Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Generación y expansión de líneas tumorales de mesotelioma pleural maligno primario

1.7K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/63374

⸱

21 de abril de 2022

 ,  , 
1Department of Translational Molecular Pathology, University of Texas MD Anderson Cancer Center

En este artículo

Resumen

El objetivo de este documento de método es demostrar una metodología robusta y reproducible para el enriquecimiento, generación y expansión de líneas celulares tumorales primarias a partir de mesotelioma pleural resecado quirúrgicamente.

Resumen

Faltan metodologías actuales para la expansión de líneas celulares tumorales primarias a partir de tipos de tumores raros. Este protocolo describe métodos para expandir las células tumorales primarias del mesotelioma pleural maligno (MPM) resecado quirúrgicamente al proporcionar una visión general completa del proceso desde la digestión hasta el enriquecimiento, la expansión, la criopreservación y la caracterización fenotípica. Además, este protocolo introduce conceptos para la generación de tumores que pueden ser útiles para múltiples tipos de tumores, como la tripsinización diferencial y el impacto de los métodos de disociación en la detección de marcadores de superficie celular para la caracterización fenotípica. La principal limitación de este estudio es la selección de células tumorales que se expandirán en un sistema de cultivo bidimensional (2D). Las variaciones de este protocolo, incluidos los sistemas de cultivo tridimensionales (3D), los suplementos de medios, el recubrimiento de placas para mejorar la adhesión y los métodos alternativos de desagregación, podrían mejorar esta técnica y la tasa de éxito general de establecer una línea tumoral. En general, este protocolo proporciona un método básico para establecer y caracterizar las células tumorales de este tumor raro.

Introducción

El mesotelioma pleural maligno (MPM) es un tumor poco frecuente altamente asociado con la exposición al asbesto. Aunque los enfoques basados en la inmunoterapia han mostrado resultados alentadores, hay una escasez de opciones de tratamiento disponibles para los pacientes que desarrollan esta enfermedad, y la tasa general de supervivencia a 5 años es baja 1,2. Se están realizando esfuerzos en múltiples instituciones para comprender mejor esta enfermedad e identificar nuevos objetivos terapéuticos que puedan mejorar los resultados de los pacientes. Si bien existen múltiples modelos de ratón con mesotelioma, el acceso a las células tumorales primarias del mesotelioma es más limitado3. La expansión in vitro de las células tumorales del mesotelioma primario proporcionaría un valioso sistema modelo que se puede utilizar para estudiar las células tumorales directamente y su interacción con las células inmunes autólogas, como los linfocitos infiltrantes de tumores. Si bien ha habido informes sobre la expansión de las líneas de células tumorales de mesotelioma primario, estas son pocas y no proporcionan un procedimiento de operación estándar (SOP) detallado. Además, pocas líneas celulares están disponibles en fuentes comerciales como American Type Culture Collection (ATCC). Si bien la disponibilidad de líneas tumorales primarias es limitada, se ha demostrado que las células tumorales pueden expandirse a partir de derrames pleurales y directamente desde el tejido tumoral 4,5. Además, se ha demostrado que las líneas celulares tumorales expandidas preservan el perfil molecular del tumor original 4,5,6.

Nuestro laboratorio está estudiando el microambiente inmune al tumor de MPM y ha desarrollado un método para expandir las líneas de células tumorales primarias de MPM a partir de casos resecados quirúrgicamente. Este método se adapta de nuestra experiencia en el establecimiento de líneas celulares tumorales de melanoma metastásico primario. El objetivo de este trabajo es proporcionar un enfoque detallado y práctico para la expansión de la línea tumoral de mesotelioma primario utilizando un sistema modelo 2D y el posterior perfil fenotípico. Dado el éxito reciente de las estrategias de bloqueo de puntos de control dirigidas a CTLA4 y PD-1 en el entorno de primera línea2, la capacidad de generar muchas líneas tumorales primarias podría promover la comprensión de ambos mecanismos intrínsecos de resistencia tumoral, así como proporcionar un sistema modelo importante para evaluar el reconocimiento de células T, profundizando así nuestra comprensión de la respuesta inmune en MPM.

