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Artículo de método

Aislamiento de clones de células de melanoma transfectadas de forma estable

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DOI:

10.3791/63371

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4 de agosto de 2022

 ,  , 
1Department of Cell Pathology, Faculty of Biotechnology, University of Wrocław

En este artículo

Resumen

Se describe un protocolo para aislar clones de células de melanoma transfectadas de forma estable mediante cilindros de vidrio. Nos centramos en consejos prácticos que pueden ser decisivos para el éxito de todo el procedimiento.

Resumen

Las poblaciones celulares que tienen cambios estables en su información genómica son ampliamente utilizadas por los científicos como modelo de investigación. No requieren transfección celular repetida, ya que puede conducir a una población celular heterogénea y una eficiencia de transfección variable, lo que afecta la reproducibilidad. Además, son preferibles para análisis a gran escala. La generación de clones de células estables es útil para una amplia gama de aplicaciones, como la investigación sobre las funciones de los genes y la producción de proteínas recombinantes. Existen algunos métodos para obtener una población celular homogénea en la transfección transitoria inicial. Aquí, describimos el aislamiento de clones de una sola célula con cilindros de vidrio. Aunque este método se conoce desde hace algún tiempo, hay algunos pasos cruciales y descuidarlos puede llevar al fracaso. Hemos utilizado con éxito este método para obtener clones sobreexpresados de forma estable una proteína de interés (POI) o con knockout de un gen de interés (GOI). Describimos los pasos de preparación, como la optimización de la selección de las concentraciones del fármaco, la preparación de los cilindros de vidrio y la validación de si los clones obtenidos tienen el cambio deseado en la expresión del GOI mediante PCR, análisis de Western blot, inmunotinción o secuenciación de ADNg (dependiendo del tipo de clones derivados). También discutimos la heterogeneidad fenotípica de las líneas celulares bien establecidas, ya que esto podría ser un problema para obtener clones de células estables.

Introducción

La transfección estable de células de mamíferos es un método utilizado de forma rutinaria en varias aplicaciones de cultivo celular, incluida la investigación del cáncer. Su ventaja sobre la transfección transitoria es que el material genético extraño introducido no puede perderse debido a factores ambientales (por ejemplo, confluencia celular o etapa de replicación) y la división celular porque está integrado en el genoma del huésped1. El desarrollo de líneas celulares que se expresen de manera estable puede ser laborioso y desafiante, pero si se requiere una expresión sostenida de genes durante un período prolongado, la derivación de líneas celulares estables es una opción preferida. El objetivo más común de la transfección es estudiar las funciones de un gen específico o producto génico mediante la sobreproducción o la regulación a la baja de su expresión. Sin embargo, la producción de proteínas recombinantes y terapias genéticas también requiere la introducción de material genético extraño en la célula2.

Un clon se define como una población celular derivada de una célula individual. El aislamiento de clones unicelulares es un aspecto crucial de la biología celular cuando se estudian células con variabilidad genotípica y fenotípica. Se utilizan tres técnicas principales para derivar clones de células: la técnica de dilución, la técnica de anillo de clonación3 y la técnica de clasificación de células4. Cada uno tiene ventajas y desventajas. Proporcionamos una descripción detallada de un método para aislar clones de células de melanoma utilizando la técnica del cilindro de vidrio. La ventaja de este método es que las células exhiben un crecimiento clonal moderado de cultivos celulares con baja densidad. Además, las células seleccionadas ya han demostrado capacidad de proliferación porque ya han formado colonias5. Este procedimiento consiste en sembrar células transfectadas escasamente, pero sin limitar la dilución, en un recipiente grande y permitir que se expandan y formen colonias durante 2-3 semanas en presencia de un antibiótico selectivo. A continuación, las colonias individuales se pueden aislar utilizando cilindros de vidrio que se colocan sobre las colonias y se adhieren al recipiente con grasa de silicona. A continuación, las células se separan con tripsina y luego se transfieren a placas de pocillos múltiples para su posterior cultivo en presencia de un medio selectivo.

Hay una serie de estudios que describen el aislamiento de clones, pero nos centramos en mostrar detalles como el tamaño que deben tener los clones después de 2 semanas de selección, cómo marcar la ubicación de los clones durante su aislamiento y cómo elegir una concentración adecuada de antibiótico para la selección. Nos centramos en consejos prácticos que pueden ser decisivos para el éxito de todo el procedimiento. El protocolo presentado nos permite obtener clones de células estables en un plazo de 2 a 4 semanas. El método es fácil y barato y no requiere equipos complicados. Compartimos una técnica que nos ha permitido obtener muchos modelos de investigación, entre ellos los clones GSN KO 6,7,8.

