki değişimin artık doğrusal olmadığı ve sinyal yanıtının doygun olduğu analit konsantrasyonu olarak tanımlanır. Bu eğrilerin tam sigmoidal karakterinin, Nükleokapsid eğrisi hariç, test edilen standartlar için gözlemlenemediğine dikkat edilmelidir. Bununla birlikte, bugüne kadar test edilen tüm bilinmeyenler için gözlemlenen MFI değerleri göz önüne alındığında (1:500 seyreltmede), her analit için sunulan eğri aralığındadır ve doğrusal regresyon yoluyla 4 veya 5 parametrik bir uyum kullanılarak kolayca ölçülür.
Tahlil hassasiyeti
Tahlil içi hassasiyet: Tahlil hassasiyetini değerlendirmek için aynı plaka üzerinde dört tahlil replikası yapıldı, %CV veya standart sapmanın bölümü olarak hesaplandı ve ortalama 100 ile çarpıldı. Bu tablolar için standart noktalar 2 ve 5 seçilmiştir ve değerler Tablo 2'de kataloglanmıştır. %CV değerleri için tipik kabul edilebilir üst sınır eşiği, bu veriler için gözlemlenen %≤20'dir, ancak Membran IgG'nin standart 2'si hariç, muhtemelen arka plan seviyelerinden kaynaklanır ve dış değerler ortadan kaldırılarak düzeltilebilir (veriler gösterilmemiştir). MFI değerlerinin <200 olduğu Membran tahlillerinde, en yaygın olarak IgA ve IgM izotipleri durumunda, okuma değerinde belirgin bir kararsızlık gözlendiği belirtilmelidir.
Tahliller arası hassasiyet: Her tahlil için üç ayrı boncuk seti grubu hazırlanmış ve Tahlil İçi hassasiyet için tanımlandığı şekilde test edilmiştir (yukarıda ve Şekil 1'de görüldüğü gibi). Tahliller arası değişkenlik, Tablo 3'te gösterildiği gibi, üç partinin her biri için ortalama sonuçlardan %CV hesaplanarak değerlendirilmiştir. Yine, kabul edilebilir bir %CV için üst sınır eşiği, test edilen tüm koşullar için mevcut olan ≤20% olarak ayarlanmıştır (yukarıda görüldüğü gibi, standart 2 Membran IgG ile benzer bir etkiyle). Net MFI değerlerindeki partiden partiye değişkenliğin, özel tahlil geliştirme sırasında aynı immünoreaktiflerin çoklu partileri içinde yaygın olarak gözlendiği belirtilmelidir. Ticari olarak elde edilen bir anti-hedef antikorundan (örneğin, tavşan anti-Spike S1) ve ardından bir anti-tür tespit antikorundan oluşturulan bir kalibrasyon eğrisinin kullanılması, analitik sonuçlarda tutarlılık sağlayabilir ve farklı zaman dilimlerinde çoklu partiler arasında karşılaştırmalara izin verebilir.
İnsan örnekleriyle tahliller arası hassasiyet: Tahliller arası hassasiyetin değerlendirilmesi, SARS-CoV-2 enfeksiyonu için ilk bildirilen semptomlardan sonraki bir ay içinde toplanan insan plazma örnekleri (n = 5) ile tekrarlandı; üç ayrı tahlil grubuyla (yani, boncuk setlerinin farklı preparatları) gerçekleştirilir. Bu sonuçlar Tablo 4'te gösterilmiştir ve tipik üst eşik sınır değeri %≤20 olan %CV değeri ile hassasiyeti göstermektedir. Spike S1, Nucleocapsid ve Membrane IgG titreleri için ortalama %CV değerleri sırasıyla %9.9 (dağılım %2.6-%18), %11.0 (dağılım %3.5-%24.4) ve %7.6 (dağılım %3.2-%12.9) olarak hesaplandı. Benzer gözlemler bu üç analitin IgM ve IgA titreleri ile yapıldı ve hepsi %CV değerleri %<20 sağladı. Bunun tek istisnası, daha sonra aykırı değer olarak dışlanan Membran proteini için Subject 5 IgM titreleriydi. İnsan denek değerlendirmeleri için hassasiyet değerleri, tavşan antikorları için yukarıda görülenlerle tutarlıdır, bu da bu testlerin, tahlil hassasiyeti üzerinde çok az etkisi olan birden fazla türdeki antijenlerin titrelerini değerlendirmek için kolayca yeniden yapılandırılabileceğini düşündürmektedir. Yukarıda belirtildiği gibi, MFI değerlerinin <200 olduğu Membran tahlilleri için gözlemlenen değerleri, en yaygın olarak IgA ve IgM izotipleri durumunda, okumada belirgin bir kararsızlık vardı.