La principal limitación de este protocolo es que cada tumor contiene un microambiente diferente, y hay un alto grado de variabilidad del éxito de la expansión. Además, este método selecciona células tumorales que pueden expandirse en un sistema de cultivo 2D. Otros métodos que implican la producción de un esferoide 3D o un cultivo de organoides podrían proporcionar un enfoque alternativo que puede permitir una mayor tasa de éxito de expansión o dar como resultado la capacidad de derivar líneas celulares que no pueden expandirse en un sistema 2D tradicional. Se ha demostrado que estos cultivos 3D son útiles para la generación de tipos de tumores que son difíciles de expandir, por ejemplo, el cáncer de páncreas7.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por la Junta de Revisión de Instituciones (IRB) del MD Anderson Cancer Center de la Universidad de Texas. Esto se refiere a los tumores MPM resecados quirúrgicamente de atención estándar que se extirpan después del consentimiento informado.

1. Preparación de medios de digestión tumoral y otros medios asociados

  1. Para preparar los medios de digestión tumoral, agregue 5 ml de pen/estreptococo al 100% (penicilina/estreptomicina) a 500 ml de medio estéril Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 en una campana de flujo laminar.
    1. Transfiera el medio a un filtro estéril de polietersulfona (PES) de 500 ml y 0,22 μm para la filtración al vacío.
      NOTA: Los pasos de filtración y aspiración deben realizarse con una presión de vacío estándar de 75-150 torr.
    2. Etiquete y ponga fecha al medio de digestión del tumor y guárdelo a 4 °C.
      NOTA: El medio se puede almacenar durante 1 mes a 4 °C.
  2. Para preparar el cóctel enzimático de digestión tumoral, agregue 2.5 mL de colagenasa al 3% tipo 1, 1 mL de 1.5 mg / ml hialuronidasa, 20 μL de 250,000 unidades / ml DNAse 1 a 16.5 ml de medio de digestión en un tubo cónico de 50 ml en una campana de flujo laminar.
    NOTA: El volumen total del cóctel enzimático de digestión tumoral es de 20 ml; sin embargo, solo se necesitan 10 ml por muestra de tumor. Como tal, el cóctel restante se puede almacenar a -20 ° C hasta que sea necesario. No vuelva a congelar las alícuotas.
  3. Para preparar el medio tumoral completo, agregue 5 ml de 100% Pen/Strep y 50 ml de suero fetal bovino (FBS) a 500 ml de RPMI 1640 estéril en una campana de flujo laminar.
    1. Transfiera el medio a un filtro estéril PES de 500 ml y 0,22 μm para la filtración al vacío.
    2. Etiquete y ponga fecha al medio tumoral completo y guárdelo a 4 °C.
      NOTA: El medio se puede almacenar durante 1 mes a 4 °C.
  4. Para preparar el medio sérico reducido para la inanición, agregue 5 ml de pluma / estreptococo al 100% y 5 ml de FBS a 500 ml de RPMI 1640 estéril en una campana de flujo laminar.
    1. Transfiera el medio a un filtro estéril PES de 500 ml y 0,22 μm para la filtración al vacío.
    2. Etiquete y ponga fecha al medio sérico reducido y guárdelo a 4 °C.
      NOTA: El medio se puede almacenar durante 1 mes a 4 °C.
  5. Para preparar el medio de congelación, agregue 5 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) a 45 ml de FBS en una campana de flujo laminar.
    1. Transfiera el medio a un filtro estéril PES de 50 ml y 0,22 μm para filtración al vacío.
    2. Etiquetar y fechar cinco tubos cónicos de 15 ml.
    3. Transfiera 10 ml de medio de congelación a cada tubo y guarde los tubos a -20 °C.
  6. Para preparar un medio libre de antibióticos para las pruebas de micoplasma, agregue 50 ml de FBS a 500 ml de RPMI 1640 estéril en una campana de flujo laminar.
    1. Transfiera el medio a un filtro estéril PES de 50 ml y 0,22 μm para filtración al vacío.
    2. Etiquete y ponga fecha al medio libre de antibióticos y guárdelo a 4 °C.
      NOTA: El medio se puede almacenar durante 1 mes a 4 °C.
  7. Para preparar el tampón de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para el análisis fenotípico, agregue 16,6 ml de albúmina sérica bovina estéril a 500 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) en una campana de flujo laminar.
    1. Etiquete y ponga fecha al tampón FACS y guárdelo a 4 °C.
      NOTA: El tampón FACS no requiere esterilización por filtro siempre que ambos componentes se almacenen estériles. El búfer FACS se puede almacenar antes de abrirse durante 6 meses a 4 °C.

