Bioensayo de aplicación tópica para cuantificar la toxicidad de insecticidas para mosquitos y moscas de la fruta

Resumen

Describimos la metodología e importancia del bioensayo de aplicación tópica para medir la susceptibilidad a insecticidas en mosquitos y moscas de la fruta. El ensayo presentado es de alto rendimiento, utiliza masa de insectos, lo que permite calcular una dosis letal relativizada en masa en lugar de concentración, y probablemente tiene una variabilidad más baja que otros métodos similares.

Resumen

El uso continuado de insecticidas para la salud pública y la agricultura ha dado lugar a una resistencia generalizada a los insecticidas y ha obstaculizado los métodos de control. La vigilancia de la resistencia a los insecticidas de las poblaciones de mosquitos generalmente se realiza a través de bioensayos de botellas de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) o pruebas de tubo de la Organización Mundial de la Salud (OMS). Sin embargo, estos métodos pueden resultar en un alto grado de variabilidad en los datos de mortalidad debido al contacto variable del insecticida con el insecto, el número relativamente pequeño de organismos probados, la amplia variación en la masa entre las poblaciones y las condiciones ambientales en constante cambio, lo que lleva a resultados variables. Este artículo presenta el bioensayo de aplicación tópica, adaptado como un bioensayo fenotípico de alto rendimiento tanto para mosquitos como para moscas de la fruta, para probar un gran número de insectos a lo largo de un rango de concentraciones de insecticidas.

Este ensayo 1) asegura un tratamiento consistente y el contacto insecticida con cada organismo, 2) produce curvas dosis-respuesta altamente específicas que tienen en cuenta las diferencias en la masa promedio entre cepas y sexos (lo cual es particularmente importante para los organismos recolectados en el campo), y 3) permite el cálculo de dosis letales medianas estadísticamente rigurosas (LD₅₀ ), que son necesarios para las comparaciones de la relación de resistencia, un enfoque de vigilancia alternativo de la mortalidad por dosis diagnósticas, que también se utiliza para la vigilancia de la resistencia a los larvicidas. Este ensayo será una herramienta complementaria para fenotipar con precisión las poblaciones de mosquitos y, como se ilustra con moscas de la fruta, es fácilmente adaptable para su uso con otros insectos. Argumentamos que este ensayo ayudará a llenar el vacío entre la resistencia a los insecticidas genotípicos y fenotípicos en múltiples especies de insectos.

Introducción

Los mosquitos son responsables de más de 700,000 muertes cada año debido a las enfermedades que transmiten a los humanos, y más de la mitad de esas muertes se deben solo a la malaria¹. El principal método preventivo contra la transmisión del paludismo y otras enfermedades transmitidas por vectores es el uso de insecticidas, a menudo en forma de mosquiteros de larga duración o fumigación residual en interiores². Sin embargo, la resistencia a los insecticidas está muy extendida entre los mosquitos y otros insectos vectores, así como^entre las plagas agrícolas ^3,4. Para gestionar eficazmente la resistencia, la vigilancia es de vital importancia⁵. Para esto, se necesitan métodos de detección de resistencia altamente precisos y de alto rendimiento. Actualmente, las herramientas de vigilancia de la resistencia a los insecticidas más extendidas para los mosquitos son la prueba^{de tubo 6} de la OMS y el bioensayo^{de botella 7 de} los CDC. Para las moscas de la fruta, el método de aplicación de contacto residual (similar al bioensayo de botella de los CDC) es un bioensayo insecticida de uso común ^8,9,10. Sin embargo, la variabilidad en los datos de estos métodos suele ser alta, con mediciones de la misma cepa de mosquito de laboratorio que oscilan entre ~ 20-70% de mortalidad en los ensayos de botellas de los CDC y 0-50% en las pruebas de tubo de la OMS cuando se exponen a dosis subletales¹¹. Tal variación es sorprendente porque se espera que la variación genética limitada en la mayoría de las cepas de laboratorio conduzca a una variación limitada de la susceptibilidad a los insecticidas en la población. Sin embargo, todavía hay un alto nivel de variación observado en los resultados del bioensayo.

Las fuentes potenciales de esta variación podrían ser el resultado de la exposición heterogénea a insecticidas entre especímenes dentro del bioensayo debido a la exposición indirecta a insecticidas a través de la superficie, efectos ambientales heterogéneos, variación biológica normal entre individuos del mismo genotipo y variación en la masa de especímenes de la misma población¹² . Un método poco utilizado con mayor replicabilidad es el bioensayo de aplicación tópica. En este ensayo, el insecticida se aplica directamente a cada insecto ^13,14, eliminando el factor de exposición heterogénea de diferentes ejemplares dentro de un mismo ensayo. Sin embargo, debido a la naturaleza de rendimiento lento de este método, no se utiliza rutinariamente como una herramienta de vigilancia de la susceptibilidad a los insecticidas para las poblaciones de mosquitos. Este artículo presenta un protocolo modificado para el bioensayo de aplicación tópica que permite exposiciones de mayor rendimiento al tiempo que corrige la variación en la masa de insectos, un parámetro que se correlaciona con los cambios en la susceptibilidad a los insecticidas¹². Una reducción en el ruido y la variación asociada a la masa en los datos de mortalidad por exposición variable a insecticidas permitiría una vigilancia técnica de la resistencia más precisa^11,15. Dichos datos podrían utilizarse para asociar con mayor precisión la resistencia fenotípica con marcadores genéticos, parámetros de aptitud y/o competencia vectorial. Además, demostramos cómo este ensayo podría adaptarse fácilmente a otras especies de insectos mediante el uso del bioensayo de aplicación tópica en moscas de la fruta, una especie de insecto de cuerpo más pequeño.

La principal limitación de las aplicaciones de contacto residual antes mencionadas es que la exposición a insecticidas puede variar de un espécimen a otro dentro del mismo ensayo. En el caso de los bioensayos de botellas de los CDC y el método de contacto, la exposición a insecticidas puede variar entre réplicas del mismo ensayo. Los insectos están expuestos a insecticidas que se distribuyen en el interior de una botella de vidrio (método de contacto y bioensayo de botellas de los CDC) o en papeles impregnados (prueba de tubo de la OMS). La concentración de insecticida en ambas superficies (vidrio y papel) es conocida y predeterminada mediante el cribado de diferentes especies de genotipos conocidos. Sin embargo, la cantidad disponible para ser potencialmente absorbida por el insecto puede variar mucho dependiendo de la superficie utilizada, los componentes de la mezcla de insecticidas y la homogeneidad con la que el insecticida se distribuye a través del material de la superficie^16,17. En el bioensayo de la botella de los CDC, el recubrimiento insecticida en el interior de la botella depende de los procedimientos empleados por cada laboratorio y usuario. En la prueba de tubo de la OMS, los papeles tratados con insecticida se producen centralmente y, por lo tanto, lo más probable es que sean bastante homogéneos en todos los laboratorios. Sin embargo, en la prueba de tubo de la OMS, el tubo de exposición permite que las muestras aterricen y descansen sobre una malla metálica no expuesta a insecticidas, lo que lleva a una posible exposición heterogénea a insecticidas entre las muestras dentro de cada prueba. La cantidad real de insecticida recogido y absorbido por los especímenes a través de cada método aún debe explorarse más^{a fondo 18}.