Birincil antikor konsantrasyonu optimizasyonu
Analit 'yakalama süresi' antijen konjuge boncuklarla değerlendirildi ve plazma numunelerindeki veya standartlardaki antikorlar, birincil inkübasyonun uzunluğunu değiştirerek test edildi (30 dakika, 1 saat, 2 saat ve 4 saat). Ortalama MFI'daki fark, Şekil 2'de 30 dakikalık bir inkübasyon (minimum süre) ile 4 saatlik bir inkübasyon (maksimum süre) arasındaki belirli bir inkübasyonun bölümü ve % Maksimum olarak adlandırılan maksimum inkübasyon süresi olarak sunulmaktadır. 120 dakikadaki değerler, Spike S1, Membran ve Nükleokapsid antikorları için IgG titreleri için optimaldi, bu da hızlı birincil antikor bağlayıcı kinetik olduğunu ve tahlil verimini artırma esnekliğine izin verdiğini gösteriyordu. Bununla birlikte, IgA ve IgM (veriler gösterilmemiştir) izotipleri için daha yavaş kinetikler gözlenmiştir ve Şekil 2'de gösterildiği gibi 4 saatlik zaman noktasında pik yakalama seviyelerini göstermiştir. Genel olarak, yaklaşan tahlil doygunluğu ile üretimdeyken her tahlilin çalıştırılması için pratik zaman uygunluğu arasında bir denge vardır (verimi en üst düzeye çıkarmak için). Bununla birlikte, bu bulgularda IgG için 30 dakika, IgM için 60 dakika ve IgA için 120 dakika minimum inkübasyon sürelerinde nicel amaçlar için uygun sinyaller gözlenmiştir.
İkincil antikor konsantrasyonu optimizasyonu
Beş konsantrasyonda ikincil antikor (keçi anti-insan IgG, PE-konjuge edilmiş; keçi anti-insan IgA, PE-konjuge edilmiş; keçi anti-insan IgM, SB-konjuge edilmiş) test edildi (0.5, 1, 2, 4 ve 8 μg / mL). Tüm antikorlar, herhangi bir koşulda belirgin bir sinyal doygunluğu olmadan geniş sinyal aralıkları ortaya çıkardı, böylece konsantrasyonların herhangi biri için doğrusal bir ölçüm sağladı. Örnek olarak, 0.5 μg / mL'de SB-konjuge edilmiş keçi anti-insan IgM kullanılarak Spike S1 testinden üretilen ortalama sinyal, maksimum sinyalden (8 μg / mL) üretilen MFI'nin% 13.2'si iken, 4 μg / mL'den üretilen MFI, maksimum sinyalde ortaya çıkan MFI'nın% 73.3'ü idi. Diğer Spike S1 antikor izotiplerinden, Membran antikorlarından ve Nükleokapsid antikorlarından gelen sinyal aralığının ayrıntıları Tablo 5 ve Şekil 3'te yer almaktadır. Pratik bir nokta olarak, optimal sekonder antikor konsantrasyonu ile daha önce belirtilen 4 μg/mL sekonder antikor konsantrasyonu arasındaki birincil etki, tahlil duyarlılığı ve tahlil maliyeti açısından yansıtılmaktadır. Yani, düşük antikor titreleri veya düşük miktarlarda değerli numune ile uygulama için 8 μg / mL'lik bir ikincil antikor konsantrasyonu istenebilir, ancak bu testlerle ilişkili maliyet, daha önce tanımlanmış 4 μg / mL konsantrasyonunun kullanımından oldukça yüksek olacaktır. Tersine, yüksek antikor titrelerinin gözlenmesi gereken durumlar (Covid-19 aşıları yaşamış veya sınırlayıcı olmayan miktarlarda serumlu bireyler gibi), daha düşük miktarlarda ikincil antikorların (örneğin, 1 μg / mL) uygulanması yoluyla bir maliyet-fayda görecektir.
İkincil antikor inkübasyon optimizasyonu
İkincil antikor inkübasyon süresinin potansiyel etkisi, inkübasyonun uzunluğunu (15, 30, 60 ve 120 dakika) değiştirerek de araştırılmıştır. Genel olarak, belirli bir inkübasyonun bölümü olarak sunulan ortalama MFI ve %Max olarak adlandırılan maksimum inkübasyon süresindeki fark, 15 dakikalık bir inkübasyon (minimum süre) ile 120 dakikalık bir inkübasyon (maksimum süre) arasındaki fark, Spike S1, Membran ve Nükleokapsid antikorları için sırasıyla% 30,% 55 ve% 50'yi geçmemiştir ve sekonder antikor bağlanmasında hızlı bir kinetik adım ve tahlil verimini arttırmanın bir yolunu göstermektedir. Tablo 6 , tüm inkübasyon süreleri için sinyal değişiklikleri hakkında ayrıntılar içermektedir. Bu analizin farklı inkübasyonlarından gözlemlenen sinyallerin çizimleri Şekil 4'te gösterilmiştir.