2. Digestión del tejido tumoral

  1. Transfiera 10 ml de cóctel enzimático de digestión tumoral del paso 1.2 a un tubo de disociación.
  2. Transfiera el trozo de tejido tumoral a una tapa estéril de la placa de 6 pocillos con un bisturí estéril.
    NOTA: La cantidad de medio que se transfiere con el tejido tumoral es suficiente para el procesamiento.
    1. Retire todo el tejido graso, tejido necrótico y / o coágulos de sangre con un nuevo bisturí estéril y fórceps.
      NOTA: El tejido graso es normalmente de aspecto amarillento y semisólido. El tejido necrótico es más oscuro que el tejido circundante en apariencia y muy suave; tanto el tejido graso como el necrótico se romperán fácilmente. El tejido sanguinolento aparece de color rojo brillante y puede liberar sangre en el medio cuando se manipula. Una vez extirpado, el tejido tumoral resultante debe mantener su forma y ser pálido o rosado, dependiendo del tipo de tejido.
    2. Cortar todo el tejido tumoral en 1 mm3 fragmentos pequeños. Para asegurarse de que el tejido no se seque, agregue 500 μL de solución de sal equilibrada de Hank (HBSS) estéril 1x al tejido tumoral.
  3. Transferir fragmentos tumorales al tubo de disociación que contiene 10 ml de cóctel enzimático de digestión tumoral (paso 2.1). Cierre el tubo herméticamente, colóquelo con el lado de la tapa hacia abajo sobre el disociador de tejido y agregue el aparato calentador aplicándolo como una manga sobre el tubo de disociación y presionando para que lo haga clic en su lugar.
    NOTA: La capacidad máxima para cada tubo es de 4 g de tumor y 10 ml de volumen.
  4. Seleccione la configuración preprogramada en el 37C_h_TDK_1 disociador. Verifique el estado después de 10 minutos para asegurarse de que no haya ningún error de obstrucción como lo indica la luz roja parpadeante.
    NOTA: Este programa procesa a 1.865 rpm durante 1 h con la temperatura encendida a 37 °C.
    NOTA: Si se produce una obstrucción, retire el tubo de disociación y agítelo manualmente para desalojar cualquier tejido atrapado en la tapa; luego reemplace el tubo en el disociador y reanude el programa.
  5. Después de la digestión de 1 h, retire el tubo de disociación y colóquelo en una campana de flujo laminar. Filtre el tumor digerido colocando un colador de células de 70 μm encima de un tubo cónico de 50 ml y canalizando el tumor digerido con una pipeta de 10 ml en el filtro. Si el filtro se obstruye, cambie a un filtro nuevo.
    1. Enjuague el tubo de disociación con 10 ml de medios frescos de digestión tumoral y pase el lavado a través del filtro.
    2. Retire el filtro de 70 μm y deséchelo.
    3. Llevar el volumen total a 40 ml con el medio de digestión tumoral.
  6. Centrifugar a 500 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
  7. Usando una pipeta aspiradora de 2 ml unida a una fuente de vacío, aspire el sobrenadante sin alterar el gránulo y resuspenda las células utilizando 10 ml de medio tumoral completo estéril.
  8. Repita el paso 2.6.
  9. Aspire el sobrenadante como se describe en el paso 2.7. Resuspend las células en 3 ml de medio tumoral completo estéril y transfiera la suspensión celular a un pocillo de una placa estéril de 6 pocillos.
  10. Mantenga la placa en una incubadora a 37 °C con un 5% de CO2.
  11. Después de 24 h, transfiera el medio utilizado del tumor digerido en el pozo 1 a un nuevo pozo (pozo 2) en la misma placa de 6 pocillos. Añadir 3 ml de medio tumoral completo estéril al pozo 1.
  12. Transfiera el medio usado de los pozos 1 y 2 y combínelo en el pozo 3 en la misma placa de 6 pocillos 24 h después del paso 2.11. Agregue 3 ml de medio tumoral completo estéril en los pozos 1 y 2.
  13. Aspire el medio de los 3 pocillos y pipetee 3 ml de medio tumoral completo en cada pozo 48 h después del paso 2.12.

