Aislamiento y multiplexación de núcleos de baja entrada con anticuerpos con códigos de barras de ganglios simpáticos de ratón para la secuenciación de ARN de un solo núcleo

Resumen

Este protocolo describe la preparación detallada de muestras de bajo aporte para la secuenciación de un solo núcleo, incluida la disección de ganglios cervicales y estrellados superiores de ratón, disociación celular, criopreservación, aislamiento de núcleos y código de barras hashtag.

Resumen

El sistema nervioso autónomo cardíaco es crucial en el control de la función cardíaca, como la frecuencia cardíaca y la contractilidad cardíaca, y se divide en ramas simpáticas y parasimpáticas. Normalmente, existe un equilibrio entre estas dos ramas para mantener la homeostasis. Sin embargo, los estados de enfermedad cardíaca como el infarto de miocardio, la insuficiencia cardíaca y la hipertensión pueden inducir la remodelación de las células involucradas en la inervación cardíaca, que se asocia con un resultado clínico adverso.

Aunque existen grandes cantidades de datos sobre la estructura histológica y la función del sistema nervioso autónomo cardíaco, su arquitectura biológica molecular en salud y enfermedad sigue siendo enigmática en muchos aspectos. Las nuevas tecnologías, como la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq), son prometedoras para la caracterización genética de tejidos a resolución de una sola célula. Sin embargo, el tamaño relativamente grande de las neuronas puede impedir el uso estandarizado de estas técnicas. Aquí, este protocolo explota la secuenciación de ARN de un solo núcleo basada en gotas (snRNA-seq), un método para caracterizar la arquitectura biológica de las neuronas simpáticas cardíacas en la salud y la enfermedad. Se ha demostrado un enfoque gradual para realizar snRNA-seq de los ganglios cervicales superiores bilaterales (SCG) y estrellados (StG) diseccionados de ratones adultos.

Este método permite la preservación de muestras a largo plazo, manteniendo una calidad de ARN adecuada cuando las muestras de múltiples individuos / experimentos no se pueden recolectar todas a la vez en un corto período de tiempo. El código de barras de los núcleos con oligos de hashtag (HTO) permite el demultiplexo y el rastreo de distintas muestras ganglionares después de la secuenciación. Los análisis posteriores revelaron una captura exitosa de núcleos de células neuronales, gliales satélites y endoteliales de los ganglios simpáticos, según lo validado por snRNA-seq. En resumen, este protocolo proporciona un enfoque gradual para snRNA-seq de ganglios cardíacos extrínsecos simpáticos, un método que tiene el potencial de una aplicación más amplia en estudios de la inervación de otros órganos y tejidos.

Introducción

El sistema nervioso autónomo (SNA) es una parte crucial del sistema nervioso periférico que mantiene la homeostasis corporal, incluida la adaptación a las condiciones ambientales y la patología¹. Está involucrado en la regulación de múltiples sistemas de órganos en todo el cuerpo, como los sistemas cardiovascular, respiratorio, digestivo y endocrino. El SNA se divide en ramas simpáticas y parasimpáticas. Las ramas espinales del sistema nervioso simpático hacen sinapsis en los ganglios de la cadena simpática, situadas bilateralmente en posición paravertebral. Los ganglios cervicales y torácicos bilaterales, especialmente el StG, son componentes importantes que participan en la inervación simpática cardíaca. En estados de enfermedad, como la isquemia cardíaca, puede ocurrir una remodelación neuronal, lo que resulta en una sobremarcha simpática². La remodelación neuronal se ha demostrado en múltiples estudios histológicos en humanos y varias otras especies animales 3,4,5,6. Actualmente falta una caracterización biológica detallada de la remodelación neuronal inducida por isquemia cardíaca en los ganglios simpáticos cardíacos, y las características biológicas fundamentales de los tipos o subtipos de células neuronales especializadas dentro del sistema nervioso simpático cardíaco (SNS) aún no están completamente determinadas en salud y enfermedad⁷.