Çift kanallı performans ve özgüllük
Her analit için, tek bir muhabir biçimi çalıştırması (yalnızca IgG-PE, yalnızca IgA-PE veya yalnızca IgM-SB), çift raporlayıcı biçiminde çalıştırıldığında aynı analit için üretilen sinyalle karşılaştırılmıştır (örneğin, çift raporlayıcı biçiminde Spike S1 IgM-SB ile birlikte yalnızca Spike S1 IgG-PE'ye karşı Spike S1 IgG-PE). Bu deneyin bulgularındaki ilişkiyi analiz etmek için iki formatta oluşturulan sinyaller için tahlil hassasiyeti (% CV olarak ifade edilir) kullanılmıştır. Spike S1 testlerinin %CV değerleri IgM, IgG ve IgA için sırasıyla %6.19, %16.4 ve %23 idi. Membran testi için, %CV değerleri IgM, IgG ve IgA için sırasıyla% 3.3,% 7.9 ve% 16.4 idi. Son olarak, Nükleokapsid testi, IgM, IgG ve IgA için sırasıyla% 8.7,% 10.3 ve% 24.2'de % CV değerleri sağlamıştır. IgM ve IgA izotipleri için gözlenen hassasiyet değerleri, daha uzun bir inkübasyon süresinin, bu immünoglobulin sınıfları arasında bilinen bağlayıcı kinetik farklılıklar nedeniyle üstün tahlil sonuçları verebileceğini düşündürmektedir. Şekil 4 , sekonder antikorların farklı konsantrasyonlarının formatları arasındaki anlaşmayı göstermektedir.
Muhabir kanallarının özgüllüğünü doğrulamak için, bir kerede tek bir muhabir kanalı test edilirken, diğer kanal spesifik olmayan sinyali (kanama etkisi) sorgulamak için boş olarak atandı. Bu bulgular, koşulların spektrumundaki yüksek özgüllük göz önüne alındığında, iki muhabir kanalı arasında ihmal edilebilir çapraz sinyal kontaminasyonu olduğunu göstermektedir. Bu bulgular Şekil 5'te gösterilmiştir. Genel olarak, kanal 1'den kanal 2'ye kadar% 6.45'lik bir girişim gözlemledik. Bununla birlikte, sinyallerin büyüklüğü hesaba katıldığında, ikili muhabir modunda aşağıdaki potansiyel girişim seviyelerini gözlemledik: Spike IgG / IgM% 71.98, Spike IgA / IgM% 28.11; %7.41'de membran IgG/ IgM, %134.61'de Membran IgA/ IgM; ve %146.03'te Nükleokapsid IgG / IgM, %112.13'te Nükleokapsid IgA/ IgM. Belirtilen konfigürasyonda bu, Spike IgM'nin IgA izotipi, IgM izotipi ile Membran IgM ve çift kanallı bir formatta gerçekleştirilmeyen nükleokapsid ölçümleri ile kombinasyon halinde ölçülmesini gerektirecektir. Bu bulgu, IgA ve IgG'nin kanal 2'de ve IgM'nin Kanal 1'de ölçüldüğü etiketleme stratejisinin tersine çevrilmesinin araştırılmasını gerektirebilir.
Covid-19 aşılaması sonrası serokonversiyon olaylarının değerlendirilmesi
IgA, IgM ve IgG'nin değerlendirilmesi üzerine dört denekte serokonversiyon, aşılama öncesinden Covid-19 aşılama serisinin tamamlanmasından dört ay sonrasına kadar değişen zaman noktalarında Spike S1 testi ile izlendi. Ölçümler çift kanallı modda gerçekleştirildi (IgG / IgM ve IgA / IgM, IgM değerleri ortalaması alındı). Tüm denekler aşıyı, standart uygulamaya göre, birinci ve ikinci dozlar arasında 21 günlük bir aralıkla 2 aşamalı bir bağışıklama olarak aldı. Her deneğin bağışıklık tepkisinin grafikleri Şekil 6A-C'de gösterilmiştir. Nükleokapsid ve Membran antijenleri için immün yanıt değerleri, değerlendirilen tüm immünoglobulinler için arka plan seviyelerinde gözlenmiştir (veriler gösterilmemiştir), bu da aşılamadan önceki dönemde belgelenmiş SARS-CoV-2 enfeksiyonu olmayan deneklerle tutarlıdır. Genel olarak, gözlenen Spike S1 IgA ve IgM değerleri, IgG izotip titrelerinden yaklaşık 40 kat daha düşüktü, pik titreler hem IgM hem de IgG izotipleri için 14 gün gibi kısa bir sürede tepeleniyordu ve IgA izotipi, ikinci dozun zamanı (0. gün) ile ikinci dozdan sonraki 14 gün arasında pik titrelere ulaşıyordu. konuya bağlı olarak. Özellikle, Spike S1 IgG titreleri, aşılamanın tamamlanmasını takip eden dört ay boyunca, konuya bağlı bir şekilde, oldukça değişken bir oranda çürümeye başlar.