Además, el bioensayo de botellas de los CDC, la prueba de tubo de la OMS y el método de contacto se utilizan con mayor frecuencia como ensayos de umbral que prueban solo una concentración predeterminada de insecticida. Este enfoque puede detectar con precisión la presencia de resistencia y es valioso para la vigilancia de la resistencia (especialmente cuando la resistencia se está extendiendo). Sin embargo, los ensayos de umbral no pueden cuantificar la fuerza de la resistencia, lo que podría ser más predictivo de la eficacia de las herramientas de intervención. Si se utilizan múltiples concentraciones de insecticidas con estos métodos, entonces se pueden usar como ensayos de intensidad. Los ensayos de intensidad para el bioensayo de botellas de los CDC y la prueba de tubo de la OMS se han introducido mediante la prueba de 5x y 10 veces las dosis discriminantes predeterminadas para abordar esta brecha en la vigilancia ^6,19. Si bien proporciona una mayor capacidad para diferenciar entre poblaciones resistentes, 3-5 dosis (predeterminadas) proporcionan una resolución limitada para calcular las concentraciones letales. Además, los mosquitos de varios tamaños se utilizan en tales ensayos. Sin embargo, es importante medir la masa, ya que los especímenes más grandes podrían necesitar una dosis más alta para ser eliminados, ya que la dosis efectiva por unidad de masa será mucho menor que la de un organismo más pequeño¹². Calcular una dosis letal relativizada en masa (cantidad de insecticida por masa de insecto) sería una métrica más útil que la concentración letal más común (por ejemplo, cantidad de insecticida por área de superficie), ya que considera la variación de la masa de insectos entre sexos, poblaciones y genotipos. Tales datos ayudarían a llenar el vacío entre la resistencia genotípica y fenotípica dentro del laboratorio y el campo y también podrían proporcionar una manera fácil de calcular la concentración de aplicación necesaria para tratar una población de insectos de una masa promedio conocida.

El uso de dosis letales relativizadas en masa que matan el 50% de los especímenes (LD₅₀) también incorpora varios otros beneficios. La evaluación de la toxicidad de un compuesto específico en mg/kg (= ng/mg) es estándar en toxicología humana y veterinaria¹⁴, y los valores de DL₅₀ se encuentran en las fichas de datos de seguridad de los materiales. Las dosis letales también permiten la comparación directa de la toxicidad entre diferentes productos químicos hacia una especie en particular o el mismo producto químico hacia diferentes especies²⁰, así como la evaluación de alta calidad de nuevos insecticidas y productos químicos¹³. Además, la DL₅₀ puede proporcionar proporciones de resistencia más significativas y precisas que las derivadas de los resultados de mortalidad por dosis diagnósticas, lo que puede resultar en una sobreestimación del nivel de resistencia presente en una población. Por lo tanto, este ensayo sería adecuado para los programas de vigilancia de rutina al proporcionar un monitoreo de resistencia más riguroso basado en dosis letales relativizadas en masa derivadas de más especímenes de los recomendados para otros bioensayos²¹.

El método de aplicación tópica se ha utilizado en la vigilancia de la susceptibilidad a insecticidas para mosquitos y moscas como alternativa para los bioensayos estándar de susceptibilidad a insecticidas cuando ya se conoce o sospecha resistencia^22,23, así como para la vigilancia en algunos insectos plaga²⁴ para evaluar con mayor precisión los perfiles de resistencia y la toxicidad intrínseca del insecticida²¹ . En los bioensayos de aplicación tópica, el insecticida se aplica a cada organismo, lo que resulta en una variación mínima en la exposición al insecticida. Este artículo presenta un método ligeramente adaptado y mejorado que permite aplicar la exposición a insecticidas a un gran número de insectos en un corto período de tiempo, al tiempo que controla la masa de insectos²². Este método de mayor rendimiento con buenos niveles de replicabilidad podría ser una herramienta adicional útil para la vigilancia rutinaria de la susceptibilidad a los insecticidas.

Protocolo

NOTA: Los insecticidas pueden causar peligros para humanos, animales y ambientales²⁵. Se recomienda encarecidamente precaución, capacitación y equipo de protección personal. Asegúrese de seguir las hojas de datos de seguridad de materiales para todos los insecticidas y solventes utilizados.

1. Especímenes traseros

1. Mosquitos adultos traseros de 3-5 días de edad.
   NOTA: El siguiente protocolo refleja las condiciones para la cría de Aedes aegypti , siguiendo de cerca las directrices²⁶ de la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación.
   1. Los mosquitos traseros de todas las etapas de la vida a 27 ± 1 °C y 75 ± 5% de humedad relativa con ciclos de luz y oscuridad de 12:12 h.
   2. Eclosionar los huevos del mosquito sumergiéndolos en agua desionizada y agregando levadura²⁶, o coloque los huevos sumergidos dentro de una cámara de vacío durante 30 minutos.
      NOTA: Ambos métodos disminuyen el contenido de oxígeno dentro del agua y aumentan la eclosión²⁷.
   3. Alimente a las larvas recién nacidas con alimento para peces (o una dieta equivalente como croquetas de gato molido) dentro de bandejas y mantenga la densidad larvaria lo más similar posible entre las bandejas, ya que la densidad larvaria afecta el desarrollo¹² (por ejemplo, 200-250 larvas por bandeja que contiene un total de 1.5 L de agua).
   4. Alimente a las larvas cada dos días hasta que alcancen la etapa de pupa (aproximadamente 7-10 días), aumentando la cantidad de alimento según sea necesario.
      NOTA: Cuando se alimentan muy poco, el crecimiento larvario se atrofiará y las larvas pueden comerse entre sí. Cuando se alimentan demasiado, las larvas pueden morir, causando que el agua se ensucie.
   5. Una vez que se desarrollen las pupas, transfiéralas diariamente a un recipiente de agua en jaulas de mosquitos adultos y proporcione una solución de sacarosa al 10% ad libitum.
   6. Registre el primer día de emergencia adulta. Retire las pupas restantes de la jaula 2 días después de que comience la emergencia.
      NOTA: Los mosquitos machos emergen más rápido. Tenga en cuenta la aparición de machos y hembras por separado y asegúrese de que haya suficientes machos y hembras disponibles para cada prueba.
   7. Espere 3 días después de quitar las pupas para lograr mosquitos de 3-5 días de edad para la prueba.
2. Moscas de la fruta de la retaguardia (siguiendo vagamente los protocolos de la Universidad de Zurich²⁸).
   1. Las cepas traseras de Drosophila en botellas de stock a 23 ± 1 °C y 60 ± 5% de humedad relativa con ciclos de luz y oscuridad de 12:12 h.
      NOTA: Las botellas de stock de Drosophila deben contener 75 ml de un medio de mosca estándar, que primero se vierte como un líquido en el fondo de las botellas y luego se deja solidificar durante la noche.
   2. Transfiera las colonias a nuevas botellas de stock con alimentos frescos cada dos semanas para evitar la sobrepoblación y el crecimiento de moho. Para hacer esto, derribe moscas usando un dispensador de dióxido de carbono (CO₂) de mano, transfiera las moscas anestesiadas a un papel de pesaje en una bolsa de hielo o mesa de enfriamiento, y cepille las moscas en una botella de caldo fresco con un pincel de punta fina. Asegúrese de mantener las botellas de lado durante este proceso para evitar que las moscas caigan en la comida y se ahoguen.