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Protocolo

1. Subcultivo celular y siembra para la optimización de la concentración de fármacos

  1. Calentar el medio de cultivo celular (en este caso, el medio Eagle modificado de Dulbecco con una concentración reducida (1,5 g/L) de NaHCO3, 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS), 1% (v/v) de L-glutamina y 1% (v/v) de antibiótico-antimicótico) y la solución de tripsina en un baño de agua a 37 °C.
  2. Aspire y deseche el medio de cultivo celular de las células A735 que crecen en un matraz de cultivo celular T25. La línea celular se obtiene de fuentes comerciales.
  3. Lave cualquier resto de medio de cultivo celular de las células lavando el matraz con 1 mL de solución de tripsina o PBS.
  4. Aspire y deseche la solución de tripsina o PBS de las células.
  5. Añadir 1 mL de solución de tripsina al matraz e incubar a 37 °C. Observe cuidadosamente el desprendimiento de las células con un microscopio invertido.
  6. Detenga la actividad de tripsina añadiendo 3 mL de medio de cultivo celular completo fresco y enjuague el matraz de cultivo celular con él cuando las células se desprendan.
  7. Transfiera la suspensión celular del matraz a un tubo de centrífuga de 15 mL.
  8. Centrifugar las celdas a 800 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
  9. Aspirar y desechar el sobrenadante.
  10. Vuelva a suspender las células en 1 mL del medio de cultivo celular fresco.
  11. Para calcular la densidad de células, cuente las células con un contador automático de células o un hemocitómetro.
  12. Siembre el número apropiado de células en una placa de cultivo del tamaño apropiado.
    NOTA: En este experimento, se sembraron 450.000 células de la línea celular A375 en 2 mL del medio de cultivo celular en una placa de cultivo de 35 mm.

2. Optimización de la concentración de fármaco seleccionado

  1. Encuentre el rango de concentración recomendado por el fabricante del medicamento que se utilizará para seleccionar clones de células estables.
    NOTA: Un gen de selección introducido en una célula por transfección con un vector genético proporciona a la célula resistencia al fármaco de selección. La puromicina a una concentración de 1 μg/mL se utilizó como marcador de selección para obtener una expresión estable del vector genético y eliminar las células no transfectadas.
  2. Siembre las células en los pocillos de una placa de 96 pocillos para alcanzar el 50% de confluencia al día siguiente. Prepare tres pocillos para cada concentración de fármaco y un control sin tratar. Siembra 10.000 células por pocillo. El número de celdas depende de la línea celular que se utilice y debe determinarse empíricamente.
  3. Después de 24 h, prepare 10 diluciones del medicamento en el medio completo desde la concentración más baja hasta la más alta recomendada por el fabricante y agréguelas a las células.
    NOTA: En este caso, se utilizó puromicina. El rango de concentración fue de 0-10 μg/mL. Cada 3 días, o cuando se observen muchas células muertas en el medio, cambie a un medio fresco.
  4. Observe las células diariamente durante una semana y tome notas sobre su confluencia, proliferación y muerte con respecto a la placa de control.
    NOTA: Una concentración apropiada es aquella en la que las células dejan de proliferar y no causan la muerte celular inmediatamente, sino que matan a todas las células tratadas después de 48-120 h. Sin embargo, para algunas combinaciones de líneas celulares y fármacos, es posible que no haya una fase en la que las células dejen de proliferar sino que mueran. En tal situación, la concentración más baja de fármaco que mata todas las células sería apropiada para la selección.