Resim 1: Temsili 3 katlı standart eğriler. Üç analit için temsili standart eğriler; Spike S1 için (A) 1 μg/mL, Membran için (B) 5 μg/mL ve Nükleokapsid ve antikorlar için (C) 1 μg/mL'den başlayan 7 noktalı, 1:5 seri seyreltme eğrisi olarak sunulmaktadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Birincil antikor/numune inkübasyon süresi optimizasyonu: Birincil antikor/numunelerin (antikor yakalama) farklı inkübasyon sürelerinden üretilen ortalama MFI sinyali, 1-7 standartları için 30 dakika ile 4 saat arasında değişmektedir (Tablo 1'de belirtildiği gibi). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İkincil antikor konsantrasyonu optimizasyonları ve çift kanallı performans. Eğriler, 0.5-8 μg / mL arasında değişen, test edilmiş ikincil antikor konsantrasyonlarından üretilen ortalama MFI'yi (seride kaydedilen en yüksek değere normalleştirilmiş) göstermektedir. Her örnek, deneysel formattaki farklılıkları takdir etmek için hem tek hem de çift kanallı bir tahlil olarak gerçekleştirildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İkincil antikorların kuluçka süresi optimizasyonu, çift kanallı format. Sekonder antikorlarla inkübasyon zamanına göre gözlemlenen MFI değerlerinin (seride kaydedilen en yüksek değere normalleştirilmiş) temsili grafikleri. Deneyler (A-C) IgA/IgM veya (D-F) IgG/IgM kombinasyonları gibi çift kanallı tahliller halinde yapıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Çift kanallı tahliller için özgüllük değerlendirmeleri. Çift kanallı tahlil formatının tahlil sonuçları, kanallar arası floresan veya parazit eksikliğini göstermek için her kombinasyondan biri boş olarak belirlenmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Covid-19 aşılamasını takiben serokonversiyonun gösterimi. Covid-19 aşılaması sırasında Spike S1 antijeni için (A) IgG, (B) IgM ve (C) IgA antikorlarının göreceli titrelerini gösteren grafikler (Aşılama öncesi - tamamlanmadan 4 ay sonra); zaman, aşılama serisinin tamamlanmasına göre gün cinsinden gösterilir; aşı uygulamasının genel noktaları belirtilmiştir (kırmızı çizgiler). Deneyler, Protokol'de açıklandığı gibi çift kanal modunda gerçekleştirildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Standart Numara | Seyreltme serisi | Ani Yükselme Önleyici S1 veya N (μg/mL) | Anti-Membran (μg/mL) |
| Boş | Boş | - | - |
| 1 | STD7 1:1 | 1 | 5 |
| 2 | STD6 1:5 | 0.2 | 1 |
| 3 | STD5 01:25 | 0.04 | 0.2 |
| 4 | STD4 1:125 | 0.008 | 0.04 |
| 5 | STD3 1:625 | 0.0016 | 0.008 |
| 6 | STD2 1:3125 | 0.00032 | 0.0016 |
| 7 | STD1 1:15625 | 0.000064 | 0.00032 |
Tablo 1: Standart eğriler için seyreltme serisi: IgG serotipi için standart eğriler için kullanılan seyreltme faktörleri tablosu; α-Spike S1 ve α-Nucleocapsid için 1 μg/mL'den başlayan 7 noktalı, 1:5 seri seyreltme eğrisi ve α-Membran antikorları için 5 μg/mL olarak sunulmaktadır.
| Arjantin | Örnek | Temsilci 1 | Temsilci 2 | Temsilci 3 | Temsilci 4 | Ave | Sd | %CV |
| Başak S1 | STD2 | 369.4 | 356.9 | 295.2 | 271.5 | 323.3 | 47.4 | 14.6 |
| STD5 | 3869.1 | 3437 | 3970.2 | 4240.7 | 3879.3 | 334 | 8.6 | |
| Zar | STD2 | 40.6 | 37.7 | 49.9 | 27.8 | 39 | 9.1 | 23.3 |
| STD5 | 733.2 | 731.3 | 724 | 678.1 | 716.7 | 26 | 3.6 | |
| Nükleokapsid | STD2 | 1746.7 | 1790.8 | 1577.3 | 1664.8 | 1694.9 | 94.2 | 5.6 |
| STD5 | 15598.1 | 14735.5 | 18369.5 | 17408.5 | 16527.9 | 1657.7 | 10 |
Tablo 2: Tahlil içi hassasiyet: Standart 2 (STD2) ve standart 5'teki (STD5) standart antikor karışımlarının dört replikasyonundan hesaplanan yüzde varyans katsayısı (%CV), aynı deneyde tek bir tahlil partisi ile hesaplanmıştır. Çoğaltmalar ve ortalamalar için sağlanan değerler, gözlemlenen MFI değerlerini temsil eder.
| Arjantin | Örnek | Toplu İşlem 1 | Toplu İş 2 | Toplu 3 | Ave | Sd | %CV |
| Başak S1 | STD2 | 383.2 | 424.4 | 379.9 | 395.8 | 24.8 | 6.3 |
| STD5 | 5639.7 | 6062.5 | 6384.3 | 6028.8 | 373.4 | 6.2 | |
| Zar | STD2 | 39.1 | 58.5 | 59.1 | 52.2 | 11.4 | 21.8 |
| STD5 | 732.3 | 941.4 | 701.1 | 791.6 | 130.7 | 16.5 | |
| Nükleokapsid | STD2 | 1342.6 | 1621 | 1718.2 | 1560.6 | 195 | 12.5 |
| STD5 | 13543.9 | 14843.2 | 17883.4 | 15423.5 | 2227.2 | 14.4 |
Tablo 3: Standart numunelerle tahliller arası hassasiyet: Varyans yüzdesi katsayısı (%CV), aynı deneyde standart 2 ve standart 5'te değerlendirilen üç ayrı tahlil grubundan hesaplanmıştır. Çoğaltmalar ve ortalamalar için sağlanan değerler, gözlemlenen MFI değerlerini temsil eder.