2. Preparar formulaciones de insecticidas utilizando el enfoque gravimétrico

1. Realice la primera solución de stock siguiendo el enfoque gravimétrico utilizando una escala analítica con una precisión de 0,1 mg dentro de una campana extractora de humos.
   NOTA: El enfoque gravimétrico utiliza la masa para medir las cantidades de insecticida y disolvente añadido. La práctica estándar (enfoque volumétrico) requerirá una escala analítica para medir la cantidad de insecticida (sólido) agregado cuando se prepara la primera solución madre; sin embargo, la cantidad de disolvente añadido y todas las diluciones siguientes se miden únicamente por volumen. El enfoque gravimétrico tiene un mayor nivel de precisión y, por lo tanto, se prefiere.
   1. Determine la concentración objetivo de insecticida y el volumen objetivo (se recomienda un máximo de 10 ml si se usan tubos cónicos de 15 ml para evitar derrames al almacenarlos en un congelador) para la primera solución madre y calcule la cantidad de ingrediente activo insecticida (AI) que se debe agregar con Eq (1):
        (1)
   2. Prepare un tubo de almacenamiento (tubo cónico de 15 ml recomendado para volúmenes más grandes, tubos de tapa de rosca de microcentrífuga de 1,5 ml recomendados para volúmenes de 1 ml o menos) y etiquete con el nombre del insecticida y el disolvente, la concentración objetivo y la fecha de preparación. Coloque el tubo y la tapa en la báscula dentro de un bastidor o soporte y tara la báscula.
   3. Pesar la cantidad deseada de insecticida sólido o líquido AI determinada a partir del paso 2.1.1. (por ejemplo, deltametrina utilizada para los datos representativos) en el tubo y registrar la masa.
   4. Tara de la báscula y agregue el volumen deseado de disolvente (equivalente al volumen objetivo) al tubo, cierre la tapa inmediatamente y registre la masa. Cierre la tapa del tubo inmediatamente después de agregar el disolvente (acetona utilizada aquí) para evitar la evaporación y mezcle la solución.
   5. Registre la temperatura ambiente. Algunos disolventes, como la acetona, pueden tener cambios significativos en el volumen (y en consecuencia la densidad) dependiendo de la temperatura.
   6. Si se almacena inmediatamente, envuelva la tapa del tubo en parafilm (para reducir la evaporación), colóquelo en un estante / soporte de tubo (para mantenerlo en posición vertical y evitar fugas), cúbralo con papel de aluminio (para evitar la exposición a los rayos UV), colóquelo en una bolsa de plástico resellable (para reducir la evaporación) y coloque la bolsa en un congelador de -20 ° C. Si no se almacena inmediatamente, asegúrese de que la tapa esté asegurada y cúbrala con papel de aluminio o un recipiente protegido contra la luz.
   7. Calcule la concentración real de la solución madre (mg/ml) dividiendo la masa de insecticida AI añadida por el volumen de disolvente añadido (y el volumen de insecticida añadido si está en forma líquida). Para calcular el volumen de disolvente añadido (o insecticida líquido), divida la masa añadida por la densidad conocida que sea apropiada para la temperatura registrada.
   8. Calcule la densidad (g/ml) de la solución madre dividiendo la masa total añadida (insecticida y disolvente) por el volumen total añadido (disolvente e insecticida, si está en forma líquida). Consulte el paso 2.1.7 para convertir la masa líquida en volumen.
2. Diluya en serie la solución madre inicial mediante diluciones al 10%. Si es necesario, use estas diluciones en serie para crear una curva dosis-respuesta inicial para identificar el rango objetivo de concentraciones de insecticidas para el bioensayo.
   1. Calcule el volumen de la solución de caldo de insecticidas y el disolvente a agregar a cada tubo (por ejemplo, 1 ml de solución de caldo de insecticida diluida en 9 ml de disolvente para una dilución de 10 ml del 10% de la concentración anterior).
   2. Vortex la solución madre durante 10 s. Tara un primer tubo de dilución preetiquetado en la báscula. Agregue el volumen requerido de solución madre al primer tubo de dilución con una pipeta. Cierre inmediatamente la tapa de ambos tubos y registre la masa en el primer tubo de dilución.
   3. Vuelva a tarar el primer tubo de dilución y agregue el volumen requerido de disolvente. Cierre la tapa inmediatamente, registre la masa del disolvente agregado y vórtice la primera dilución durante 10 s.
   4. Repita los pasos 2.2.2 y 2.2.3 para las diluciones restantes.
   5. Almacene todas las diluciones como se describe anteriormente en el paso 2.1.6.
   6. Calcule las concentraciones reales de las diluciones siguiendo el paso 2.1.7.
   7. Calcule la densidad de cada dilución de insecticida dividiendo la masa total añadida (solución insecticida y disolvente) por el volumen total añadido (solución insecticida y disolvente). Para cada dilución en serie, utilice la densidad de dilución de la existencia de insecticida anterior para calcular la densidad de la nueva dilución después de Eq (2):
      (2)
3. Opcional: Cree diluciones de insecticidas con incrementos más pequeños por dilución en serie.
   1. Seleccione las concentraciones y volúmenes de cada nueva solución para hacer con la ayuda de una curva dosis-respuesta de las diluciones seriadas iniciales, ensayos previos o literatura publicada.
      NOTA: Las concentraciones elegidas deben dar como resultado un rango de mortalidad de 0-100%, con un mínimo de tres concentraciones de este rango para permitir el análisis de Probit.
   2. Utilice las diluciones en serie como soluciones madre para hacer cada nueva dilución y siga el paso 2.2 para crear las nuevas diluciones entre las diluciones de 10 veces.
4. Opcional: Alícuota la solución insecticida. Si se fabrican mayores volúmenes de las soluciones insecticidas, alícuite las soluciones en tubos de tapón de rosca de 1,5 ml para evitar la contaminación, evaporación y degradación de las soluciones madre por manipulación frecuente y exposición a la luz.
   1. Alícuota las soluciones, partiendo de la concentración más baja y trabaje hacia la concentración más alta para reducir la contaminación potencial. Mezcle cada solución madre mediante vórtice durante 10 s antes de abrir y pipetear el volumen deseado (por ejemplo, 0,5 ml) en un tubo de tapón de rosca preetiquetado.
   2. Guarde las alícuotas en un recipiente resistente a la luz en un congelador de -20 °C.
      NOTA: Se recomienda reemplazar regularmente (mensualmente) las alícuotas con pequeñas alícuotas nuevas tomadas directamente de las diluciones de pesticidas de stock. Esto limitará el potencial de contaminación que se traslada a otros experimentos o cambios debido a la evaporación o la degradación UV mientras las muestras se utilizan en el banco. El protocolo puede detenerse aquí y reiniciarse incluso años después, siempre que las soluciones insecticidas se almacenen correctamente (consulte el paso 2.1.6) y se conserven en el congelador de -20 °C.
5. Use un rotulador permanente para marcar el menisco antes de almacenarlo para controlar la evaporación del disolvente. Al quitar la solución insecticida para hacer alícuotas, marque el menisco cada vez que se retire la solución.

3. Preparar el espacio de trabajo de bioensayo de aplicación tópica

NOTA: Se recomienda trabajar en una carpa de manejo de insectos de sobremesa para facilitar la captura de mosquitos o moscas que escapan. Consulte la Figura suplementaria S1 para obtener imágenes de una carpa de manipulación de insectos.

1. Retire las soluciones insecticidas necesarias del congelador, vórtice inmediatamente y colóquelas en un recipiente resistente a la luz a temperatura ambiente para dejar que los insecticidas se calienten a temperatura ambiente antes de usarlos.
   NOTA: Las IA insecticidas pueden separarse del disolvente a temperaturas más frías. Además, el volumen de acetona cambia con la temperatura, lo que puede alterar la dosis de insecticida aplicada. Mezclar las soluciones y permitir que se calienten a temperatura ambiente ayuda a garantizar la consistencia al usar las soluciones insecticidas.
2. Establezca todas las herramientas y materiales necesarios para el ensayo de aplicación tópica en la carpa de manipulación de insectos como se hace referencia en la Tabla de materiales.
3. Limpie el barril y la aguja de la jeringa con acetona de grado analítico completando 5 lavados por alícuota de acetona. Completa esto con 5 alícuotas separadas para un total de 25 lavados. Consulte la Figura suplementaria S2 para las piezas del pipeteador de jeringas y repetidores.
   1. Coloque 5 tubos de microcentrífuga con 0,5 ml de acetona cada uno.
   2. Llene el barril de la jeringa con 0,025 ml de acetona del primer tubo y luego expulse la acetona a un contenedor de residuos empujando rápidamente hacia abajo el émbolo. Repita cuatro veces más para completar un total de cinco lavados de acetona de la misma alícuota de acetona. Luego, llene el barril de la jeringa completamente con aire y expulse el aire y los posibles restos de acetona en el contenedor de desechos. Repetir dos veces más para completar tres "lavados" con aire.
   3. Repita el paso 3.3.2 para los 4 tubos restantes de acetona.
   4. Cree una bolsa de aire dentro del barril entre el émbolo de la jeringa y la parte superior de la aguja tirando ligeramente del émbolo hacia el barril (~ 5 mm).
      NOTA: Esta bolsa de aire protege el émbolo del contacto con las soluciones insecticidas y reduce el arrastre de insecticidas.
   5. Deje la jeringa a un lado hasta que esté lista para su uso para la aplicación tópica.
4. Cree una clave que contenga las dosis que se aplicarán y asigne identificadores aleatorios siguiendo generadores de números o letras aleatorios (consulte el Archivo complementario 1).
5. Etiquete los vasos de plástico con la identificación aleatoria para la evaluación de la mortalidad por ciegos.
   NOTA: Si es necesario, el protocolo se puede pausar aquí y reiniciar en un día y hora posteriores. Si pasan más de unas pocas horas durante la pausa, se recomienda repetir el paso 3.3 para asegurarse de que la jeringa esté limpia y volver a colocar las soluciones insecticidas en el congelador hasta aproximadamente una hora antes de dosificar los insectos y luego repetir el paso 3.1.