Nuevas tecnologías, como scRNA-seq, han abierto puertas de entrada para la caracterización genética de tejidos pequeños a nivel unicelular ^8,9. Sin embargo, el tamaño relativamente grande de las neuronas puede impedir el uso optimizado de estas técnicas unicelulares en humanos¹⁰. Además, la secuenciación de una sola célula requiere un alto rendimiento de células para recuperar un número suficiente de células debido a una alta pérdida en el proceso de secuenciación. Esto podría resultar desafiante cuando se estudian tejidos pequeños que son difíciles de capturar en una sesión y requieren múltiples muestras para introducir suficientes células individuales para la secuenciación. La tecnología snRNA-seq basada en gotas recientemente desarrollada (es decir, la plataforma 10x Chromium) permite el estudio de las diferencias biológicas entre núcleos individuales^11,12. snRNA-seq tiene una ventaja sobre scRNA-seq para células grandes (>30 μm), que pueden no ser capturadas en Gel Bead en Emulsiones (GEMs), así como una mejor compatibilidad con disociación extensa y/o preservación prolongada 13,14,15.

La heterogeneidad, el número de células neuronales y otras células enriquecidas en el SNS cardíaco son aspectos importantes para la caracterización del SNA en estados de salud y enfermedad. Además, la inervación específica del órgano o región por cada ganglio simpático contribuye a la complejidad del SNS. Además, se ha demostrado que los ganglios cervicales, estrellados y torácicos de la cadena simpática inervan diferentes regiones del corazón¹⁶. Por lo tanto, es necesario realizar un análisis de núcleo único de células ganglionares derivadas de ganglios individuales para estudiar su arquitectura biológica.

El snRNA-seq basado en gotas permite el perfil de expresión de todo el transcriptoma para un grupo de miles de células de múltiples muestras a la vez con costos más bajos que las plataformas de secuenciación basadas en placas. Este enfoque permite que el snRNA-seq basado en gotas sea más adecuado para la clasificación del fenotipo celular y la identificación de nuevas subpoblaciones de células dentro del SCG y el StG. En particular, este protocolo proporciona un enfoque paso a paso conciso para la identificación, el aislamiento y la secuenciación del ARN de un solo núcleo de los ganglios cardíacos extrínsecos simpáticos, un método que tiene el potencial de una amplia aplicación en estudios de la caracterización de los ganglios que inervan otros órganos y tejidos relacionados en salud y enfermedad.

Protocolo

Este protocolo describe todos los pasos necesarios para el snRNA-seq de los ganglios cervicales murinos y/o cervicotorácicos (estrellados). Se utilizaron ratones C57BL/6J hembra y macho (15 semanas de edad, n = 2 para cada sexo). Se utilizó un ratón Wnt1-Cre;mT/mG adicional para visualizar los ganglios con fines de disección^17,18. Este ratón adicional fue generado por el cruce de un ratón B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J y un ratón B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio publicada por los NIH y aprobada por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Leiden (número de licencia AVD1160020185325, Leiden, Países Bajos). Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, equipos, software y animales utilizados en el protocolo.

1. Preparativos

NOTA: Todos los pasos se realizan en un gabinete de flujo de cultivo celular.

1. Limpie las pinzas y tijeras sumergiendo los instrumentos en etanol al 70% durante 20 min.
2. Preparar el medio ganglionar que consiste en Medio Neurobasal suplementado con B-27 más (1x), L-glutamina (2 mM) y 1% Antibiótico-Antimicótico. Precalentar el medio ganglionar a temperatura ambiente.
3. Preparar la solución de digestión: 0,25% tripsina-EDTA (1:1) y 1.400 U/ml colagenasa tipo 2 disuelta en el medio ganglionar.
4. Preparar tampón de lavado celular fresco y frío (4 °C) (0,4% de albúmina sérica bovina [BSA]) y tampón de lisis (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl₂ y detergente no iónico al 0,1%, 40 U/mL RNAse en agua libre de nucleasas) para el aislamiento del núcleo.
5. Prepare el tampón de lavado del núcleo (1x solución salina tamponada con fosfato [PBS] con BSA al 2.0% e inhibidor de la RNasa 0.2U / μL).
6. Prepare el tampón de tinción ST (ST-SB) (10 mM Tris-HCl, 146 mM NaCl, 21 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 2% BSA, 0.02% Tween-20 en agua libre de nucleasas).