3. Generación de línea celular tumoral primaria

  1. Utilizando un microscopio de fase invertida, determine el porcentaje de contaminación por fibroblastos en el cultivo de paso temprano.
    NOTA: Los fibroblastos son generalmente largos e irregulares y tienen una membrana celular mal definida. Aparecen delgados o planos en una escala Z.
    1. Si la contaminación por fibroblastos es superior al 20% de las células en el cultivo de paso temprano, continúe el cultivo después de reemplazar el medio completo con medio sérico reducido.
    2. Repita el reemplazo con medio sérico reducido en el paso 3.1.1 dos veces por semana durante 3-4 semanas.
    3. Cuando el cultivo alcanza el 80% de confluencia, pase las células dividiéndose 50:50 en 2 nuevos pocillos de una placa de 6 pocillos. Continúe con el pasaje 50:50 en medios séricos reducidos una vez que las células alcancen el 80% de confluencia.
    4. Repita el paso 3.1.3 durante un máximo de 4 semanas, pasando en matraces de cultivo más grandes según sea necesario dividiendo 50:50 una vez que el cultivo alcance el 80% de confluencia. Si la población de fibroblastos no se reduce al 10% o menos, continúe con el paso 3.2 para intentar el método de tripsinización diferencial para eliminar la contaminación por fibroblastos. De lo contrario, continúe con el paso 3.3.
  2. Para enriquecer las células tumorales, enjuague suavemente el pozo con 1x PBS para eliminar el medio que contiene suero.
    1. Agregue tripsina de la siguiente manera: 1 ml por pozo si está en una placa de 6 pocillos, 2 ml para un matraz T25, 3 ml para un matraz T75.
    2. Coloque la placa o matraz de 6 pocillos en una incubadora a 37 °C durante 1 min. Retire la placa o el matraz de la incubadora y compruebe la adhesión de las células con un microscopio invertido. Si las células están parcialmente levantadas o flotando, retire suavemente las células suspendidas y la tripsina solamente. Coloque las células en un tubo cónico de 15 ml que contenga un volumen igual o mayor de medio tumoral completo.
      NOTA: Esta colección parcial de células basada en propiedades de adhesión es la primera de múltiples fracciones.
    3. Repita los pasos 3.2.1 y 3.2.2 hasta que se levanten todas las celdas o se eliminen 4 fracciones.
    4. Centrifugar todas las fracciones independientes a 500 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
    5. Aspire el sobrenadante como se describe en el paso 2.7 y resuspenda las células utilizando 5 ml de medio sérico estéril y reducido.
    6. Coloque las células en un matraz T25 para cada fracción y coloque los matraces en una incubadora a 37 °C.
    7. Evaluar el cultivo después de 48 h para determinar qué fracción está enriquecida para las células tumorales frente a los fibroblastos. Deseche los matraces ricos en fibroblastos. Si la contaminación por fibroblastos es <10%, continúe la expansión en el medio tumoral completo y proceda al paso 4. Si la contaminación por fibroblastos es del 10-30%, repita los pasos 3.1.2-3.1.4. Si la contaminación por fibroblastos es superior al 30%, repita los pasos 3.2-3.2.7.
  3. Si se detectan pocos o ningún fibroblasto dentro del cultivo de paso temprano, continúe pasando las células en medio tumoral completo dividiendo 50:50 una vez que las células estén 80% confluentes en su placa o matraz de 6 pocillos.