4. Preparar especímenes para el bioensayo tópico. Consulte la Figura 1 para obtener una visión general del procedimiento.

1. Clasificar y pesar los mosquitos
   1. Usando un aspirador alimentado por succión de la inhalación, aspire el número deseado de mosquitos adultos de 3-5 días de edad necesarios para el ensayo, incluido un exceso para dar cuenta de las personas dañadas. Transfiera los mosquitos a un tubo cónico (hasta 100 mosquitos por tubo) colocando la punta del aspirador en el tubo con algodón envuelto alrededor de la punta y exhale suavemente y golpee el aspirador. Use el algodón para tapar el tubo cuando se retire la punta del aspirador y luego cúbralo con la tapa. Evite llenar el aspirador y los tubos con demasiados mosquitos a la vez, ya que esto agrega estrés adicional a los mosquitos y puede causar la muerte.
   2. Derribe brevemente los mosquitos en los tubos colocándolos durante un mínimo de 10 minutos a 4 ° C o enterrándolos bajo hielo en una bandeja de hielo.
      NOTA: Los mosquitos pueden mantenerse a 2 °C durante varias horas con una mortalidad mínima²⁹; sin embargo, es mejor minimizar la duración durante la cual los mosquitos están en el hielo para reducir los posibles efectos negativos.
   3. Transfiera los mosquitos derribados a la carpa de manipulación de insectos y coloque cuidadosamente los mosquitos en una bandeja de plástico (por ejemplo, placa de Petri) colocada sobre el hielo. Vierta solo unos 50 mosquitos a la vez para asegurarse de que cada uno toque la bandeja fría debajo de ella y permanezca derribada.
   4. Clasifica los mosquitos por sexo recogiéndolos suavemente por las patas (o alas) con fórceps y coloca cada sexo en una taza de sujeción separada. Cuente el número de mosquitos de cada sexo mientras clasifica y deténgase cuando se alcance el número deseado. Durante la clasificación, elimine los mosquitos que estén lesionados (por ejemplo, patas faltantes) o que sean extra grandes (por ejemplo, abdomen anormalmente agrandado) o pequeños (fácilmente distinguibles a simple vista como más pequeños que el tamaño promedio de mosquito de esa población).
      NOTA: El manejo de los mosquitos por los apéndices reduce el daño estructural a sus cuerpos primarios blandos (por ejemplo, el abdomen).
   5. Registre el peso de cada taza de mosquitos utilizando una báscula analítica con una precisión de 0,1 mg.
      1. Coloque una taza vacía con una placa de Petri como tapa en la báscula y tara la báscula. Vierta los mosquitos en el recipiente, coloque la tapa en la parte superior y coloque el recipiente en la báscula.
      2. Registre el peso combinado y el número de especímenes en la hoja de puntuación (consulte el Archivo Suplementario 2). Inmediatamente coloque la taza de especímenes de nuevo sobre hielo para mantenerlos inmovilizados.
      3. Repita los pasos 4.1.5.1-4.1.5.2 hasta que se pesen todas las tazas de especímenes.
   6. Divida los mosquitos preparados en grupos de 20-25 en tazas separadas colocadas en hielo etiquetadas con las identificaciones aleatorias. Al transferir mosquitos, trate de reducir el estrés y el daño físico causado por los fórceps. Idealmente, recoja los mosquitos usando fórceps solo 1-2 veces: una vez para clasificar / pesar y una segunda vez potencial para transferir a las tazas experimentales.
      NOTA: Un número ideal de mosquitos por taza es de 20-25, que es suficiente para una réplica, es razonable evaluar la mortalidad y no debe resultar en estrés / muerte inducida por la densidad en la taza.
2. Clasificar y pesar las moscas de la fruta
   1. Anestesiar las moscas usando CO₂ durante 7 s.
      NOTA: Si las moscas están expuestas al CO₂ durante más de 7 s, pueden tener problemas para gatear y volar cuando se despiertan³⁰.
   2. Vierta las moscas en una bolsa de hielo envuelta en papel de banco y use un pincel de punta fina para separar y contar los machos y las hembras.
   3. Use el pincel para recoger suavemente las moscas elegidas y colóquelas en una botella de caldo limpia y vacía. Elija un número igual de moscas de la fruta macho y hembra (por ejemplo, 15 machos y 15 hembras) y etiquete las botellas de stock con el nombre de la cepa y el total de moscas de la fruta (por ejemplo, Canton-S, 30 moscas).
      NOTA: Es importante tener el mismo número de moscas de la fruta hembra y macho porque las moscas de la fruta macho pueden experimentar una mayor agresión entre sí después de ser retiradas de la presencia de hembras³¹. Por lo tanto, para evitar la mortalidad o lesiones no insecticidas, es mejor tener el mismo número de machos y hembras (u omitir por completo las moscas de la fruta macho).
   4. Registre el peso de cada botella de moscas de la fruta utilizando una báscula analítica.
      1. Coloque un vial vacío (etiquetado con una identificación aleatoria, consulte el paso 3.4) con una placa de Petri como tapa en la báscula y tara la escala.
         NOTA: Se recomienda el uso de viales de vidrio con moscas de la fruta, ya que reducen significativamente la estática.
      2. Anestesiar la botella de moscas de la fruta correspondiente a la identificación aleatoria del vial utilizando CO₂ durante 7 s.
      3. Vierta las moscas de la fruta sobre el papel de pesaje y use el papel como un embudo para introducir las moscas en el vial. Coloque la tapa de la placa de Petri encima del vial de moscas de la fruta y colóquela en la báscula.
      4. Registre el peso combinado y el número de especímenes en la hoja de puntuación y luego coloque inmediatamente el vial de moscas de la fruta en una bandeja de hielo, con la tapa todavía en la parte superior para evitar que las moscas escapen.
      5. Repita los pasos 4.2.4.1-4.2.4.4 para cada botella de moscas de la fruta.
3. Cuando se completen los pasos anteriores, pase inmediatamente a la siguiente sección.