3. Siembra y transfección de células

  1. Siembra las células en un pocillo de una placa de seis pocillos.
    NOTA: El volumen final de la suspensión celular en el medio de cultivo celular debe ser de 2,5 mL. Para este experimento se sembraron 450.000 células por pocillo. El número de células debe determinarse empíricamente para que su confluencia no pueda superar el 90% después de 48 h de siembra.
  2. Cultivar las células a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenga 5% de CO2 durante 24 h.
    NOTA: Las células se cultivaron durante 24 h antes de la transfección. Sin embargo, 48 h después de la siembra, se observó que las células se transfectaron de manera más eficiente.
  3. Aspire y deseche el medio de cultivo celular por encima de las células.
  4. Reemplace el medio desechado con un medio de cultivo celular precalentado y libre de antibióticos (10% (v/v) FBS, DMEM suplementado con glutamina).
    NOTA: La necesidad de cambiar el medio de cultivo celular se debe al aumento de la permeabilidad celular causado por algunos reactivos de transfección, lo que puede causar una mayor afluencia de antibióticos en las células, lo que resulta en la muerte celular.
  5. Reactivos de transfección diluidos en DMEM sin antibióticos ni suero. Utilice polietileneimina (PEI), reactivo de transfección a base de lípidos o electroporación. Para la transfección celular, use 2 mg/mL de solución de polietilemina en una proporción de peso de 1:2.175 para 4 μg de ADN.
    NOTA: Como solución de ADN, se utilizó una mezcla de dos plásmidos en el sistema CRISPR/Cas9(D10A) con las siguientes secuencias de ARNg: 5'ccgggccgtgcagcaccgtg3' y 5'atccagctgcacggtaaaga3'.
  6. Incubar la mezcla de transfección durante 30 min en RT.
  7. Después de la incubación, agregue con cuidado la mezcla de transfección gota a gota a las células que crecen en los pocillos de una placa de seis pocillos.
  8. Cultivar las células a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenga 5% de CO2 durante 2-6 h.
  9. Cambie el medio por el medio de cultivo celular completo.
  10. Cultivar las células a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenga 5% de CO2 durante las siguientes 24 h.

4. Generación de clones celulares

  1. Tripsinizar y transferir las células transfectadas a una placa de cultivo de 150 mm de diámetro con una rejilla moldeada de 20 mm de acuerdo con las instrucciones de la sección 1 del protocolo.
    NOTA: Debido a la fusión de las células entre sí en el caso de alta densidad, se recomienda que las células se transfieran uniformemente a dos placas de cultivo celular. La rejilla de la placa de cultivo ayuda a localizar los clones y a realizar un seguimiento de su migración. En un plano de antena impreso, se puede marcar posteriormente la ubicación de los clones (Figura 1B). Además, para las celdas que no toleran la remoción del medio y la exposición al aire (lo que resulta en la muerte/daño irreversible), sería mejor usar más placas con un área de superficie más pequeña para aislar menos colonias de una placa. Esto podría reducir el tiempo de exposición al aire durante el aislamiento de los clones y reducir la probabilidad de deshidratación celular.
  2. Cultivar las células a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenga 5% de CO2 durante 24 h.
  3. Cambie el medio de cultivo celular a un medio que contenga un antibiótico selectivo.
    NOTA: A partir de este punto, es importante cultivar las células en presencia de un antibiótico selectivo; De lo contrario, existe la posibilidad de eliminar el transgén integrado del gen.
  4. Cambie el medio cada 3 días o cuando haya muchas células muertas flotando en el medio.
    NOTA: En este experimento, las células se incubaron con puromicina a una concentración de 1 μg/mL. El paso de selección del clon de células tarda aproximadamente 2 semanas. La formación de clones debe controlarse observando su crecimiento bajo un microscopio invertido, ya que no deben crecer ni entrar en contacto con clones de células vecinas. No se puede evitar que las células de una colonia migren y crezcan con otra colonia. Por lo tanto, es importante observar la placa para la migración celular de los clones y anotar la información al respecto en el plano del plato.

5. Elección de los clones para el aislamiento

  1. Examine la placa de cultivo celular en busca de clones de células bajo un microscopio invertido con un objetivo de 10x o 20x.
    NOTA: Los clones están formados por aproximadamente 500-30.000 células. Sin embargo, depende de la línea celular utilizada. Una colonia satisfactoria debe estar separada de otras colonias celulares y ser de tamaño medio, ya que pueden surgir clones muy grandes y sobresalientes de más de una célula (Figura 1B).
  2. Encuentre una colonia adecuada utilizando el microscopio invertido examinando cuidadosamente el plato y evaluando los clones encontrados. Coloque el marcador en la ubicación del clon seleccionado con el marcador en el plato debajo. Al mismo tiempo, marque la localización de la colonia en el plano del plato impreso (Figura 1B).
    NOTA: Se deben seleccionar aproximadamente 20-30 colonias del plato. A veces, se obtienen menos clones de células, y todas ellas deben aislarse en tales casos.