4. Expansión de la línea celular tumoral primaria de paso temprano

  1. Una vez que el cultivo del tumor primario contenga un 10% o menos de contaminación por fibroblastos, aspire el medio y reemplácelo con un medio tumoral completo estéril dos veces por semana.
    NOTA: El volumen medio óptimo para un T25 es de 5 ml; T75 es de 12 ml; T150 es de 25 ml.
    1. Pasar el cultivo 50:50 a matraces más grandes según sea necesario una vez que alcance el 80% de confluencia en la placa o matraz.
      NOTA: Es posible que el cultivo deba pasarse en una proporción más alta dependiendo de su crecimiento. Ajuste para que el cultivo alcance el 80% de confluencia cada 3-5 días.
  2. Pasaje hasta que la cultura esté en el pasaje 4 o superior. Una vez que el cultivo esté confluente al 80% en un mínimo de dos matraces T75, continúe con el paso 5.

5. Caracterización y almacenamiento de la línea celular tumoral primaria establecida

  1. Criopreservar un matraz T75 como congelación de paso temprano. Para las pruebas de micoplasma de los matraces T75 restantes, continúe con el paso 5.2.
    1. Para la criopreservación de células de paso temprano, descongelar 1 tubo de medio de congelación alicitado preparado en la etapa 1.5.
    2. Recolecte las células por tripsinización lavando primero la placa con 1x PBS como se describe en el paso 3.2 y agregando tripsina como se describe en el paso 3.2.1.
    3. Coloque el matraz en una incubadora a 37 °C durante 3 min. Retire el matraz de la incubadora y compruebe la adhesión de las células con un microscopio invertido. Si las células están levantando o flotando, retire suavemente las células suspendidas y la tripsina. Coloque las células en un tubo cónico de 15 ml que contenga un volumen igual o mayor de medio tumoral completo.
      NOTA: Si las células permanecen adheridas después de 3 minutos, vuelva a colocar el matraz en la incubadora durante 2 minutos adicionales.
    4. Mezcle bien el tubo pipeteando suavemente y retire 20 μL para contar.
    5. Centrifugar el tubo a 500 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
    6. Mientras las células están girando, cuente utilizando un protocolo de conteo específico del laboratorio, como el azul de tripano o el yoduro de acridina naranja / propidio (AO / PI).
    7. Resuspender las células después de la centrifugación en medio de congelación con un mínimo de 2 × 106 celdas/medio de congelación de 1 ml.
    8. Transfiera 1 ml de la suspensión celular del paso 5.1.7 a crioviales preetiquetados de 1,5 ml.
    9. Coloque los crioviales en una cámara de congelación de velocidad controlada y transfiéralos inmediatamente a -80 °C.
    10. Almacene las células a -80 °C durante un máximo de 1 semana antes de transferirlas a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
  2. Divida un matraz T75 50:50 para la prueba de micoplasma. Cambie el medio por un medio libre de antibióticos preparado en el paso 1.6.
    1. Después de 72 h, descongele el reactivo de detección de micoplasma, el sustrato y los controles a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de la prueba.
    2. Recoger 1 mL del sobrenadante de cada cultivo a probar y colocarlo en un tubo cónico de 15 mL.
    3. Granular cualquier célula suspendida centrifugando el sobrenadante a 500 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
    4. Cargue 100 μL de sobrenadantes de muestra y controles en una placa blanca de 96 pocillos. Añadir 100 μL de reactivo de detección de micoplasma a cada muestra y control.
    5. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
    6. Coloque la placa en un lector de placas y lea la luminiscencia (Lectura A, es decir, primera lectura).