| IgG-PE | IgM-SB | IgA-PE | |||||
| Av. MFI | %CV | Av. MFI | %CV | Av. MFI | %CV | ||
| Başak S1 | Konu 1 | 8002.3 | 17.7 | 1949.5 | 1.3 | 2045.8 | 5.5 |
| Konu 2 | 19155.8 | 7.3 | 918.6 | 4.1 | 1684.5 | 3.9 | |
| Konu 3 | 17865.6 | 18.0 | 549.4 | 3.8 | 961.3 | 8.1 | |
| Konu 4 | 11901.1 | 2.6 | 1603 | 4.8 | 8736.4 | 5.5 | |
| Konu 5 | 9801.8 | 4.0 | 1014.1 | 3.0 | 2747.6 | 9.3 | |
| Nükleokapsid | Konu 1 | 15097.8 | 11.3 | 1049.7 | 9.9 | 5276.5 | 3.9 |
| Konu 2 | 15204.3 | 12.1 | 265.9 | 5.2 | 6761.3 | 11.9 | |
| Konu 3 | 18471.7 | 24.4 | 329.1 | 4.5 | 14308 | 2.9 | |
| Konu 4 | 16424.7 | 3.5 | 2418.1 | 0.1 | 4234.7 | 4.2 | |
| Konu 5 | 13344.9 | 3.6 | 225.6 | 10.0 | 13436.5 | 9.7 | |
| Zar | Konu 1 | 514.6 | 8.6 | 180.6 | 14.0 | 141.2 | 9.8 |
| Konu 2 | 196.8 | 5.2 | 57 | 20.7 | 55.5 | 13.0 | |
| Konu 3 | 553.7 | 12.9 | 54.5 | 21.2 | 191.2 | 18.6 | |
| Konu 4 | 377.9 | 3.2 | 68.1 | 22.1 | 62 | 2.3 | |
| Konu 5 | 325.4 | 8.2 | 11.4 | 91.6 | 74.6 | 20.8 |
Tablo 4: İnsan numuneleri ile tahliller arası hassasiyet: SARS-CoV-2 enfeksiyonları olan beş insan denekten alınan plazma örnekleriyle (500 kat seyreltilmiş) test edilen üç grup tahlilden hesaplanan ortalama yüzde varyans katsayısı (%CV).
| Başak S1 | Zar | Nükleokapsid | |||||
| μg/mL | Av. MFI | % Maks. | Av. MFI | % Maks. | Av. MFI | % Maks. | |
| Igm | 0.5 | 186 | 13.2 | 32 | 25.2 | 132.7 | 13.6 |
| 1 | 304.2 | 21.6 | 45.8 | 36 | 194.4 | 19.9 | |
| 2 | 664.5 | 47.2 | 78.8 | 61.9 | 458.2 | 47 | |
| 4 | 1032.1 | 73.3 | 101.3 | 79.6 | 707.8 | 72.6 | |
| 8 | 1407.1 | 100 | 127.2 | 100 | 975 | 100 | |
| IgG | 0.5 | 809.7 | 4.9 | 27.5 | 15 | 1355.6 | 6.3 |
| 1 | 1696.9 | 10.2 | 40.6 | 22.2 | 2782.1 | 13 | |
| 2 | 4543.8 | 27.3 | 68.3 | 37.3 | 6661.2 | 31.2 | |
| 4 | 10003.5 | 60 | 110.7 | 60.5 | 12605.6 | 59 | |
| 8 | 16662.8 | 100 | 182.9 | 100 | 21360.6 | 100 | |
| IgA | 0.5 | 797.4 | 19.3 | 31.1 | 47.2 | 2056.5 | 16.1 |
| 1 | 1529.5 | 37 | 41.4 | 62.8 | 3869 | 30.4 | |
| 2 | 2261.3 | 54.7 | 48.6 | 73.3 | 6648.9 | 52.2 | |
| 4 | 2320.4 | 56.2 | 48.3 | 73.2 | 6548.1 | 51.4 | |
| 8 | 4132.2 | 100 | 65.9 | 100 | 12744.8 | 100 | |
Tablo 5: İkincil antikor konsantrasyonu optimizasyonu: Ortalama MFI sinyali, 0.5 μg / mL ila 8 μg / mL arasında değişen farklı ikincil antikor konsantrasyonlarından üretilir. Her sinyalin değeri, göreceli sinyal büyüklüğünü göstermek için 8 μg / mL'de ("Maks.") sinyalin bir yüzdesi olarak da sunulur.