2. Disección de ganglios cervicales superiores (SCG) de ratón adulto

1. Sacrificar a los ratones y mantenerlos en hielo.
   NOTA: En el estudio actual, un total de 4 ratones C57BL6 / J fueron sacrificados por asfixia de CO₂ . Alternativamente, se puede usar isoflurano seguido de exanguinación cuando se necesita recolectar una gran cantidad de sangre para otros fines de estudio.
2. Fije el ratón en una tabla de disección con alfileres y rocíelo con etanol al 70% para minimizar la dispersión del pelaje (no es necesario afeitarse).
3. Bajo un estereomicroscopio, abra la piel de la región del cuello haciendo un corte de línea media con tijeras, mueva las glándulas submandibulares a un lado y retire el músculo esternomastoideo para exponer y localizar la arteria carótida común y su bifurcación (Figura 1A, B, ver flecha).
4. Diseccionar la bifurcación de la arteria carótida derecha e izquierda y el tejido adherido a ella. Transfiera cada pieza diseccionada de tejido a una placa de Petri separada de 3,5 cm que contenga PBS frío.
5. Busque el SCG unido a la bifurcación carotídea. Limpie aún más el SCG extirpando la arteria y otro tejido adherido en la placa de Petri (Figura 1E).

3. Disección de ganglios estrellados de ratón adultos (StG)

1. Para diseccionar el StG, haga un corte de línea media en el abdomen, seguido de abrir el diafragma y la pared torácica ventral.
2. Retire el corazón y los pulmones para exponer el tórax dorsal. Busque el StG anterolateral izquierdo y derecho al musculus colli longus (MCL) a nivel de la primera costilla (Figura 1C, D, indicado por líneas discontinuas).
3. Diseccionar stG izquierdo y derecho con fórceps y transferirlos por separado a placas de Petri de 3,5 cm que contengan PBS frío (Figura 1F).
   ​

4. Aislamiento y criopreservación de células ganglionares de ratón

Los pasos 4-6 se resumen en la Figura 2.

1. Transfiera cuidadosamente todos los SCG y StG individuales para separar los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml con fórceps.
   NOTA: No use puntas de pipeta para transferir los ganglios porque los ganglios son propensos a adherirse a la pared de las puntas de pipeta de plástico.
2. Añadir 500 μL de solución de tripsina-EDTA al 0,25% a cada tubo de microcentrífuga e incubar en un baño de agua agitadora a 37 °C durante 40 min.
   NOTA: Este paso tiene como objetivo facilitar la digestión y la liberación celular en lo sucesivo en la solución de colagenasa tipo 2.
3. Prepare un tubo de 15 ml que contenga 5 ml de medio ganglionar para cada muestra. Permita que los ganglios se asienten en la parte inferior de los tubos de la microcentrífuga. Recoja el sobrenadante, que contiene muy pocas células ganglionares, transfiera el sobrenadante a los tubos preparados de 15 ml y etiquete cada tubo. Alternativamente, para ahorrar algo de tiempo, aspire el sobrenadante de tripsina-EDTA sin recolección, ya que se pueden detectar muy pocas células disociadas en él.
   NOTA: Se puede dejar una pequeña cantidad de solución de tripsina-EDTA (~ 10-30 μL) en el tubo de la microcentrífuga para evitar la eliminación de los ganglios. Evite el pipeteo en este paso porque puede dañar los ganglios y conducir a una baja producción de células ganglionares después.
4. Añadir 500 μL de solución de colagenasa tipo 2 en cada tubo de microcentrífuga e incubar en un baño de agua agitadora a 37 °C durante 35-40 min. Trate de resuspendir el ganglio después de 35 minutos; si el ganglio todavía está intacto y no se disocia, prolongue el tiempo de incubación o aumente la concentración de solución de colagenasa tipo 2 según sea necesario.
   NOTA: El tiempo de incubación puede variar dependiendo del tamaño del ganglio.
5. Resuspend los ganglios en solución de colagenasa mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo ~ 10 veces o hasta que ya no se detecten grupos de tejido.
6. Transfiera la suspensión celular al tubo de 15 ml utilizado anteriormente que contiene el medio de cultivo de ganglios y la suspensión de tripsina-EDTA del mismo ganglio. Gire hacia abajo la suspensión de la celda con una centrífuga de rotor de cuchara oscilante durante 10 minutos, 300 × g a temperatura ambiente. Deseche cuidadosamente el sobrenadante celular.
   NOTA: Debido a que las células ganglionares están disociadas de un solo ganglio, la bolita celular puede ser demasiado pequeña para detectarla a simple vista; se puede dejar una pequeña cantidad de sobrenadante en el tubo para evitar la eliminación accidental de la bolita celular.
7. Resuspend las células ganglionares en 270 μL de suero fetal bovino (FBS, endotoxina baja) y transferir cada suspensión célula-FBS a un criovial de 1 mL.
8. Para contar las células, mezcle 5 μL de la suspensión de células ganglionares con 5 μL de colorante azul tripano al 0,4% y cargue la mezcla en un hemocitómetro. Cuente el número total y de células vivas bajo un microscopio.
   NOTA: La viabilidad celular (recuento de células vivas/recuento total de células = viabilidad %) suele estar por encima del 90% con este protocolo de disociación. El recuento de células vivas de un solo ganglio (ya sea SCG o StG) generalmente cae dentro del rango de 9,000-60,000 células cuando el ganglio se aísla de un ratón de 12 a 16 semanas de edad.
9. Agregue 30 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) a cada suspensión de células-FBS en los crioviales, mezcle bien y transfiera los crioviales a un recipiente de congelación celular, que se mantiene a temperatura ambiente. Guarde el recipiente cargado de criovial a -80 ° C durante la noche y transfiera los crioviales a nitrógeno líquido al día siguiente para su preservación a largo plazo antes de la secuenciación.