      NOTA: El protocolo del fabricante del kit de micoplasma indica mantener la configuración predeterminada en los lectores de placas multifuncionales. La lectura se establece en el punto final de luminiscencia con un tiempo de integración de 1 s y una ganancia de 135. El lector de placas utiliza una rutina de escala automática para optimizar la señal de ganancia para cada experimento. El tiempo de integración de 1 s es el predeterminado estándar. Ambos ajustes se utilizan para ajustar la intensidad de la señal luminiscente interpretada por el lector de placas y es posible que deban ajustarse en función del lector de placas individual.
    7. Retire la placa del lector de placas y agregue 100 μL del sustrato de detección de micoplasma a cada muestra y a los controles.
    8. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
    9. Coloque la placa en el lector de placas y lea la luminiscencia (Lectura B, es decir, segunda lectura).
    10. Para determinar la positividad del micoplasma, determine la proporción de lectura B a lectura A.
      NOTA: Las proporciones de positividad de Mycoplasma se describen en el protocolo del fabricante del kit de micoplasma. Las lecturas A y B se adquieren con los mismos ajustes y simplemente reflejan el orden de lectura.
      1. Considere una proporción < 1 para ser micoplasma negativo.
      2. Considere que una proporción de 1-1.2 no es concluyente y repita el paso 5.2.
      3. Considere una proporción > 1.2 para ser positivo para micoplasma y monitoree este cultivo; terminar la cultura si es necesario.
  3. Caracterización por citometría de flujo de células tumorales micoplasmáticas negativas
    1. Desalojar las células tumorales utilizando un tampón de disociación celular.
    2. Cuente las celdas y vuelva a suspender las celdas a 1 × 106/ml en el búfer FACS del paso 1.7.
    3. Retire 100 μL de suspensión celular en tubos individuales para la tinción de la superficie.
    4. Centrifugar a 500 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
    5. Aspirar el sobrenadante y bloquear los receptores Fc incubando las células en 500 μL de suero de cabra al 5% en tampón FACS a temperatura ambiente durante 10 min.
    6. Añadir 2 ml de tampón FACS y centrifugar la suspensión a 500 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
    7. Aspire el sobrenadante y agregue la mezcla de anticuerpos de la mancha superficial (Tabla 1) y el tampón FACS para que el volumen final sea de 100 μL. Cubra las muestras y las manche en hielo durante 30 min.
    8. Repita el paso 5.3.6.
    9. Aspirar el sobrenadante y fijar las células resuspiendo en 200 μL de paraformaldehído al 1% (PFA) más 0,25% etOH. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min con las muestras protegidas de la luz.
    10. Repita el paso 5.3.6. Resuspend las células en 200 μL de tampón FACS para su adquisición utilizando un citómetro de flujo apropiado.
      NOTA: Se espera que las células tumorales de mesotelioma sean positivas para mesotelina y N-cadherina. Algunos también pueden expresar CD90.
  4. Expandirse en medio tumoral completo y banco como se describe en los pasos 4.1 y 5.1, respectivamente.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Para determinar la contaminación por fibroblastos de cultivos de paso temprano, las células se evalúan utilizando un microscopio de fase invertida para identificar la frecuencia de fibroblastos en relación con las otras células adherentes presentes. La Figura 1 muestra ejemplos de aumento de la contaminación por fibroblastos del 80% (Figura 1A), 50% (Figura 1B) y 30% (Figura 1C), en comparación con un c...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Si bien este protocolo es sencillo, hay algunos pasos críticos que deben seguirse de cerca. La congelación temprana del paso es importante para preservar la capacidad de repetir el proceso de enriquecimiento de células tumorales si inicialmente no tiene éxito. La capacidad de evaluar la contaminación fibroblástica a ojo para decidir la correcta técnica de división e inanición media es vital para prevenir el crecimiento excesivo de fibroblastos en el cultivo. Además, el método de tripsinización diferencial requiere una ob...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