| Başak S1 | Zar | Nükleokapsid | |||||
| Kuluçka süresi (min.) | Av. MFI | % Maks. | Av. MFI | % Maks. | Av. MFI | % Maks. | |
| Igm | 15 | 1185 | 72.2 | 40.4 | 48.9 | 609.5 | 53.3 |
| 30 | 1416.6 | 86.3 | 58.4 | 70.7 | 894.2 | 78.2 | |
| 60 | 1324.8 | 80.7 | 73.6 | 89.1 | 945.6 | 82.7 | |
| 120 | 1641.2 | 100 | 82.6 | 100 | 1143.2 | 100 | |
| IgG | 15 | 12917.6 | 80.5 | 244.4 | 44.9 | 15429.8 | 80.8 |
| 30 | 14915.4 | 92.9 | 434.7 | 79.9 | 18797 | 98.5 | |
| 60 | 15340.3 | 95.6 | 421.4 | 77.5 | 18694.4 | 97.9 | |
| 120 | 16050.3 | 100 | 544 | 100 | 19085.8 | 100 | |
| IgA | 15 | 3141.9 | 78.2 | 75 | 66.8 | 9103 | 86.6 |
| 30 | 3569.1 | 88.8 | 83.9 | 74.8 | 9563.8 | 91 | |
| 60 | 3539.1 | 88 | 86 | 76.6 | 9555.7 | 90.9 | |
| 120 | 4020 | 100 | 112.2 | 100 | 10512.9 | 100 |
Tablo 6: İkincil antikor inkübasyon süresi optimizasyonu: Sekonder antikorların farklı inkübasyon sürelerinden üretilen ortalama MFI sinyali, 15 dakika ila 120 dakika arasında değişmektedir. Her sinyalin değeri, göreceli sinyal büyüklüğünü göstermek için 120 dakikada ("Maks.") sinyalin bir yüzdesi olarak da temsil edilir.
Discussion
SARS-CoV-2 maruziyetine karşı bir bağışıklık tepkisinin takdir edilmesi, enfeksiyon durumunun RT-PCR tabanlı sürveyansı ile birlikte, Covid-19'dan iyileşme sürecini açıklığa kavuşturmak, potansiyel terapötik değere sahip iyileşen plazmayı tanımlamak için bir araç olarak hizmet etmek ve enfeksiyon oranlarını popülasyon ölçeğinde araştırmak için bir reçete olarak iyi tanımlanmıştır10,11. İnsan deneklerde serokonversiyonun anlaşılmasına farklı örnekler arasında protein (antijen) dizileri 12, immünoblotlar 13, hızlı immünokromatografik yapılar14 ve enzime bağlı immünosorbent tahlilleri (ELISA'lar) 15,16,17 sayılabilir. Yukarıda belirtilen bu tekniklerin her biri, çoklu immünoglobulin izotiplerini küçük modifikasyonlarla ayrı ayrı değerlendirebilir. Bununla birlikte, bu prosedürler, bu makalede sunulduğu gibi, çoklu izotiplerin paralel analizine izin vermek için pratik olarak yeniden tasarlanamaz, maliyet ve verim faktörlerini popülasyon tabanlı bir ölçek test stratejisinde uygulamaları için sınırlamalar olarak sunar. Bu uygulamaların birçoğu aynı zamanda çoklu antijen seviyelerini paralel olarak ya sunulduğu gibi ya da multipleks ELISA18,19 gibi değiştirilmiş formatlarda birleştirme fırsatı sunar. Son olarak, immünoboncuk platformu, çoklu antijen seviyeleriniparalel olarak 20,21'de değerlendirme imkanı sağlar, ancak 'çift kanallı' tahlil yeteneklerine sahip son cihaz kullanılmadıkça, tahlil başına tek bir epitop (yani, immünoglobulin izotipi) ile sınırlandırılmıştır.
Bu yazıda, Covid-19 aşılı bireylerin serokonversiyon vaka çalışmasında 'çift kanallı' modda alet kullanılarak bir immünoboncuk testinde çoklu epitopların güvenilir ölçümünü sağlayan protokoller sıralanmıştır. Yöntem, laboratuvar otomatik sistemlerinin entegrasyonu ile geliştirilebilecek manuel tahlil tasarımları kullanılarak mükemmel hassasiyet (%CV değerleri tipik olarak <%20) göstermiştir. Seçilen tüm analitler ve epitoplar için tahlil duyarlılığı ve dinamik aralık rutin değerlendirmeler için uygundu. Ticari olarak temin edilebilen anti-antijen IgA ve IgM immünoreaktiflerinin eksikliği, kantitasyonu IgG izotipine sınırlamış olsa da, böyle bir kısıtlama, kalibrant22,23 olarak belirli bir örneğe göre yarı kantitatif değerlendirmeler veya değerlendirmeler sunma yeteneğini engellemez.