6. Preparación de cilindros de vidrio

  1. Antes del aislamiento de los clones, coloque los cilindros de vidrio (6,4 mm de diámetro y 8 mm de altura) (Figura 1C) en la primera placa de Petri de vidrio y autoclave para ellos.
  2. Autoclave la segunda placa de Petri de vidrio.
  3. Aplique una capa delgada de grasa de silicona en el fondo de la segunda placa de Petri de vidrio esterilizada en autoclave. Coloque el plato debajo de una cabina de flujo laminar y aplique luz ultravioleta durante 30 minutos para esterilizar la grasa de silicona.
    NOTA: Opcionalmente, la grasa de silicona se puede esterilizar en autoclave.
  4. Sumerja los cilindros esterilizados en autoclave en una placa de Petri recubierta de grasa de silicona. Ahora están listos para aislar a los clones.
  5. Después de aislar los clones, limpie los cilindros de acuerdo con las reglas aplicables al material celular con el que se manipulan. En el caso de modificación genética, use hipoclorito de sodio para la esterilización.
  6. Lave los cilindros con xileno durante la noche para limpiarlos de grasa de silicona.
  7. Lave los cilindros con agua desionizada bajo una campana química para eliminar la solución de xileno.
  8. Coloque los cilindros sobre una toalla de papel y déjelos secar.
  9. Guarde los cilindros en una placa de Petri de vidrio.
  10. Prepare los cilindros antes del próximo uso, a partir del punto 1 de este manual.

7. Aislamiento de clones

  1. Prepare una placa de 24 pocillos que contenga 0,5 mL de medio de cultivo celular completo precalentado en cada pocillo.
  2. Lave cuidadosamente las células transfectadas que crecen en un plato de 150 mm tres veces con 15 ml de PBS tibio y estéril. Aspire y deseche con cuidado el PBS.
  3. Use pinzas estériles para transferir cilindros que tengan grasa en un lado. Presione los cilindros en el fondo de una placa de cultivo en los sitios de los clones marcados para crear pozos aislados alrededor de las colonias en crecimiento de origen de clones unicelulares.
    NOTA: El cilindro debe adherirse bien al fondo para evitar fugas de líquidos.
  4. Añadir 50 μL de solución de tripsina a cada cilindro e incubar durante unos minutos. Tenga cuidado de no dañar las células enzimáticamente. Procesa las colonias una por una. Recuerde cambiar la punta de pipeta de cada cilindro para no contaminar las colonias con otras.
    NOTA: El tiempo de incubación depende de la línea celular que se utilice y debe determinarse empíricamente. La solución de tripsina se puede pipetear hacia arriba y hacia abajo para facilitar el desprendimiento de las células. Controle cuidadosamente el desprendimiento de células con un microscopio invertido. Después del desprendimiento de la célula, detenga la actividad de la tripsina agregando 50 μL de medio de cultivo celular a cada cilindro.
  5. Transfiera inmediatamente 100 μL de la suspensión celular al medio en un pocillo de una placa de 24 pocillos.
    NOTA: Aquí, el crecimiento de los clones se continuó con un antibiótico selectivo a una concentración de 0,5 μg/mL.
  6. Monitoree el crecimiento de los clones celulares en la placa de 24 pocillos y, cuando alcancen el 90% de confluencia, transfiéralos a una placa de seis pocillos. Siga las instrucciones de la sección 1 del protocolo; cambiar solo los volúmenes de tripsina (0,5 mL) y medio de parada (1,5 mL).
  7. Monitoree los clones de células que crecen en una placa de seis pocillos y, cuando alcancen la confluencia, transfiéralos al matraz de cultivo celular T12.5.
  8. Observe los clones de células en el matraz de cultivo celular T12.5 y, cuando alcancen la confluencia, subcultive y cuéntelos con un método adecuado, como el uso de un contador de células automatizado o un hemocitómetro. Congele la mitad de las células en el medio que contiene un 70% de medio completo con antibiótico selectivo, un 20% (v/v) de FBS y un 10% (v/v) de DMSO. Siembre el resto de las células en cubreobjetos (12 mm x 12 mm) para la inmunotinción y en dos pocillos de una placa de seis pocillos para el aislamiento del ADNg y la preparación del lisado.
    NOTA: En el caso de la línea celular A375, siembre 45.000 células por cubreobjetos y 450.000 células por pocillo de una placa de seis pocillos.