5. Muestras de dosis

1. Cargue la jeringa con la concentración adecuada de insecticida. Comience con la dosis menos concentrada y trabaje hacia la dosis más concentrada con cada grupo de organismos. Para evitar el desperdicio, solo cargue la jeringa con el volumen necesario de insecticida más un extra recomendado de 2 μL.
2. Vierta las muestras sobre papeles de pesaje colocados sobre una bandeja sobre el hielo. Separe las muestras que están muy juntas usando un pincel limpio y libre de insecticida o un hisopo de algodón para permitir un fácil acceso a cada muestra para la dosificación. Para los mosquitos, use el pincel también para asegurarse de que cada espécimen esté acostado sobre su dorso y su superficie ventral esté hacia arriba.
3. Con la jeringa, aplique una gota de solución insecticida (o acetona para el control) en el área ventral del tórax y el abdomen para los mosquitos y el dorso para las moscas de la fruta. Aplique una gota de 0,2 μL (que requiere una jeringa de 10 μL) para insectos de menor tamaño como las moscas de la fruta y una gota de 0,5 μL (que requiere una jeringa de 25 μL) para los mosquitos.
   NOTA: La sensibilidad al insecticida no difiere significativamente entre las partes primarias del cuerpo (como la cabeza, el tórax y el abdomen) en comparación con los apéndices (como las alas, las piernas o la probóscide)³². Por lo tanto, el sitio de aplicación no tiene que ser exacto siempre que la gota de dosis se aplique al cuerpo primario. El tórax ventral y el área del abdomen se eligen para los mosquitos porque a menudo se acuestan en su lado dorsal cuando se derriban, mientras que el dorso se elige para las moscas de la fruta porque a menudo se acuestan en su lado ventral cuando se derriban. Esta disminución de la especificidad del sitio de aplicación ayuda a aumentar el rendimiento de este método.
4. Vierta inmediatamente las muestras de nuevo en el vaso de plástico etiquetado y cubra el vaso con una red y una banda elástica. Coloque la taza en una bandeja de retención y anote en la taza cualquier muestra que haya sido asesinada, dañada o escapada en este proceso (para excluirla en el recuento final de muestras en esa taza). Para la primera taza, registre el tiempo en que se completa la dosificación.
5. Reemplace los papeles de pesaje en los que se colocan las muestras para evitar la contaminación por insecticida entre dosis.
6. Repita la dosificación de cada taza hasta que todos los especímenes hayan sido dosificados con las concentraciones adecuadas de insecticida y registre la hora de finalización cuando todos los especímenes han sido dosificados.
7. Proporcione una solución de sacarosa al 10% a cada taza a través de una bola de algodón empapada y deje las tazas a un lado hasta que se evalúe la mortalidad al día siguiente. Almacene los mosquitos a 27 ± 1 ° C con 75 ± 5% de humedad relativa⁵ y las moscas de la fruta a 23 ± 1 ° C con 60 ± 5% de humedad relativa.
   NOTA: Tenga cuidado al apretar las bolas de algodón para evitar la sobresaturación o subsaturación. Las bolas de algodón deben estar húmedas pero no goteando. El goteo de agua azucarada en la taza puede conducir a la mortalidad de los especímenes y, por lo tanto, afectar la evaluación de la mortalidad del insecticida.

6. Evaluar la mortalidad

1. Registre la mortalidad de los especímenes a las 24 h después del inicio de la exposición a insecticidas. Clasificar a los mosquitos como vivos si pueden volar y mantenerse erguidos; como muertos si están inmóviles o atáxicos (incapaces de pararse o despegar para volar), como lo describe la OMS⁶. Siga la misma evaluación de mortalidad para las moscas de la fruta ^8,33.
   NOTA: Para evaluar la mortalidad retardada, la mortalidad también se puede evaluar después de 48 y 72 h con cambios diarios de agua azucarada.
2. Después de registrar la mortalidad, coloque todas las tazas de especímenes en una bolsa contenida en un congelador durante al menos 1 hora para asegurarse de que todos los especímenes estén muertos antes de su eliminación o uso posterior (por ejemplo, análisis molecular o químico).

7. Realizar réplicas

1. Repita los pasos 3-6 en un nuevo conjunto de especímenes, teniendo cuidado de realizar réplicas a la misma hora todos los días, ya que la susceptibilidad a los insecticidas puede cambiar según la hora del día³⁴.
2. Asegurar un mínimo de 3 réplicas por cada concentración para una estimación precisa de la dosis letal que mata al 50% de los especímenes (DL₅₀). Incluya más réplicas si se observa un alto nivel de variabilidad.
3. Complete el análisis después de que se recopilen todos los datos.

8. Analiza los resultados

1. Registre datos en un programa de hoja de cálculo y utilice la clave de identificación aleatoria para desenmascarar los datos (paso de referencia 3.4). Guarde los datos como un archivo de texto (consulte los datos de ejemplo en el archivo complementario 3) para su análisis en el programa estadístico R³⁵ (consulte el código R de ejemplo en el archivo complementario 4) u otro software de elección³⁶.
2. Dentro del programa de software, complete el siguiente análisis. Consulte el archivo complementario 4 para ver un ejemplo de código R.
   1. Calcule la dosis de insecticida (ng) por masa de muestra (mg) después de Eq (3) a continuación:
      (3)
   2. Calcular la mortalidad y aplicar la fórmula³⁷ de Abbott para corregir la mortalidad en relación con la mortalidad observada en cada control³⁷. Alternativamente, use la fórmula de Schneider-Orelli (1947) para corregir la mortalidad³⁸. Con cualquiera de las dos fórmulas, aplique la corrección a todos los datos independientemente de la mortalidad en cada control, como se describió anteriormente³⁷ y se implementó³⁹, a menos que los datos de control sean inusualmente altos (ver discusión a continuación).
      NOTA: La fórmula de Abbott y alternativas equivalentes, como la fórmula de Schneider-Orelli, ajustan los valores de mortalidad proporcionalmente a la extensión de mortalidad no observada en los controles y no causarán una disminución en la mortalidad de las tazas que tuvieron una mortalidad del 100%. Para obtener más información, consulte las referencias citadas para estas fórmulas.
   3. Transformar los datos de mortalidad corregidos en valores de probit (unidad de probabilidad)⁴⁰ y realizar una regresión lineal entre la dosis de insecticida y los datos de mortalidad transformados. Utilice una prueba de chi cuadrado para evaluar el ajuste de los modelos lineales.
      NOTA: Los valores de mortalidad de 0 (0% de mortalidad) o 1 (100% de mortalidad) se eliminan de los datos antes de completar la transformación probit. Esto es necesario debido a la naturaleza de la transformación probit. Como tal, los datos graficados no incluirán controles positivos o negativos ni ningún otro dato que haya resultado en una mortalidad del 0% o 100% (después de que se haya aplicado la corrección de Abbott).
   4. Calcular los intervalos de confianza (IC) de_{DL 50} y 95% por cepa de muestra, población y/o sexo siguiendo los métodos publicados previamente 39,41,42.
   5. NOTA: Si los IC del 95% de dos cepas no se superponen, las cepas tienen respuestas a la dosis significativamente diferentes.
   6. Si procede, calcule las relaciones de resistencia (RR) dividiendo la DL₅₀ de la deformación de interés por la LD₅₀ de la cepa de referencia/control.

Figura 1: Diagrama de protocolo de ensayo de aplicación tópica. El protocolo de ensayo de aplicación tópica comienza con (A) la clasificación de especímenes en hielo, seguido de (B) el pesaje de especímenes en una escala analítica, (C) la dosificación de especímenes con solución (s) insecticida (s) y (D) el período de espera de 24 horas después de la exposición al insecticida con acceso a una solución de sacarosa al 10% ad libitum (a través de una bola de algodón empapada), seguido de una evaluación de mortalidad. Las flechas rojas indican la ubicación de la aplicación de insecticida objetivo para mosquitos (izquierda) y moscas de la fruta (derecha). Tenga en cuenta que la imagen no es a escala. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

Estos resultados representativos presentan dos cepas diferentes de Ae. aegypti, Rockefeller (ROCK) y una cepa de campo aislada de Florida con mutaciones conocidas de resistencia al derribo F1534C y V1016I (genotipo IICC). Además, se presenta Drosophila melanogaster (cantón: cepa S).

La Figura 2 y la Figura 3 ilustran la respuesta a la dosis de cada organismo por cepa y sexo probado siguiendo el protocolo anterior. Como no se observaron diferencias entre las curvas dosis-respuesta de los mosquitos macho y hembra dentro de cada cepa (t = 1,70, p = 0,098 para ROCK y t = 0,64, p = 0,527 para IICC), se agruparon los datos de ambos sexos dentro de cada cepa de mosquito. La DL₅₀ relativizada en masa para ROCK e IICC es de 0,008 ng/mg (IC del 95%: 0-0,104) y 0,336 ng/mg (IC del 95%: 0,235-0,438), respectivamente. Los IC del 95% de estos valores no se superponen, lo que indica respuestas a la dosis significativamente diferentes de las cepas. El RR de la cepa IICC (en relación con la cepa ROCK) es de 41,7, que según la OMS, se considera altamente resistente⁵. Para las moscas de la fruta de Cantón-S, la DL₅₀ relativizada en masa es de 0,213 ng/mg (IC del 95%: 0-0,490).

