Artículo de método

Aislamiento y multiplexación de núcleos de baja entrada con anticuerpos con códigos de barras de ganglios simpáticos de ratón para la secuenciación de ARN de un solo núcleo

DOI:

10.3791/63397

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23 de marzo de 2022

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1Department of Anatomy & Embryology, Leiden University Medical Center, 2Department of Cardiology, Leiden University Medical Center, 3Department of Medical Statistics and Bioinformatics, Leiden University Medical Center

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe la preparación detallada de muestras de bajo aporte para la secuenciación de un solo núcleo, incluida la disección de ganglios cervicales y estrellados superiores de ratón, disociación celular, criopreservación, aislamiento de núcleos y código de barras hashtag.

Resumen

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El sistema nervioso autónomo cardíaco es crucial en el control de la función cardíaca, como la frecuencia cardíaca y la contractilidad cardíaca, y se divide en ramas simpáticas y parasimpáticas. Normalmente, existe un equilibrio entre estas dos ramas para mantener la homeostasis. Sin embargo, los estados de enfermedad cardíaca como el infarto de miocardio, la insuficiencia cardíaca y la hipertensión pueden inducir la remodelación de las células involucradas en la inervación cardíaca, que se asocia con un resultado clínico adverso.

Aunque existen grandes cantidades de datos sobre la estructura histológica y la función del sistema nervioso autónomo cardíaco, su arquitectura biológica molecular en salud y enfermedad sigue siendo enigmática en muchos aspectos. Las nuevas tecnologías, como la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq), son prometedoras para la caracterización genética de tejidos a resolución de una sola célula. Sin embargo, el tamaño relativamente grande de las neuronas puede impedir el uso estandarizado de estas técnicas. Aquí, este protocolo explota la secuenciación de ARN de un solo núcleo basada en gotas (snRNA-seq), un método para caracterizar la arquitectura biológica de las neuronas simpáticas cardíacas en la salud y la enfermedad. Se ha demostrado un enfoque gradual para realizar snRNA-seq de los ganglios cervicales superiores bilaterales (SCG) y estrellados (StG) diseccionados de ratones adultos.

Este método permite la preservación de muestras a largo plazo, manteniendo una calidad de ARN adecuada cuando las muestras de múltiples individuos / experimentos no se pueden recolectar todas a la vez en un corto período de tiempo. El código de barras de los núcleos con oligos de hashtag (HTO) permite el demultiplexo y el rastreo de distintas muestras ganglionares después de la secuenciación. Los análisis posteriores revelaron una captura exitosa de núcleos de células neuronales, gliales satélites y endoteliales de los ganglios simpáticos, según lo validado por snRNA-seq. En resumen, este protocolo proporciona un enfoque gradual para snRNA-seq de ganglios cardíacos extrínsecos simpáticos, un método que tiene el potencial de una aplicación más amplia en estudios de la inervación de otros órganos y tejidos.

Introducción

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El sistema nervioso autónomo (SNA) es una parte crucial del sistema nervioso periférico que mantiene la homeostasis corporal, incluida la adaptación a las condiciones ambientales y la patología1. Está involucrado en la regulación de múltiples sistemas de órganos en todo el cuerpo, como los sistemas cardiovascular, respiratorio, digestivo y endocrino. El SNA se divide en ramas simpáticas y parasimpáticas. Las ramas espinales del sistema nervioso simpático hacen sinapsis en los ganglios de la cadena simpática, situadas bilateralmente en posición paravertebral. Los ganglios cervicales y torácicos bilaterales, especialmente el StG, son componentes ....

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Protocolo

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Este protocolo describe todos los pasos necesarios para el snRNA-seq de los ganglios cervicales murinos y/o cervicotorácicos (estrellados). Se utilizaron ratones C57BL/6J hembra y macho (15 semanas de edad, n = 2 para cada sexo). Se utilizó un ratón Wnt1-Cre;mT/mG adicional para visualizar los ganglios con fines de disección17,18. Este ratón adicional fue generado por el cruce de un ratón B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J y un ratón B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio publica....

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Resultados

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Análisis de control de calidad de la preparación de la biblioteca de ADNc de núcleo único y snRNA-seq
Los resultados representativos describen los resultados de secuenciación de 10.000 núcleos capturados en un solo grupo con una biblioteca de expresión génica de 25.000 lecturas/núcleo y una biblioteca de hashtags de 5.000 lecturas/núcleo. La Figura 3B ilustra los resultados del control de calidad del1er hebra de ADNc, la biblioteca de expresión génica (GEX) y l.......

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Discusión

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Aquí, se describe un protocolo detallado que se centra en i) la disección de los ganglios simpáticos cervicales y estrellados superiores de ratón adulto, ii) el aislamiento y criopreservación de las células ganglionares, iii) el aislamiento del núcleo y iv) el código de barras del núcleo con etiquetado HTO para fines de multiplexación y snRNA-seq.

Con este protocolo, las células ganglionares simpáticas se pueden obtener fácilmente disociando los ganglios individuales utilizando tripsina y cola.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

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Agradecemos a Susan L. Kloet (Departamento de Genética Humana, LUMC, Leiden, Países Bajos) por su ayuda en el diseño experimental y las discusiones útiles. Agradecemos a Emile J. de Meijer (Departamento de Genética Humana, LUMC, Leiden, Países Bajos) por la ayuda con el aislamiento de ARN de un solo núcleo y la preparación de la biblioteca para la secuenciación. Este trabajo cuenta con el apoyo de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO) [016.196.346 a M.R.M.J.].