Doğrulanmış immünoboncuk testi, Covid-19 aşısı ile aşılanmış bireylerin bir kohortunda serokonversiyonun araştırılması için tahsis edildi. Diğer benzer platformların aksine, enstrümantasyon ailesi, manuel bir iş akışında günde yüzlerce bireyde ve otomatik bir şemada günde binlerce kişide serokonversiyonun araştırılmasına izin verir. Genel olarak, bu bulgular 'çift kanallı' yaklaşımın, aynı tahlil için paralel olarak çoklu epitopların tanımlanması için uygun duyarlılığa sahip olduğunu ve multianalit bağlamında uygulanabilir olduğunu doğrulamaktadır. Sırasıyla fikoeritrin ve Süper Parlak 436 floroforlarla gerçekleştirilen kanal 1 ve kanal 2'ye duyarlılıklardaki bir fark, belirli bir deney için uygulanabilir analitik sonuçların elde edilmesini sağlamak için belirli bir deneyin tasarımını garanti edebilir. Yani, kanal 1'in epitoplar veya daha düşük prevalanslı analitler için ayrılması, bilinmeyenlerin gözlemlenen değerlerini içeren tahlilin dinamik bir aralığını korumak için gerekli olabilir. Bu düşüncenin ötesinde, tahlil tasarımı açıktı ve sınırlı analitik yeteneklere sahip laboratuvarlar için kolayca erişilebilir olmalıydı. Elbette, Şekil 5'te belirttiğimiz gibi, kanal 1'den kanal 2'ye girişim göz önüne alındığında bu husus tartılmalıdır, bu sayede daha yüksek bolluk izotiplerinden gelen girişim, çift kanallı bir formatta ölçüldüğünde çok daha düşük bollukta olanlar için yanıltıcı analitik hatalara neden olabilir. Son derece farklı analit konsantrasyonlarına sahip durumlarla bu girişim potansiyeli, tahlil tasarım aşamasında uygun şekilde ele alınmadığı takdirde yaklaşımda önemli bir sınırlama oluşturabilir.
Sonuç olarak, Covid-19 enfeksiyonuna veya aşılamaya karşı immün yanıt ile ilişkili majör immünoglobulin izotiplerinden antikor titrelerini hızlı bir şekilde ölçmek için bir yöntem sunulmuştur. Bu yaklaşımı serokonversiyonun değerlendirilmesi için uzunlamasına bir şekilde uygulamak, hastalığın seyrini yönetmek ve / veya izlemek için daha iyi kullanılabilecek veya alternatif olarak potansiyel Covid-19 güçlendirici aşı programlarına rehberlik edebilecek bilgiler sağlayabilir.
Disclosures
Dr. Borgia, patent bekleyen bu makalede kullanılan serolojik testin mucididir. Makale, yalnızca yazar çatışmasının getirdiği potansiyel önyargıyı önlemek için sunulan istatistiksel analizler olmadan tanımlayıcı bir şekilde sunulmuştur.
Acknowledgments
Yazarlar, tesislerinin kullanımı için Rush Biomarker Development Core'a, konu kaydı ve biyonumune işleme için Rush Biorepository'ye ve Walder Vakfı'nın Chicago Koronavirüs Değerlendirme Ağı (Chicago CAN) Girişimi hibe numaraları SCI16 (J.R.S. ve J.A.B.) ve 21-00147 (J.R.S. ve J.A.B.) ve Swim Across America Vakfı'ndan (J.A.B.) bir ödüle teşekkür etmek istiyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well black side polystyrene microtiter plates | Thermo Fisher | 12-565-346 | |
| Activation buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2) | Prepared in house | ||
| Assay buffer (PBS, 1% Bovine Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20) | Prepared in house | ||
| Bovine Serum Albumin, heat shock fraction | MilliporeSigma | A-7888-50G | |
| Coupling buffer (50 mM MES, pH 5.0) | Prepared in house | ||
| COVID 19 M Coronavirus Recombinant Matrix Protein (6xHis tag) | MyBioSource | MBS8574735 | |
| Disposable pipette tips | |||
| EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride) | Thermo Fisher | PIA35391 | |
| Goat Albumin, Fraction V Powder | MilliporeSigma | A2514-1G | |
| IgA Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB205009 | |
| IgG Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB204009 | |
| IgG Goat anti-Rabbit, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB403009 | |
| IgM Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal | Thermo Fisher | OB202009 | |
| IgM Mouse anti-Human, SB 436, Clone SA-DA4 | Thermo Fisher | 62999842 | |
| Instrument Analyzer | Luminex Corp. | INTELLIFLEX-RUO | |
| Low-Bind microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Thermo Fisher | 13-698-794 | |
| MagPlex-C Microspheres, Region XXX | Luminex Corp. | MC10XXX-01 | |
| MES hydrate (2-(N-Morpholino) ethane sulfonic acid hydrate) | MilliporeSigma | M2933 | |
| Microplate aluminum sealing tape | Thermo Fisher | 07-200-683 | |
| Polysorbate-20 | Thermo Fisher | BP337-500 | |
| Quality Biological Inc. PBS, pH 7.2 | Thermo Fisher | 50-751-7328 | |
| Quench buffer (PBS, 1% Goat Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20) | Prepared in house | ||
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Protein (His tag) | Sino Biologicals | 40588-V08B | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Protein (S1 Subunit, His tag) | Sino Biologicals | 40591-V08H | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD Antibody, Rabbit pAb | Sino Biologicals | 40592-T62 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Antibody, Rabbit mAb | Sino Biologicals | 40588-R0004 | |
| SARS-CoV-2 (COVID-19) Membrane Antibody (IN), Rabbit pAb | ProSci | 10-516 | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Fisher | PIA39269 | |
| Wash Buffer (PBS, 0.01% Polysorbate-20) | Prepared in house | ||
| Water, LC/MS grade | Thermo Fisher | W-64 |
References
- Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. ELISA in the multiplex era: potentials and pitfalls. Proteomics - Clinical Applications. 9, 406-422 (2015).
- Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4084 (2012).
- Powell, R. L., et al. A multiplex microsphere-based immunoassay increases the sensitivity of siv-specific antibody detection in serum samples and mucosal specimens collected from rhesus macaques infected with SIVmac239. BioResearch Open Access. 2 (3), 171-178 (2013).
- Volpetti, F., Garcia-Cordero, J., Maerkl, S. J. A microfluidic platform for high-throughput multiplexed protein quantitation. PLoS One. 10 (2), 0117744 (2015).
- Rabi, F. A., Al Zoubi, M. S., Kasasbeh, G. A., Salameh, D. M., Al-Nasser, A. D. SARS-CoV-2 and coronavirus disease 2019: What we know so far. Pathogens. 9 (3), 231 (2020).
- Asif, M., Xu, Y., Xiao, F., Sun, Y. Diagnosis of COVID-19, vitality of emerging technologies and preventive measures. Chemical Engineering Journal. 423, Lausanne, Switzerland. 130189 (2021).
- La Marca, A., Capuzzo, M., Paglia, T., Roli, L., Trenti, T., Nelson, S. M. Testing for SARS-CoV-2 (COVID-19): a systematic review and clinical guide to molecular and serological in-vitro diagnostic assays. Reproductive Biomedicine Online. 41 (3), 483-499 (2020).
- Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. The Clinical Biochemist. Reviews. 29, Suppl 1 49-52 (2008).
- Tarhoni, I., et al. Relationship between circulating tumor-associated autoantibodies and clinical outcomes in advanced-stage NSCLC patients receiving PD-1/-L1 directed immune checkpoint inhibition. Journal of Immunological Methods. 490, 112956 (2021).
- Deeks, J. J., et al. Antibody tests for identification of current and past infection with SARS-CoV-2. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 6, 013652 (2020).
- Mahalingam, S., et al. Landscape of humoral immune responses against SARS-CoV-2 in patients with COVID-19 disease and the value of antibody testing. Heliyon. 7 (4), 06836 (2021).
- Ruano-Gallego, D., et al. A multiplex antigen microarray for simultaneous IgG and IgM detection against SARS-CoV-2 reveals higher seroprevalence than reported. Microbial Biotechnology. 14 (3), 1228-1236 (2021).
- Shah, J., et al. IgG and IgM antibody formation to spike and nucleocapsid proteins in COVID-19 characterized by multiplex immunoblot assays. BMC Infectious Diseases. 21 (1), 325 (2021).
- Gambino, C. M., et al. Comparison of a rapid immunochromatographic test with a chemiluminescence immunoassay for detection of anti-SARS-CoV-2 IgM and IgG. Biochemia Medica (Zagreb). 30 (3), 030901 (2020).
- Algaissi, A., et al. SARS-CoV-2 S1 and N-based serological assays reveal rapid seroconversion and induction of specific antibody response in COVID-19 patients. Scientific Reports. 10, 16561 (2020).
- Chiereghin, A., et al. Recent advances in the evaluation of serological assays for the diagnosis of SARS-CoV-2 infection and COVID-19. Frontiers in Public Health. 8, 620222 (2020).
- Nicol, T., et al. Assessment of SARS-CoV-2 serological tests for the diagnosis of COVID-19 through the evaluation of three immunoassays: Two automated immunoassays (Euroimmun and Abbott) and one rapid lateral flow immunoassay (NG Biotech). Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 129, 104511 (2020).
- Butt, J., et al. From multiplex serology to serolomics-A novel approach to the antibody response against the SARS-CoV-2 proteome. Viruses. 13 (5), 749 (2021).
- Byrum, J. R., et al. multiSero: open multiplex-ELISA platform for analyzing antibody responses to SARS-CoV-2 infection. medRxiv. , (2021).
- Dobano, C., et al. Highly sensitive and specific multiplex antibody assays to quantify immunoglobulins m, a, and g against SARS-CoV-2 antigens. Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 01731 (2021).
- Schultz, J. S., et al. Development and validation of a multiplex microsphere immunoassay using dried blood spots for SARS-CoV-2 seroprevalence: Application in first responders in first responders in Colorado, USA. Journal of Clinical Microbiology. 59 (6), 00290 (2021).
- Beavis, K. G., et al. Evaluation of the EUROIMMUN anti-SARS-CoV-2 ELISA assay for detection of IgA and IgG antibodies. Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan Americal Society for Clinical Virology. 129, 104468 (2020).
- Jung, J., et al. Clinical performance of a semi-quantitative assay for SARS-CoV2 IgG and SARS-CoV2 IgM antibodies. Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 510, 790-795 (2020).