Figura 2: Datos representativos de mosquitos mediante bioensayo de aplicación tópica. Datos representativos de dosis-respuesta del bioensayo de aplicación tópica siguiendo el protocolo anterior utilizando deltametrina y mosquitos: (A) hembra Ae. aegypti ROCK (n = 880) y CEPA IICC (n = 550), (B) macho Ae. aegypti ROCK (n = 880) y IICC (n = 569) cepas. Las concentraciones de prueba de deltametrina variaron de 0,00075 ng/μL a 9,68705 ng/μL, y la dosis de deltametrina aplicada (ng) por masa media de mosquito (mg) se refleja en el eje X. La mortalidad se muestra como una proporción en el eje y. La línea negra a través de cada grupo de puntos de datos representa la tensión y la regresión lineal específica del sexo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Datos representativos de moscas de la fruta mediante bioensayo de aplicación tópica. Datos representativos de dosis-respuesta del bioensayo de aplicación tópica siguiendo el protocolo anterior utilizando deltametrina y moscas de la fruta: cepa D. melanogaster Canton-S (n = 1014). Las concentraciones de prueba de deltametrina variaron de 0,00499 a 5,02876 ng/μL, y la dosis de deltametrina aplicada (ng) por masa media de mosca de la fruta (mg) se refleja en el eje x. La mortalidad se muestra como una proporción en el eje y. La línea negra representa la regresión lineal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria S1: Carpa de manipulación de insectos de sobremesa. La carpa de manejo de insectos de sobremesa se utiliza para una captura más fácil de mosquitos o moscas que escapan durante el ensayo de aplicación tópica. La estructura está cerrada en A y abierta en B. Esta estructura fue construida con tubería de PVC y tela de malla fina. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S2: Unidad aplicadora de jeringa y repetidor. Jeringa y unidad aplicadora repetidora utilizada para la dosificación de insectos. Las partes principales incluyen 1) aguja, 2) barril de jeringa, 3) émbolo, 4) repetidor y 5) botón repetidor. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 1: Script de aleatorización: Script de aleatorización para crear etiquetas no sesgadas para todas las tazas de cada experimento. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Expediente suplementario 2: Hoja de puntuación de mortalidad: Hoja de puntuación de mortalidad para ayudar a la evaluación de la mortalidad. La hoja también incluye lugares para registrar toda otra información importante para registrar, como se hace referencia en el protocolo, como las horas de inicio y finalización de la aplicación de insecticidas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 3: Ejemplo de datos de mortalidad: Archivo de datos de ejemplo utilizado para crear la figura 2. Las descripciones de los encabezados de columna son las siguientes: "id" = código de identificación de cada punto de datos; "especie" = nombre de la especie (por ejemplo, Aedes aegypti); "insecticida" = nombre del insecticida aplicado tópicamente (por ejemplo, deltametrina); "cepa" = nombre de la cepa del mosquito (por ejemplo, ROCK); "fecha" = fecha de inicio de la aplicación tópica; "sexo" = sexo de los mosquitos; "edad" = edad de los mosquitos (jóvenes = 3-5 días de edad; edad = 4 semanas de edad); "total.mosq" = número total de mosquitos pesados en lote; "peso" = peso (mg) de todos los mosquitos dentro del lote; "concentración" = concentración de insecticida (μg/mL); "jeringa" = volumen de gotas (ml) de la jeringa; "dosis" = cantidad de ingrediente activo insecticida aplicado a cada mosquito (ng); "total" = número de mosquitos en cada taza; "muerto" = número de mosquitos muertos en cada taza. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 4: Código de análisis R: Ejemplo de código R que se puede utilizar para completar el análisis de Probit (como se describe en el paso 8 del protocolo). Los resultados representativos (accesibles a través del archivo de datos de ejemplo suplementario) se pueden utilizar con este código R. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Este trabajo presenta un protocolo adaptado para el ensayo de aplicación tópica para mosquitos y moscas de la fruta. Este procedimiento podría adaptarse fácilmente para ser utilizado en el campo y con otros organismos, ya que requiere un equipo especializado mínimo. A continuación se abordan los pasos críticos de este protocolo, las posibles modificaciones, los consejos para la solución de problemas, las limitaciones del método y la importancia de este método.

Pasos críticos en el protocolo: Hay tres pasos críticos en el protocolo que, si se completan incorrectamente, pueden afectar drásticamente los resultados del bioensayo: precisión de la concentración de insecticidas, eliminación de muestras y evaluación de la mortalidad.

Precisión de la concentración de insecticidas:
Es extremadamente importante contar con soluciones insecticidas precisas para obtener curvas dosis-respuesta replicables y resultados significativos. El enfoque volumétrico para la preparación de soluciones insecticidas es más común dentro de la literatura tanto para el bioensayo^{de botellas 7} de los CDC como para las aplicaciones tópicas ^13,14,43. Sin embargo, el enfoque gravimétrico descrito aquí es inherentemente más preciso debido a la consideración de la temperatura a través de la inclusión de la densidad (específica de la temperatura), lo que lleva a una preparación de formulación más precisa.

Derribo de muestras:
Derribar las muestras es un componente crítico de este método y permite la administración precisa del insecticida y las mediciones de peso. Sin embargo, derribar organismos inevitablemente conlleva el riesgo de estrés físico y daños, como se demostró anteriormente³⁰. Por lo tanto, tenga cuidado y tenga en cuenta al derribar las muestras para asegurarse de que i) cada muestra se derribe durante una duración similar, ii) la duración de la eliminación se mantenga al mínimo, y iii) el método de derribo se mantenga consistente en todas las muestras. Además, se recomienda probar el método de derribo por separado, antes de la aplicación del insecticida, para garantizar que el método sea exitoso y no induzca una mortalidad de control superior al 10%. La prueba inicial puede tomar más tiempo para un usuario inexperto, lo que lleva a tiempos de derribo más largos. Por lo tanto, tenga cuidado al interpretar los resultados de los primeros ensayos.

Evaluación de la mortalidad:
Evaluar la mortalidad puede ser un desafío, especialmente cuando el insecticida no mata por completo, sino que solo derriba o mutila al mosquito o la mosca. Por lo tanto, es importante ser consciente de cómo el insecticida afecta al organismo objetivo y tener una definición clara de los organismos "muertos" (o derribados) antes de comenzar. Además, se recomienda que la misma persona evalúe la mortalidad entre dosis y réplicas para reducir la variación.

Modificaciones de protocolo: Varias modificaciones descritas a continuación se pueden aplicar a este protocolo para mejorar su versatilidad y accesibilidad.

Adaptación del ensayo a insectos más pequeños o de mayor tamaño:
Cuando se utilizan especímenes más pequeños o más grandes, se recomienda aplicar un volumen de dosis más pequeño o mayor de insecticida, respectivamente. Como ejemplo, adaptamos el protocolo de mosquitos a las moscas de la fruta reduciendo la dosis de 0,5 μL a una dosis de 0,2 μL. Asegúrese de que se elige el tamaño correcto de la jeringa para el volumen de dosis elegido.

Adaptación del ensayo a insectos de campo:
Cuando se usan insectos de campo, puede haber más variación en el tamaño de los insectos. Por lo tanto, se recomendaría pesar los insectos en grupos más pequeños (por ejemplo, por taza) en lugar de como un grupo grande (por ejemplo, todos los insectos utilizados para un experimento). Esto puede ayudar a capturar la variación potencial en la susceptibilidad a los insecticidas asociada con las diferencias en la masa de insectos de campo.

Modificaciones de equipos:
Carpa de manejo de insectos: La dosificación del espécimen se puede completar bajo una carpa de manejo de insectos que simplemente se construye con tubería de PVC y mosquiteras. Esto puede ser una alternativa a una habitación cerrada (por ejemplo, insectaria) y ayudar a eliminar la posible contaminación por insecticidas en áreas donde podría ocurrir la cría de insectos. Esta carpa de manejo de insectos es fácil de construir y de bajo costo (~ $ 70). Alternativamente, se podría comprar una jaula de manejo de insectos (~ $ 425).

Mesa de enfriamiento: Se pueden usar bolsas de hielo o bandejas de hielo para derribar la muestra y / o mantener la muestra derribada.