CH es miembro del SAB de Briacell Therapeutics y de la Mesothelioma Applied Research Foundation. Todos los demás autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a Raquel Laza-Briviesca por su contribución al inicio de este protocolo y a los Dres. Boris Sepesi, Reza Mehran y David Rice por su colaboración en la recolección de tejidos. No hay fondos adicionales asociados con este trabajo.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Pipetas serológicas de 10 mLBD Falcon357551
Tubos cónicos de 15 mLBD Falcon352097
Pipetas de aspiración de 2 mLBD Falcon357558
pipetas serológicas de 5 mLBD Falcon357543
tubos cónicos de 50 mLBD Falcon352098
Microplacas de 6 pocillos, cultivo de tejidos tratadoCorning3516
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104Una mezcla de proteasa y colagenasa considerada más eficaz en la conservación de epítopos para la citometría de flujo.
anti-CD325 (N-Cadherina) PEInvitrogen12-3259-42
anti-CD90 PE-Cy7BD Biosciences561558
anti-Mesothelin APCMiltenyi130-118-096
Albúmina sérica bovina 30%SigmaA8577-1L
Tampón de disociación celular, sin enzimasThermo Fisher Scientific13151014
Cell colador (70 y micro; m)Centrífuga Greiner Bio-One542-070
con adaptadores
Colagenasa Tipo 1Sigma-AldrichC-0130Disuelva 1,5 g de Colagenasa tipo I en 100 mL de DMEM estéril y alícuotas en volúmenes de 5 mL. Etiquete bien y almacene a -20 ° C.
Cámara de congelación de velocidad controladaThermo Fisher Scientific15-350-50
CryovialesThermo Fisher Scientific5000-0020
CulturPlate-96Packard Instrument Company6005680Microplaca blanca opaca de 96 pocillos.
Dimetilsulfóxido ThermoFisher ScientificBP231-100
ADNasa I (del páncreas bovino)Sigma-AldrichD4527Alícuota a 50 μ L, etiquete bien y almacene a -20 ° C. Después de descongelar, manténgalo a 4 & grados; C hasta por 1 mes.
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 1xCorning21-031-CV
Etanol 200 pruebaThermo Fisher ScientificA4094
FACS tubos-filtro superiorBD Falcon352235
Suero fetal bovinoGemini-Bio100-106
GentleMACS TubosC Miltenyi130-093-237
GentleMACS Octo-disociador con aparato calefactorMiltenyi130-096-427Incluye manguitos de aparato calefactor especializados que se utilizan para aplicar calor a los tubos C durante la disociación.
Suero de cabraSigma-AldrichG9023Aliquot y almacenar a -20 °C.
Solución salina equilibrada de Hank, 500 mL
Corning Sigma-AldrichH3506Disuelva 0,15 g de hialuronidasa en 100 ml de DMEM estéril y distribúyalo en alícuotas de 1,0 mL. Etiquete bien y almacene a -20 ° C.
Microscopio
flujo laminar
Tinte amarillo vivo/muertoLife TechnologiesL-34968
Puntas de micropipeta, 20 µ LART2149P
Micropipeta, 0.5-20 y micro; L
Conjunto de control de ensayo MycoalertLonzaLT07-518Controles positivos alícuotas y almacenamiento a -20 °C.
Kit de detección de micoplasma Mycoalert PlusLonzaLT07-710Reactivo y sustrato alícuota y almacenamiento a -20 °C. Guarde el tampón restante y la alícuota para el control negativo y almacene a -20 °C.
Paraformaldehído 16%Ciencias de la Microscopía Electrónica15710Prepare el material filtrándolo a través de un filtro de jeringa de PVDF (Millex n.º cat. SLVV033RS) y alícuota debajo de una campana extractora. Almacenar a -20 °C.
Penicilina-estreptomicina 10.000 U/mLGibco15140-122
Pipeta auxiliar
Lector de placas con capacidades luminiscentesBioTekSynergy HTcualquier lector de placas con estas especificaciones puede ser utilizado
RPMI 1640 medios Corning10-040-CV
BisturíAndwin2975#21
Sistema de filtración al vacío estéril Stericup Quick Release-GP, 0.22 y micro; m PES Express PLUS, 500 mLEMD MilliporeS2GPU05RE
filtro Steriflip-GP, 0,22 y micro; m PES Express PLUS, 50 mLEMD MilliporeSCGP00525
Pinzas estérilesThermo Fisher Scientific12-000-157
Matraces T25, tratados para cultivo de tejidosMatraces Corning430639
T75, tratados con cultivo de tejidosCorning430641U
Solución azul de tripano 0,4%Gibco15250-061
Tripsina EDTA 0,05% Corning25-052-CI
ViaStain solución de naranja de acridina/yoduro de propidio (AO/PI)NexcelomCS2-0106-5ML
de 15 mL y 50 mL de hialuronidasa MT21022CV de fase invertidaCampana de