8. Validación de los clones de células generadas

  1. Inmunotinción
    NOTA: Realizar inmunotinción en las células para determinar el nivel de expresión de la proteína de interés (POI). Es importante teñir las células de tipo salvaje o los clones de control simultáneamente como control para poder comparar los niveles de expresión del POI (Figura 2A).
    1. Aspire y deseche el medio de cultivo celular.
    2. Lave las células que crecen en los cubreobjetos tres veces con PBS.
    3. Fije las células añadiendo 0,5 mL de solución de formaldehído al 4% a cada pocillo e incube durante 20 min en RT.
      NOTA: Diferentes anticuerpos pueden requerir diferentes métodos de fijación.
    4. Lave las celdas dos veces con PBS.
    5. Para permeabilizar las células, incubar los cubreobjetos en Triton X-100 al 0,1% en PBS durante 5 min en RT.
      NOTA: Diferentes anticuerpos pueden requerir diferentes métodos de permeabilización.
    6. Lave los cubreobjetos dos veces con PBS.
    7. Coloque los cubreobjetos en una cámara de tinción9.
    8. Incubar los cubreobjetos en BSA al 1% (p/v) en Triton X-100 al 0,1% (v/v) en solución de PBS durante 30 min en RT para evitar la unión inespecífica de anticuerpos.
    9. Retire la solución colocando el cubreobjetos con el borde sobre un trozo de lignina con una aguja y unas pinzas.
    10. Prepare una solución de tinción compuesta por anticuerpos primarios en BSA al 1 % (p/v) y Triton X-100 al 0,1 % (v/v) en PBS. Deje caer 30 μL de solución en cada cubreobjetos e incube durante 24 h a 4 °C en una cámara húmeda y húmeda.
      NOTA: En este experimento se utilizó un anticuerpo anti-GSN de ratón con una dilución 1:200.
    11. Retire la solución colocando los cubreobjetos con el borde sobre un trozo de lignina con una aguja y unas pinzas. Coloque los cubreobjetos en un plato de 24 pocillos.
    12. Lave los cubreobjetos tres veces con PBS durante 5 minutos en RT.
    13. Prepare anticuerpos secundarios y colorantes en BSA al 1 % (p/v) y Triton X-100 al 0,1 % (v/v) en solución de PBS. Deje caer 30 μL de solución en cada cubreobjetos e incube durante 1 h a RT en la oscuridad.
      NOTA: Utilice anticuerpos secundarios marcados con anti-ratón fluorescente de burro 488 en una dilución de 1:200. Para detectar la F-actina y los núcleos celulares, utilizamos faloidina-Alexa Fluor 568 con una dilución de 1:200 y Hoechst 33342 con una dilución de 1:1000.
    14. Retire la solución colocando los cubreobjetos con el borde sobre un trozo de lignina con una aguja y unas pinzas. Coloque los cubreobjetos en un plato de 24 pocillos.
    15. Lave los cubreobjetos tres veces con PBS durante 5 minutos en RT en la oscuridad.
    16. Lave los cubreobjetos una vez con agua desionizada.
    17. Monte los cubreobjetos utilizando un medio de montaje en el cristal del microscopio.
    18. Visualice la tinción celular utilizando un microscopio confocal para establecer el nivel del POI expresado en clones derivados (Figura 2A).
  2. Análisis de Western Blot
    NOTA: Para confirmar la ausencia de expresión de POI, el nivel elevado o el nivel disminuido de POI en clones derivados, realice el análisis de Western blot en condiciones estándar10. Analice las células de tipo salvaje o los clones de control simultáneamente (Figuras 2B, C).
    1. Lave las células que crecen en el pocillo de una placa de seis pocillos tres veces con PBS.
    2. Coseche las células con un raspador hasta un tampón de su elección y haga un vórtice suavemente durante 20 s. Realizar tres ciclos de congelación (a -80 °C) y descongelación (a 4 °C) de la muestra.
      NOTA: Utilice un tampón de extracción de proteínas unido al citoesqueleto [10 mM de Tris-HCl pH 7,4, 100 mM de NaCl, 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 1 mM de etilenglicol-bis(2-aminoethil éter)-N,N,N',N'-ácido tetraacético (EGTA), 1 mM NaF, 20 mM Na4P2O7, 2 mM Na3VO4, 1% (v/v) Triton X-100, 10% (v/v) glicerol, 0,1 % (p/v) SDS, 0,5 % desoxicolato de sodio], o tampón de urea [50 mM TRIS-HCl pH 7, 5% (p/v) SDS, 8,6% (p/v) de sacarosa, 74 mM de urea, 1 mM de DTT], ambos con adición de cóctel de inhibidores de proteasa 1:100, inhibidor de serina fosfatasa 1:100 e inhibidor de tirosina fosfatasa 1:100.
    3. Centrifugar los lisados a 12.000 x g durante 5 min a 4 °C.
    4. Determine la concentración de proteínas en las muestras (por ejemplo, mediante el ensayo BCA).
      NOTA: El ensayo depende de la compatibilidad con la composición del tampón.
    5. Para llevar a cabo el análisis de Western blot de las muestras, cargue 30 μg de proteína en cada pocillo en gel de poliacrilamida (7%-15%).
    6. Realizar electroforesis SDS-PAGE y transferir las proteínas a una membrana de nitrocelulosa.
    7. Visualice el nivel de expresión de POI tiñendo la membrana con anticuerpos adecuados (Figuras 2B, C).