Incubadora: Se recomiendan incubadoras para criar el espécimen y mantenerlo durante 24 horas después del tratamiento con insecticida. Si no hay una incubadora disponible, se puede construir. El equipo necesario para construir la incubadora incluye un contenedor aislado, humidificador, cables de calor, controlador de humedad y temperatura, y una luz, que debería sumar un costo total de ~ $ 170, siguiendo y ampliando los métodos anteriores⁴⁴.

Vasos de sujeción: Aunque se utilizan vasos de plástico para clasificar y sostener el espécimen tratado, los vasos de papel forrados con cera o los recipientes de vidrio serían alternativas adecuadas.

Modificación del organismo y de la etapa de la vida:
Este método es muy adaptable para su uso con otros vectores, insectos y / o artrópodos como los mosquitos Culex quinquefasciatus ³², moscas domésticas³² y cucarachas⁴⁵, así como etapas de vida no adultas, como larvas de mosquitos⁴⁶.

Modificación de la ubicación de la aplicación tópica:
Este método describe la aplicación del insecticida en el tórax ventral y la región del abdomen para los mosquitos (y el dorso para las moscas de la fruta). Sin embargo, se pueden usar otras ubicaciones de aplicación siempre que el sitio de exposición sea consistente. La consistencia es importante porque la sensibilidad a los insecticidas puede variar según la ubicación de la aplicación³².

Consejos para la solución de problemas: Este método tiene varios pasos que inicialmente son desafiantes. A continuación se describen algunos de los problemas más comunes que uno puede encontrar.

Soluciones insecticidas con fugas/evaporación:
Los insecticidas se disuelven comúnmente en acetona, un compuesto altamente volátil. Esto significa que la acetona se evapora rápidamente a temperatura ambiente, aumentando las concentraciones de insecticidas con el tiempo. Si las soluciones insecticidas parecen tener fugas o evaporarse, rehaga las soluciones, asegúrese de que la tapa del tubo esté bien encendida y verifique que los protocolos de almacenamiento se sigan correctamente (por ejemplo, se está utilizando parafilm y los tubos se almacenan en posición vertical). Si la fuga persiste, intente llenar los tubos con un volumen más bajo para permitir más espacio para el cambio en el volumen que experimenta la acetona a diferentes temperaturas. Además, si usa acetona como disolvente, asegúrese de que los tubos estén clasificados para el almacenamiento de acetona (por ejemplo, plásticos FEP, TFE y PFA). Si usa insecticidas hidrófobos, guarde las soluciones en viales de vidrio (ya que los insecticidas hidrófobos se adhieren al vidrio menos que al plástico). También es una buena práctica marcar el menisco de la solución antes de almacenarla para controlar la evaporación.

Peso a la deriva en microbalanza al pesar organismos:
Si la lectura de peso en la báscula está a la deriva (subiendo o bajando lentamente), esto podría deberse a la estática. La deriva ocurre con mayor frecuencia cuando se pesan organismos en artículos de plástico, ya que el plástico puede mantener fácilmente una carga estática. Para evitar esto, se puede colocar un papel de pesaje debajo del recipiente de plástico que se pesa, o se puede usar un recipiente no plástico como el vidrio.

Resultados de mortalidad anormal:
Hay muchas maneras en que los resultados de mortalidad pueden parecer anormales, como observar una alta mortalidad en los controles o una mortalidad alta / baja en todas las dosis de insecticidas. Revise los siguientes casos para solucionar problemas de cada escenario.

Alta mortalidad de control
Si hay una alta mortalidad en el grupo de control (10% o más), evalúe el método de derribo y el tiempo que se derriban las muestras. Si es posible, acorte el período de tiempo durante el cual los especímenes son derribados. Otros factores potenciales a considerar para una alta mortalidad en los controles incluyen i) verificar si la configuración de la incubadora es correcta: las temperaturas anormales y / o la humedad podrían conducir a un aumento de la mortalidad. La temperatura y la humedad deben verificarse con un registrador de datos independiente. ii) Evaluación del manejo de insectos. El manejo excesivo o excesivo de insectos podría conducir a una alta mortalidad. iii) Comprobar si no hay contaminación por insecticida en la acetona 100% utilizada para tratar al grupo control o en la instrumentación. Reemplace la acetona y limpie todos los instrumentos con acetona o etanol. Evite la contaminación reemplazando con frecuencia los guantes, evitando derrames y limpiando los instrumentos. Tenga en cuenta que en el Archivo Suplementario 3, un máximo de dos mosquitos murieron dentro de las tazas de control (solo acetona). Este nivel de mortalidad no se considera alto (es inferior al 10%), y por lo tanto, no había motivo de preocupación.

Alta mortalidad en todos los grupos expuestos (pero no en los grupos de control)
Use concentraciones más bajas de insecticida o volúmenes de dosis más pequeños para las pruebas. Las dosis utilizadas pueden estar por encima de la dosis mínima que no inducirá la mortalidad. Use varias diluciones de 10 veces para identificar el rango de dosis correcto y descartar la contaminación. Para evitar la contaminación, comience a dosificar con la concentración más baja y trabaje hacia la concentración más alta. Además, asegúrese de que todo el equipo utilizado se limpie regularmente con acetona y / o etanol, las dosis aplicadas a la muestra son muy pequeñas e incluso la más mínima contaminación cruzada podría afectar los resultados.

Baja mortalidad en todos los grupos expuestos
Use concentraciones más altas de insecticidas. Las dosis utilizadas pueden ser demasiado bajas para causar mortalidad en la población. Para identificar el rango de dosis correcto, exponga las muestras a varias dosis concentradas más de 10 veces. Asegúrese de que las soluciones insecticidas no hayan caducado o degradado (potencialmente debido a la alta temperatura o la exposición a la luz). Si las soluciones han caducado o se sospecha que se han degradado, vuelva a crear las soluciones y asegúrese de que se sigan las condiciones de almacenamiento adecuadas.

Mortalidad inconsistente entre réplicas/días
La hora del día en que los insectos están expuestos al insecticida podría afectar el nivel de resistencia expresado, especialmente para la resistencia metabólica³⁴. Repita este protocolo durante la misma ventana de tiempo cada día para evitar la hora del día como una variable potencial que contribuye a los cambios en la mortalidad. Otros factores potenciales que contribuyen a la mortalidad inconsistente entre réplicas incluyen i) especímenes que se crían diferencialmente entre experimentos. Asegúrese de que todos los especímenes sean del mismo rango de edad, criados a la misma temperatura y densidades y disponibilidad de alimentos similares. ii) concentraciones de insecticidas que se degradan con el tiempo o se vuelven más concentradas debido a la evaporación de la acetona. Rehaga las soluciones y garantice las condiciones de almacenamiento adecuadas. iii) Puntuación de mortalidad inconsistente. Asegúrese de que la misma persona califique la mortalidad o desarrolle un protocolo claro para ser utilizado de manera consistente en todo el equipo. Use la puntuación ciega para reducir el sesgo en la puntuación de mortalidad.

Insectos que se adhieren a la superficie de la bandeja de clasificación:
La acetona reacciona a los plásticos utilizados en este protocolo, como las placas de Petri. Es probable que la muestra se adhiera a la superficie si usa acetona en placas de Petri o superficies plásticas similares. Esta adhesión se puede evitar forrando la bandeja de clasificación con papel de pesaje o utilizando una bandeja de clasificación no plástica. Además, la condensación en la superficie del plástico en la bandeja de clasificación o en los vasos de retención puede provocar que los insectos se adhieran a la condensación, o la muestra puede estar demasiado fría y potencialmente congelarse en la superficie. Ajuste el método de derribo para reducir la condensación y evitar que las muestras se enfríen demasiado o se congelen (por ejemplo, coloque papel de pesaje entre las muestras y la bandeja de clasificación de plástico).

Errores de análisis R:
Una vez que se recopilan los datos de mortalidad, pueden ocurrir una variedad de complicaciones durante el análisis. La razón más común por la que un código R no puede completar las acciones para el archivo de datos es que el formato de datos no coincide con el código (por ejemplo, encabezados de columna y / o celdas vacías). Si surgen complicaciones más graves, consulte las páginas de ayuda de R integradas en Rstudio³⁵.