5. Aislamiento del núcleo

NOTA: El SCG izquierdo y derecho aislado de cuatro ratones (en total 8 muestras) se utilizó como ejemplo en la siguiente preparación de aislamiento y secuenciación del núcleo. Mantenga todo en hielo durante todo el procedimiento. Debido a la invisibilidad de los pequeños gránulos de núcleo, se recomienda encarecidamente una centrífuga con cubos oscilantes para facilitar la eliminación del sobrenadante durante todo el procedimiento.

1. Preparar tubos de 15 ml con un colador (30 μm) en la parte superior y preenar el colador con 1 ml del medio ganglionar.
2. Saque los crioviales del nitrógeno líquido e inmediatamente descongele en un baño de agua a 37 °C. Cuando quede una pequeña bolita de hielo en el criovial, saque los crioviales del baño de agua.
3. Recupere las células ganglionares dejando caer 1 ml del medio ganglionar en cada criovial mientras se agita cuidadosamente con la mano. Opcional: Para evaluar la recuperación celular, mezcle la suspensión celular después de la recuperación y saque 5 μL de suspensión celular para el conteo de células vivas, como se describe en el paso 4.8.
4. Cargue cada suspensión de células ganglionares en un colador separado (preparado en el paso 5.1) y enjuague cada colador con 4-5 ml de medio ganglionar.
5. Centrifugar la suspensión celular tensada durante 5 min a 300 × g, retirar el sobrenadante con cuidado y resuspendir las células en 50 μL de tampón de lavado celular.
6. Transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de ADN/ARN de baja unión de 0,5 ml.
7. Centrifugar la suspensión celular a 500 × g durante 5 min a 4 °C.
8. Retire 45 μL del sobrenadante sin tocar la parte inferior del tubo para evitar desalojar la bolita celular.
9. Agregue 45 μL de tampón de lisis refrigerado y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo con una punta de pipeta de 200 μL.
10. Incubar las células durante 8 min sobre hielo.
11. Añadir 50 μL de tampón de lavado de núcleo frío a cada tubo. No mezclar.
12. Centrifugar la suspensión del núcleo a 600 × g durante 5 min a 4 °C.
13. Retire 95 μL del sobrenadante sin interrumpir el núcleo pellet.
14. Agregue 45 μL de tampón de lavado de núcleo refrigerado al pellet. Opcional: Tomar 5 μL de suspensión de núcleo, mezclar con 5 μL de azul de tripano al 0,4% para contar, y comprobar la calidad de los núcleos bajo un microscopio con un hemocitómetro.
15. Centrifugar la suspensión del núcleo a 600 × g durante 5 min a 4 °C.
16. Retire el sobrenadante sin tocar la parte inferior del tubo para evitar desalojar el núcleo pellet.

6. Código de barras nucleus con hashtag oligos (HTOs) y multiplexación

NOTA: Los pasos de tinción HTO fueron modificados y optimizados para el etiquetado nuclear de cantidades muy bajas de núcleos (ganglionares) de acuerdo con la aplicación previa en tejido cortical por Gaublomme et ^al.15.