      NOTA: Se utilizaron anticuerpos anti-GSN de ratón con una dilución de 1:2000 y anticuerpos anti-GAPDH de ratón con una dilución de 1:200. Consulte nuestros documentos para obtener más detalles 2,11. El tiempo de exposición debe ser lo suficientemente largo como para que no se pasen por alto las señales débiles (Figura 2C).
  3. Análisis de ADNg
    NOTA: Después de estimar el nivel de expresión de POI en clones derivados mediante técnicas microscópicas y de Western blot, se debe analizar el ADN genómico. Una comparación de la longitud del producto de reacción de PCR obtenido en la plantilla de ADNg de los clones obtenidos proporciona información sobre si se editó la secuencia del GOI (Figura 2D).
    1. Lave las células que crecen en el pocillo de una placa de seis pocillos tres veces con PBS.
    2. Coseche las células con un raspador en 1 mL de PBS.
    3. Centrifugar las celdas a 5000 x g durante 5 min a 4 °C.
    4. Aspirar y desechar los sobrenadantes.
      NOTA: Los pellets pueden almacenarse durante varios meses a -80 °C.
    5. Aísle el ADNg de gránulos de clones derivados utilizando un kit de extracción de ADNg disponible comercialmente.
    6. Diseñe cebadores de PCR mediante el recocido de al menos 300 pb aguas arriba y aguas abajo del objetivo de ARNg en el sitio de edición de genes CRISPR/Cas9.
      NOTA: Se utilizaron los siguientes cebadores: Fwd: 5'gtgcagccaggatgagag3', Rev: 5'ccctgttactggtgcatc3'.
    7. Lleve a cabo reacciones de PCR utilizando la mezcla maestra de ADN polimerasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      NOTA: La composición de la mezcla de reacción de PCR se muestra en la Tabla 1, y la configuración del termociclador para la reacción de PCR se presenta en la Tabla 2.
    8. Analice los productos de PCR en gel de agarosa al 1% o al 2% (p/v) en tampón Tris-acetato-EDTA (40 mM Tris pH 8.0, 20 mM ácido acético, 1 mM EDTA).
    9. Compare la longitud del amplicón del producto de PCR de los clones de GSN KO con la longitud del producto de PCR de los clones de CTRL KO (203 pb; Figura 2D).
  4. Secuenciación de ADNg
    1. Diseñe cebadores de PCR mediante recocido en las secuencias aguas arriba y aguas abajo de las secuencias reconocidas por los ARNg codificados por los plásmidos CRISPR/Cas9(D10A).
      NOTA: Diseñe los cebadores de la siguiente manera: Fwd: 5'gatctcgagctcaagcttcgaattctgaacagtgcagacctttg3', Rev: 5'cgcggtaccgtcgactgcaattcaattcaccaacaggactaggc3'.
    2. Lleve a cabo la PCR utilizando ADN polimerasa de alta fidelidad (este tipo de análisis requiere una alta precisión durante la amplificación del ADN) y ADNg como plantilla.
      NOTA: La composición de la mezcla de reacción de PCR se muestra en la Tabla 3, y la configuración del termociclador para la reacción de PCR se presenta en la Tabla 4.
    3. Linealice el plásmido con una enzima de restricción dentro de múltiples sitios de clonación incubando durante 1 h a 37 °C.
      NOTA: La composición de la mezcla de reacción de digestión de restricción se muestra en la Tabla 5. No importa qué plásmido se esté utilizando. pACGFP-C1 se linealizó con la enzima EcoRI.
    4. Estimación de la concentración de insertos y plásmido cortado por electroforesis en gel de agarosa.
    5. Preparar las reacciones de ensamblaje del ADN.
      NOTA: Se puede utilizar un método de clonación tradicional o cualquier otro método.
    6. Transformar bacterias competentes (por ejemplo, mediante un procedimiento de choque térmico)12.
    7. Aislar plásmidos (por ejemplo, de seis colonias de bacterias por constructo de acuerdo con las instrucciones del fabricante o el protocolo citado)13.
    8. Compruebe si el inserto se ha clonado con éxito en el plásmido y si su longitud es la adecuada mediante digestión de restricción y electroforesis de ADN.
      NOTA: Si las colonias seleccionadas no contienen un plásmido con un inserto, los plásmidos deben aislarse de las colonias bacterianas subsiguientes.
    9. Confirmar la edición génica mediante secuenciación de plásmidos (Figura 3).
      NOTA: Se deben obtener al menos dos resultados diferentes de secuenciación de ADN para cada clon de célula derivada debido a la existencia de dos alelos de genes. Para líneas celulares multiploides (mayores de 2 n), es necesario secuenciar más plásmidos para obtener la secuencia de todas las copias de genes en la célula que se obtienen. Aislar tantas colonias como sea necesario hasta que se aíslen los plásmidos con las secuencias clonadas de todas las copias del gen. Se puede utilizar un kit disponible comercialmente para estimar el número de loci del gen estudiado.
    10. Compare las secuencias de ADNg obtenidas para los clones GSN KO y CTRL KO utilizando un programa de alineación de secuencias múltiples (Figura 3).
ReactivosVolumen
Mezcla maestra de ADN polimerasa7,5 μl
Cebador delantero (10 μM)1,5 μl
Imprimación inversa (10 μM)1,5 μl
Agua estéril3,5 μl
ADNg1 μl que contiene 10 ng de ADNg