Limitaciones del método de aplicación tópica descrito anteriormente:
La absorción de insecticidas a través del método de aplicación tópica no imita la exposición natural:
La aplicación tópica en el cuerpo primario no es la forma natural de absorción de insecticidas. En el campo, los insectos absorben principalmente insecticidas a través de sus patas durante el tiempo que están en contacto con la superficie tratada con insecticida o en sus alas a través de pequeñas partículas^{de aerosol 47,48}, en lugar de una exposición rápida en la superficie ventral. Sin embargo, la aplicación directa de una dosis conocida de insecticida establecerá con precisión una respuesta fenotípica a los insecticidas, necesaria para estudios genéticos y evolutivos o comparaciones de susceptibilidad a insecticidas a través del espacio o el tiempo. Por lo tanto, este enfoque es beneficioso para probar la resistencia técnica, pero no medirá directamente la resistencia práctica (la eficacia de la herramienta de intervención real en un entorno de campo¹⁵). Sin embargo, es importante tener en cuenta que los métodos estándar actuales (por ejemplo, las pruebas de tubo de la OMS y los bioensayos de botellas de los CDC) tampoco pueden capturar o imitar la exposición a insecticidas en aerosol (es decir, empañando) en el campo.

Los ensayos de aplicación tópica solo pueden evaluar los insecticidas de absorción de contacto:
Este método está destinado a insecticidas que funcionan a través del contacto y la absorción del insecticida y no para su uso con insecticidas orales, como el ácido bórico comúnmente utilizado en cebos de azúcar tóxicos atractivos⁴⁹.

Importancia del método:
El método de aplicación tópica amplía las normas bien establecidas para los bioensayos de insecticidas calculando la dosis letal (no la concentración) y midiendo la resistencia técnica (no práctica)¹⁵. A continuación se presentan las ventajas y desventajas de este método sobre los ensayos de susceptibilidad a insecticidas existentes.

Cálculo de la dosis letal:
Este método determina la dosis letal del insecticida, en lugar de la concentración letal que los bioensayos de los CDC y la OMS utilizan para establecer la dosis discriminante¹¹. La dosis letal es más significativa porque es una cantidad cuantificada de insecticida que se sabe que provoca mortalidad. En contraste, la concentración letal no considera cuánto insecticida adquiere realmente el organismo. Cuando se utiliza el cálculo de la dosis letal, las diferencias entre los perfiles de susceptibilidad dependientes del sexo o el tamaño se pueden observar y cuantificar con mayor precisión, lo que hace que esta medición sea aún más versátil.

Resistencia técnica:
Este método evalúa la resistencia técnica, que es la resistencia medida en entornos estandarizados y controlados. Tales mediciones son adecuadas para la vigilancia de la propagación de la resistencia a los insecticidas y la vinculación de la resistencia fenotípica con marcadores potenciales¹⁵. Debido a la disminución de la variación en la mortalidad resultante del bioensayo de aplicación tópica, permite una mejor identificación de nuevos marcadores de resistencia. Sin embargo, debido a la exposición no natural de insecticidas al mosquito, este ensayo no es adecuado para la estimación de la eficacia de una intervención específica en una población específica. Se necesitan otros ensayos para medir dicha resistencia práctica¹⁵.

Adaptabilidad de la muestra:
Este método se puede practicar en otros artrópodos importantes, como plagas de cultivos (por ejemplo, escarabajo de la patata de Colorado), plagas domésticas (por ejemplo, cucarachas y chinches) o polinizadores (por ejemplo, abejas) con cambios simples en el enfoque de derribo y / o dosis, volumen y / o concentración de insecticida (como se describió anteriormente). La facilidad de adaptabilidad puede ayudar a analogizar la investigación de la resistencia a los insecticidas en diferentes campos de investigación. El uso de un valor de LD₅₀ en lugar de una concentración letal que mata al 50% de los especímenes (LC₅₀) permite una comparación precisa entre especies.

Costar:
Al igual que en los bioensayos de botellas de los CDC y las pruebas de tubos de la OMS, los costos para ejecutar el ensayo de aplicación tópica son mínimos (consulte la Tabla de materiales). Las piezas esenciales del equipo son la jeringa (aproximadamente $ 70) y el dispensador (aproximadamente $ 100), que son reutilizables en todos los ensayos.

Número de especímenes necesarios:
Se debe utilizar un mínimo de 20-25 especímenes por taza de ensayo de aplicación tópica. Se recomienda probar un mínimo de cinco concentraciones de insecticidas por experimento, con un mínimo de tres réplicas recomendadas para el procedimiento. En general, esto da como resultado un mínimo de 300-375 muestras necesarias para una prueba completa, comparable al número de muestras necesarias para realizar pruebas de intensidad de resistencia utilizando pruebas de tubos de la OMS o bioensayos de botellas de los CDC. Sin embargo, si se logra una variabilidad reducida con el bioensayo de aplicación tópica, el mismo número de especímenes puede conducir a un mayor poder estadístico para comparar los datos de susceptibilidad en el espacio o el tiempo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL Thomas	Scientific	20A00L068	Almacenamiento de alícuotas de acetona
Tubos con tapón de rosca de 1,5 mL Thomas	Scientific	1182K23	Almacenamiento de dilución de insecticida
Tubos cónicos de 15 mL VWR		339651	Almacenamiento de dilución de insecticidas
20 ml de viales de centelleo de vidrio	Fisher Scientific	0334125D	Pesaje de moscas de la fruta
25 μ Jeringa	L Fisher Scientific	14815288	Aplicador tópico
Acetona	Fisher Scientific	AC423240040	ACS 99.6%, 4 L
Aedes aegypti (cepa ICC)	USDA CMAVE	NA	Resistente a insecticidas
Aedes aegypti (cepa Rockefeller)	CDC	NA	Susceptible a insecticidas
Escala analítica	Fisher Scientific	14-557-409	Precisión de hasta 0,1 mg
Aspirador	Amazon	6.49986E+11	Dispositivo de recogida de mosquitos
Papel de banco	VWR	89126-794	Colocar debajo del espacio de trabajo
Bastoncillos de algodón	Amazon	B092S8JVQN	Uso para clasificar insectos
Bolas de algodón	Amazon	B0769MKZWT	Uso para solución
Dispensador	Fisher Scientific	1482225	Pipeta repetidora
Drosophila melanogaster (cepa Canton-S)	Universidad de Wisconsin-Madison	NA	insecticidas
Pinceles de punta fina	Amazon	B07KT2X1BK	Uso para clasificar insectos
Botellas de mosca de la fruta	Fisher Scientific	AS355	Uso para la cría y clasificación moscas de la fruta
Dispensador manual de CO2	Fisher Scientific NC1710679		Uso para derribar insectos
Tazas de sujeción	Amazon	B08DXG7V1S	Plástico transparente
Bolsa de hielo	Amazon	B08QDWMMW5	Uso para derribar moscas de la fruta
Bandejas de hielo	Amazon	9301085269	Uso para derribar insectos
Insecto pinzas	Amazon	B07B4767WR	Pinzas
para insectos Insecticida	Sigma-Aldrich Inc	45423-250MG	Deltametrina
Pegatinas de etiquetado	Amazon	B07Q4X9GWX	3/4" Pegatinas de puntos de color
Cinta de etiquetado	Amazon	B00X6A1GYK	Cinta blanca
Malla	Amazon B07F2PHHWV		Úselo para cubrir tazas de retención e insectos carpa de manipulación
Placas de Petri	Fisher Scientific	FB0875712H371	100 mm x 15 mm
Tubo	de PVC Lowe' s	23971	Materiales para la manipulación de insectos en tiendas de campaña
Bandas elásticas	Amazon	B00006IBRU	Úselo para asegurar malla/red en tazas
Sacarosa	Amazon	B01J78INO0	Azúcar blanca granulada Papel
pesaje	VWR	12578-165	4" x 4"