1. Agregue 50 μL de tampón ST-SB al gránulo del núcleo, pipetee suavemente 8-10 veces hasta que los núcleos se resuspendan por completo.
2. Añadir 5 μL de reactivo de bloqueo de Fc por 50 μL de la mezcla ST-SB/núcleos e incubar durante 10 min sobre hielo.
3. Añadir 1 μL (0,5 μg) de anticuerpo hashtag de un solo núcleo por tubo de la mezcla ST-SB/núcleos e incubar durante 30 min en hielo.
   NOTA: Un tiempo de incubación más corto conduce a una menor eficiencia del etiquetado de hashtags, como se demuestra en los resultados representativos.
4. Añadir 100 μL de ST-SB a cada tubo. No mezclar.
5. Centrifugar la suspensión del núcleo durante 5 min, 600 × g a 4 °C.
6. Retire 145 μL del sobrenadante sin interrumpir el núcleo pellet.
7. Repita los pasos 6.4 y 6.5. Retire el sobrenadante tanto como sea posible sin tocar la parte inferior del tubo para evitar desalojar el núcleo pellet.
8. Resuspend el núcleo pellet en 50 μL de ST-SB, y mezclar suavemente los núcleos.
9. Tome 5 μL de la suspensión del núcleo y mézclelo con 5 μL de azul de tripano al 0,4% para contar los núcleos bajo un microscopio. Vea la Figura 3A para una imagen representativa de núcleos mezclados con azul tripano y cargados en un hemocitómetro.
10. Centrifugar la suspensión del núcleo durante 5 min a 600 × g a 4 °C.
11. Resuspendir los núcleos en ST-SB para alcanzar una concentración de núcleo objetivo de 1.000-3.000 núcleos/μL para cada muestra de acuerdo con el recuento de núcleos correspondiente.
12. Agrupe las muestras para lograr el número deseado de celdas.
    NOTA: Por ejemplo, en este experimento, 8 muestras se agruparon igualmente para lograr un total de 25,000 núcleos para proceder inmediatamente a 10x Genomics Chromium y snRNA-seq después. El recuento de núcleos generalmente cae dentro del rango de 6,000-40,000 células cuando el ganglio se aísla de un ratón de 12 a 16 semanas. Solo alrededor de la mitad del total de núcleos cargados puede ser capturado por snRNA-seq basado en gotas. Por ejemplo, se preparó una mezcla de 25.000 núcleos para garantizar la captura de 10.000 núcleos, que es necesaria para una mayor preparación y secuenciación de la biblioteca.

Resultados

Análisis de control de calidad de la preparación de la biblioteca de ADNc de núcleo único y snRNA-seq
Los resultados representativos describen los resultados de secuenciación de 10.000 núcleos capturados en un solo grupo con una biblioteca de expresión génica de 25.000 lecturas/núcleo y una biblioteca de hashtags de 5.000 lecturas/núcleo. La Figura 3B ilustra los resultados del control de calidad del^1er hebra de ADNc, la biblioteca de expresión génica (GEX) y l...

Discusión

Aquí, se describe un protocolo detallado que se centra en i) la disección de los ganglios simpáticos cervicales y estrellados superiores de ratón adulto, ii) el aislamiento y criopreservación de las células ganglionares, iii) el aislamiento del núcleo y iv) el código de barras del núcleo con etiquetado HTO para fines de multiplexación y snRNA-seq.