Referencias

  1. Guzman-Casta, J., et al. Prognostic factors for progression-free and overall survival in malignant pleural mesothelioma. Thoracic Cancer. 12 (7), 1014-1022 (2021).
  2. Baas, P., et al. First-line nivolumab plus ipilimumab in unresectable malignant pleural mesothelioma (CheckMate 743): a multicentre, randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet. 397 (10272), 375-386 (2021).
  3. Testa, J. R., Berns, A. Preclinical models of malignant mesothelioma. Frontiers in Oncology. 10, 101(2020).
  4. Usami, N., et al. Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients. Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).
  5. Kobayashi, M., Takeuchi, T., Ohtsuki, Y. Establishment of three novel human malignant pleural mesothelioma cell lines: morphological and cytogenetical studies and EGFR mutation status. Anticancer Research. 28 (1), 197-208 (2008).
  6. Chernova, T., et al. Molecular profiling reveals primary mesothelioma cell lines recapitulate human disease. Cell Death and Differentiation. 23 (7), 1152-1164 (2016).
  7. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  8. Han, A. C., et al. Differential expression of N-cadherin in pleural mesotheliomas and E-cadherin in lung adenocarcinomas in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Human Pathology. 28 (6), 641-645 (1997).
  9. Tachibana, K. N-cadherin-mediated aggregate formation; cell detachment by Trypsin-EDTA loses N-cadherin and delays aggregate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (2), 414-418 (2019).
  10. Donnenberg, V. S., Corselli, M., Normolle, D. P., Meyer, E. M., Donnenberg, A. D. Flow cytometric detection of most proteins in the cell surface proteome is unaffected by trypsin treatment. Cytometry A. 93 (8), 803-810 (2018).
  11. Pham, K., et al. Isolation of pancreatic cancer cells from a patient-derived xenograft model allows for practical expansion and preserved heterogeneity in culture. American Journal of Pathology. 186 (6), 1537-1546 (2016).
  12. Derycke, L. D., Bracke, M. E. N-cadherin in the spotlight of cell-cell adhesion, differentiation, embryogenesis, invasion and signalling. International Journal of Developmental Biology. 48 (5-6), 463-476 (2004).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Expansión de células tumoraleslíneas tumorales primariasdisociación tumoraltripsinización diferencialcontaminación por fibroblastoscaracterización fenotípicacitometría de flujocriopreservaciónexpresión de marcadores de superficie
Generación y expansión de líneas tumorales de mesotelioma pleural maligno primario
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.