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Productos químicos y reactivos
0,25% Tripsina-EDTAThermo Fisher Scientific25200056
0,4% tinte azul de tripanoBio-Rad1450021
Antibiótico-AntimicóticoGibco15240096
B-27GibcoA3582801
Colagenasa tipo 2WorthingtonLS004176 utilizar 1.400 U/mL
de dimetilsulfóxido SigmaAldrich67685
etanol absoluto ≥ 99.5%VWRVWRC83813.360
Suero fetal bovino (baja endotoxina)BiowestS1810-500
L-glutaminaThermo Fisher Scientific25030024
Neurobasal MediumGibco21103049
Albúmina sérica bovina 10%Sigma-AldrichA1595-50MLTampón de lavado celular
DPBS (Ca2+, Mg2+ sup)Gibco14190-169Tampón de lavado celular
Solución de cloruro de magnesio, 1 MTampón de lisis del núcleoSigma-AldrichM1028
Nonidet P40 Sustituto (detergente no iónico)Sigma-Aldrich74385Tampón de lisis del núcleo
Agua libre de nucleasa (no tratada con DEPC)Tampón
de lisis del núcleo Invitrogen AM9937Protector Inhibidor de la ARNasa, 40 U/µ LTampón de lisisdel núcleo 3335399001Sigma-Aldrich
sodio, 5 MTampón de lisis del núcleoSigma-Aldrich59222C
Solución de clorhidrato de Trizma, 1 M, pH 7,4Sigma-AldrichT2194 Tampónlisis del núcleo
Albúmina sérica bovina 10%Sigma-AldrichA1595-50MLLavado del núcleo
DPBS (Ca2+, Mg< sup>2+free)Gibco14190-169Protector de lavado de núcleo
Inhibidor de RNasa,40 U/µ LSigma-Aldrich3335399001Nucleus wash
Albúmina sérica bovina 10%Sigma-AldrichA1595-50MLST (ST-SB)
Solución de cloruro de calcio, 1 MSigma-Aldrich21115-100MLST (ST-SB)
Solución de cloruro de magnesio, 1 MSigma-AldrichM1028ST (ST-SB)
Agua libre de nucleasa (no DEPC tratado)InvitrogenAM9937Tampón de tinción ST (ST-SB)
Solución de cloruro de sodio, 5MSigma-Aldrich59222CST (ST-SB)
Solución de clorhidrato de Trizma, 1M, pH 7,4Sigma-AldrichT2194ST (ST-SB)
Tween-20822184ST de Merck Millipore(ST-SB)
TotalSeq-A0451 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 1 AnticuerpoBiolegend682205Hashtag anticuerpo
TotalSeq-A0452 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 2 AnticuerpoBiolegend682207Hashtag anticuerpo
TotalSeq-A0453 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 3 AnticuerpoBiolegend682209Hashtag anticuerpo
TotalSeq-A0461 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 11 AnticuerpoBiolegend682225Hashtag anticuerpo
TotalSeq-A0462 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 12 AnticuerpoBiolegend682227Hashtag anticuerpo
TotalSeq-A0463 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 13 AnticuerpoBiolegend682229Hashtag anticuerpo
TotalSeq-A0464 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 14 AnticuerpoBiolegend682231Hashtag
anticuerpo TotalSeq-A0465 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 15Anticuerpo Biolegend682233Hashtag anticuerpo
TruStain FcX (humano)Biolegend422302solución de bloqueo de receptores
FCEquipos y consumibles
Línea brillante  HemacitómetroMerckZ359629-1EA
Centrífuga 5702/R A-4-38Eppendorf 
CoolCell LX Contenedor de congelación de celdasCorningCLS432003-1EA
CryovialThermo Scientific479-6840
DNA LoBind 0,5 mL Tubo EppendorfEppendorfEP0030108035-250EA
Eppendorf Tubos Safe-Lock 1,5 mLEppendorf30121872
Falcon 35 mm No tratado con TC Placa dePetri Corning
Falcon 15 mL Tubos de centrífuga cónicos Pinzas10773501Fisher Scientific
Dumont #5Herramientas de ciencia fina11252-40
Tijeras finas endurecidasHerramientas de ciencia fina14091-09
  Bandeja de hielo, rectangular 4 LNaranja CorningCLS432106-1EA
Leica MS5MicroscopioLeica
Tijeras Moria MC50Herramientas de ciencia fina15370-50
Tijeras de resorte Noyes Herramientas deciencia fina15012-12
Olympus CK2 ULWCDMicroscopioOlympus
P10GilsonF144802
Filtros de preseparación P1000GilsonF123602
P200GilsonF123601
(30 µ m)Miltenyi biotecMiltenyi biotec130-041-407
Baño de agua agitadoGFL1083
Placa de siliconaRubberBV3530Tablero de disección
Software y paquetes
Cell rangerV4.0.0
R programaciónV4.1.1
R sudioV1.3.1073
SeuratV4.0
tydiversoV1.3.1
Animals
B6. Ratón Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/JEl Laboratorio JacksonJAX stock #022501
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomate,-EGFP)Ratón Luo/JEl Laboratorio JacksonJAX stock #007576
ratones C57BL/6JCharles River
Code para el análisis de datos
Albúmina sérica de de Tampón de tinción Tampón de tinción Tampón de tinción Tampón de tinción Tampón de tinción Tampón de tinción EP022629905351008 de https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE

Referencias

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  1. McCorry, L. K. Physiology of the autonomic nervous system. American Journal of Pharmaceutical Education. 71 (4), 78(2007).
  2. Li, C. -Y., Li, Y. -G. Cardiac sympathetic nerve sprouting and susceptibility to ventricula....

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Etiquetas

Single Nucleus RNA SequencingNucleus IsolationBarcoded AntibodiesMouse Sympathetic GangliaCardiac Autonomic Nervous SystemHashtag OligosMultiplexed SequencingGanglia DissectionNeuronal Cell ClustersSample Preservation

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