Tabla 1. Composición de la mezcla de reacción PCR.

PasosTemperatura [°C]Tiempo [minutos: segundos]
19504:00
29500:30
35700:30
47200:45
5Ir a 2, 35xX
67210:00
78∞

Tabla 2. Ajustes del termociclador para la reacción PCR.

ReactivosVolumen
5 x Tampón de ADN polimerasa de alta fidelidad4 μl
dNTPs (10 mM)0,4 μl
Cebador delantero (10 μM)1 μl
Imprimación inversa (10 μM)1 μl
Agua estéril12,4 μl
ADNg1 μl que contiene 10 ng de ADNg
ADN polimerasa de alta fidelidad0,2 μl

Tabla 3. Composición de la mezcla de reacción PCR.

PasosTemperatura [°C]Tiempo [minutos: segundos]
19800:30
29800:30
36100:30
47201:00
5Vaya al paso 2, 35 vecesX
67210:00
78∞

Tabla 4. Ajustes del termociclador para la reacción PCR.

ReactivosImporte
10 x búfer3 μl
Enzima de restricción1 μl
Agua estéril20,7 μl
Plásmido5,3 μl que contiene 5 μg de ADN

Tabla 5. Composición de la mezcla de reacción de digestión de restricción.

9. Evaluar la heterogeneidad fenotípica de la línea celular

  1. Realizar la inmunotinción de las células para determinar el nivel de expresión de POI.
  2. Tome fotos sin aumento utilizando una lente de inmersión en aceite de 60x en un microscopio confocal.
  3. Para establecer la relación de distribución de células con diferentes niveles, utilice la herramienta de "sobreexposición/subexposición" que suele estar disponible en la mayoría de los programas de análisis de imágenes microscópicas. Trate las células que muestran áreas subexpuestas como productoras de POI a un nivel bajo. Clasifique las celdas sobreexpuestas como celdas con un alto nivel de expresión de POI y las celdas restantes como que expresan POI a un nivel medio.

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Resultados

Utilizando el protocolo presentado, proporcionamos una demostración detallada del aislamiento de clones de células de melanoma transfectadas de manera estable con el método del cilindro de vidrio (Figura 1A). Nuestros estudios se relacionan con la biología celular del melanoma, y el modelo de investigación más común que utilizamos es la línea de melanoma Adherente y altamente invasiva A375. Dado que nuestra investigación ha demostrado que las células de melanoma producen gelsolina (GSN) a un...