Con este protocolo, las células ganglionares simpáticas se pueden obtener fácilmente disociando los ganglios individuales utilizando tripsina y cola...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Productos químicos y reactivos
0,25% Tripsina-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200056
0,4% tinte azul de tripano	Bio-Rad	1450021
Antibiótico-Antimicótico	Gibco	15240096
B-27	Gibco	A3582801
Colagenasa tipo 2	Worthington		LS004176 utilizar 1.400 U/mL
de dimetilsulfóxido Sigma	Aldrich	67685
etanol absoluto ≥ 99.5%	VWR	VWRC83813.360
Suero fetal bovino (baja endotoxina)	Biowest	S1810-500
L-glutamina	Thermo Fisher Scientific	25030024
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
Albúmina sérica bovina 10%	Sigma-Aldrich	A1595-50ML	Tampón de lavado celular
DPBS (Ca2+, Mg2+ sup)	Gibco	14190-169	Tampón de lavado celular
Solución de cloruro de magnesio, 1 M	Tampón de lisis del núcleo	Sigma-Aldrich	M1028
Nonidet P40 Sustituto (detergente no iónico)	Sigma-Aldrich	74385	Tampón de lisis del núcleo
Agua libre de nucleasa (no tratada con DEPC)	Tampón
de lisis del núcleo Invitrogen AM9937Protector Inhibidor de la ARNasa, 40 U/µ L	Tampón de lisis	del núcleo 3335399001	Sigma-Aldrich
sodio, 5 M	Tampón de lisis del núcleo	Sigma-Aldrich	59222C
Solución de clorhidrato de Trizma, 1 M, pH 7,4	Sigma-Aldrich	T2194 Tampón	lisis del núcleo
Albúmina sérica bovina 10%	Sigma-Aldrich	A1595-50ML	Lavado del núcleo
DPBS (Ca2+, Mg< sup>2+free)	Gibco	14190-169	Protector de lavado de núcleo
Inhibidor de RNasa,40 U/µ L	Sigma-Aldrich	3335399001	Nucleus wash
Albúmina sérica bovina 10%	Sigma-Aldrich	A1595-50ML	ST (ST-SB)
Solución de cloruro de calcio, 1 M	Sigma-Aldrich	21115-100ML	ST (ST-SB)
Solución de cloruro de magnesio, 1 M	Sigma-Aldrich	M1028	ST (ST-SB)
Agua libre de nucleasa (no DEPC tratado)	Invitrogen	AM9937	Tampón de tinción ST (ST-SB)
Solución de cloruro de sodio, 5M	Sigma-Aldrich	59222C	ST (ST-SB)
Solución de clorhidrato de Trizma, 1M, pH 7,4	Sigma-Aldrich	T2194	ST (ST-SB)
Tween-20	822184	ST de Merck Millipore	(ST-SB)
TotalSeq-A0451 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 1 Anticuerpo	Biolegend	682205	Hashtag anticuerpo
TotalSeq-A0452 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 2 Anticuerpo	Biolegend	682207	Hashtag anticuerpo
TotalSeq-A0453 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 3 Anticuerpo	Biolegend	682209	Hashtag anticuerpo
TotalSeq-A0461 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 11 Anticuerpo	Biolegend	682225	Hashtag anticuerpo
TotalSeq-A0462 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 12 Anticuerpo	Biolegend	682227	Hashtag anticuerpo
TotalSeq-A0463 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 13 Anticuerpo	Biolegend	682229	Hashtag anticuerpo
TotalSeq-A0464 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 14 Anticuerpo	Biolegend	682231	Hashtag
anticuerpo TotalSeq-A0465 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 15	Anticuerpo Biolegend	682233	Hashtag anticuerpo
TruStain FcX (humano)	Biolegend	422302	solución de bloqueo de receptores
FCEquipos y consumibles
Línea brillante  Hemacitómetro	Merck	Z359629-1EA
Centrífuga 5702/R A-4-38	Eppendorf
CoolCell LX Contenedor de congelación de celdas	Corning	CLS432003-1EA
Cryovial	Thermo Scientific	479-6840
DNA LoBind 0,5 mL Tubo Eppendorf	Eppendorf	EP0030108035-250EA
Eppendorf Tubos Safe-Lock 1,5 mL	Eppendorf	30121872
Falcon 35 mm No tratado con TC Placa de	Petri Corning
Falcon 15 mL Tubos de centrífuga cónicos Pinzas	10773501		Fisher Scientific
Dumont #5	Herramientas de ciencia fina	11252-40
Tijeras finas endurecidas	Herramientas de ciencia fina	14091-09
Bandeja de hielo, rectangular 4 L	Naranja Corning	CLS432106-1EA
Leica MS5	Microscopio	Leica
Tijeras Moria MC50	Herramientas de ciencia fina	15370-50
Tijeras de resorte Noyes Herramientas de	ciencia fina	15012-12
Olympus CK2 ULWCD	Microscopio	Olympus
P10	Gilson	F144802
Filtros de preseparación P1000	Gilson	F123602
P200	Gilson	F123601
(30 µ m)	Miltenyi biotec	Miltenyi biotec130-041-407
Baño de agua agitado	GFL	1083
Placa de silicona	RubberBV	3530	Tablero de disección
Software y paquetes
Cell ranger	V4.0.0
R programación	V4.1.1
R sudio	V1.3.1073
Seurat	V4.0
tydiverso	V1.3.1
Animals
B6. Ratón Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J	El Laboratorio Jackson	JAX stock #022501
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomate,-EGFP)Ratón Luo/J	El Laboratorio Jackson	JAX stock #007576
ratones C57BL/6J	Charles River
Code para el análisis de datos