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Discusión

Hemos proporcionado una descripción detallada del aislamiento de clones de células de melanoma transfectadas de forma estable con cilindros de vidrio. Es importante obtener clones de control cuando se derivan clones con expresión modificada de genes, ya que los resultados obtenidos para los clones de modificación dirigida siempre deben compararse con los resultados obtenidos para los controles. De esta forma, podemos comprobar si la propia transfección o el cultivo con un antibiótico sel...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional para la Ciencia, Polonia (proyecto #2016/22/E/NZ3/00654, otorgado a AJM).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo de centrífuga de 15 mlGoogleLab Scientific G66010522
placa de cultivo celular de 150 mm con rejilla de 20 mmPlaca
VWR International10062-896
Placa de cultivo de 35 mmEppendorfEP0030700112
placa de 6 pocillosEppendorfEP0030700113
de 96 pocillos placaVWR International10062-900 
Ácido acético, solución al 80%Chempur115687330
AgarosaProna-AboBLE500
Antibiótico-AntimicóticoGibco15240062
anticuerpos anti-GAPDHSanta Cruz Biotechnology Inc.,sc-47724
anticuerpos anti-GSN  - clon C20Santa Cruz Biotechnology Inc.,sc-6405
anti-GSN  - clon GS-2C4Sigma-AldrichG44896
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma-AldrichA3294
Color Taq PCR Master Mix (2x)EurXE2525
Control Doble Plásmido de Níquea SantaCruz Biotechnology Inc.,sc-437281
Cubreobjetosbionovo16283
Dako Medio de montaje ClontechS3023
DMSO -  Aplicación de sulfóxido de dimetiloA3672,0250
Kit de purificación de ADN EurX3555-02
burro anti-ratón-Alexa Fluor 488Invitrogen# A-21202
DTT - 1,4-DitiothreitolSigma-Aldrich10197777001
EcoRI Thermo Fisher ScientificFD0274
EDTA- ácido etilendiaminotetraacético Poch (Pol-Aura)593280117
EGTA - etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)- N,N,N',N'-ácido tetraacético Sigma-AldrichE0396
FBS - Suero Fetal Bovino Gibco10270-106
Gellolina CRISPR Plásmidos SantaCruz Biotechnology Inc.,sc-401005-NIC
FormaldehídoSigma-AldrichP6148
GlicerolSigma-AldrichL-4909
alta glucosa Dulbecco' Águila modificada' s con concentración reducida (1,5 g/l) de NaHCO3 Academia Polaca de Ciencias,Wrocfigure-materials-1aw, Polonia11-500
Hoechst 33342 Thermo Fisher ScientificH3570
L-GlutaminaGibco25030-024
Lignin BionovoB-0521
Lipofectamina 3000 Reactivo de transfección InvitrogenL3000-008
Na3VO4Sigma-AldrichS6508
Na4P2O7Sigma-AldrichP8010
NaFSigma-Aldrich450022
NEBuilder Herramienta de montaje http://nebuilder.neb.com/#!/
pACGFP-C1 Clontech
PageRuler Escalera de proteínas preteñidaThermo Fisher Scientific 26616
Escalera de ADN perfecta de 100 pbEurXE3134
faloidina-Alexa Fluor 568InvitrogenA12380
Cóctel de inhibidores de fosfatasa 2Sigma-AldrichP5726
Cóctel de inhibidores de fosfatasa 3Sigma-AldrichP0044
Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad Thermo Fisher ScientificF530S
Pierce BCA Thermo Fisher Scientific 23225
polietilenimina (PEI)Sigma-Aldrich408727
cóctel de inhibidores de la proteasaSigma-AldrichP8340
puromicinaInviviGenant-pr
SDS - dodecil sulfato de sodio Sigma-AldrichL4509
silicona CX80 Polska
Cloruro de sodio - NaClChempur7647-14-5
desoxicolato de sodioSigma-AldrichD6750259
sacarosaPoch (Pol-Aura)PA-06-772090110
los cilindros de vidrio Sigma-AldrichC3983-50EA
Matraz de cultivo de tejidos 25 mlVWR International10062-868
Matraz de cultivo de tejidos de 75 cm2VWR10062-872
Trisma baseSigma-AldrichT1503
Triton X-100Sigma-AldrichX100
tripsina Academia Polaca de Ciencias,Wrocfigure-materials-2aw, Polonia20-500
ureaSigma-Aldrich8656
solución de xilenoChempur 115208603
de 24 pocillos Falcon 353025 anticuerpos Kit de ensayo de proteínas

Referencias

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