Trasplante de piel murina

Resumen

Alogénico de piel el trasplante es un modelo estándar de ensayo de las respuestas de acogida de las células T a los antígenos MHC-donantes dispares. Este vídeo-artículo proporciona un tutorial visual de cada paso involucrado en la realización de un trasplante de BALB/c--> C57BL / 6 la piel.

Resumen

Como uno de los modelos más exigentes y por lo menos técnicamente difícil, el trasplante de piel es un método estándar de ensayo de las respuestas de acogida de las células T a los antígenos MHC-donantes dispares. El objetivo de este video-artículo es proporcionar al espectador con una demostración paso a paso visual de trasplante de piel mediante el modelo de ratón. El protocolo se divide en cinco componentes principales: 1) la recolección de los donantes de piel, 2) la preparación de receptores para trasplante, y 3) trasplante de piel, 4) la eliminación vendaje y el rechazo del injerto de vigilancia; 5) consejos útiles. Una vez que competente, el procedimiento en sí mismo debe tener <10 minutos para llevar a cabo.

Protocolo

Antes del inicio del experimento:

• Obtener la aprobación de IACUC
• Esterilizar los instrumentos quirúrgicos y Q-tips

Cosecha I. donantes de tejidos

1. Eutanasia ratón donante (de acuerdo con SOP institución)
2. El cabello húmedo de la base de la oreja con alcohol
3. Cosecha de piel del donante cortando una oreja en la base
4. Coloque el tejido en la placa de hielo
5. Oído dividida: una pizca lados ventral y dorsal de tejido en la base de la oreja con una pinza de dientes de rata, con cuidado se separan los tejidos, los tejidos flotar dorsal, la superficie interna hacia abajo, en PBS en hielo; descartar aleta ventral colágeno

II. Prepare Receptor de un trasplante

1. Ratón anestesiar utilizando el procedimiento de aprobación
2. Administrar analgésicos para aliviar el dolor post-operatorio (es decir, 0,05-0,1 mg / g ip Bupernex)
3. Coloque el cursor en la posición lateral
4. Realizar una pizca cara a garantizar los animales es lo suficientemente sedado
5. El pelo mojado con alcohol y afeitarse tórax
6. Limpie el área limpia con alcohol hisopo

III. Trasplante de piel

1. Haga una incisión ~ cm: la piel consistente con pinzas de dientes de ratas y cortar ~ 0.25-0.5 cm por debajo de fórceps
2. Quite la piel de los donantes de PBS, lugar encima de la cama del injerto (con la superficie interna de la piel de la oreja hacia lecho del injerto), y eliminar el exceso de PBS estéril con Q-tip
3. Con cuidado, cortar la piel del donante en exceso de modo que el trasplante está rotundamente en lecho del injerto (asegurándose de que los bordes del injerto no se doblan bajo y que la corrupción no la resaca sobre la piel del tronco del receptor)
4. Envuelva destinatario vendaje estéril (con el segmento de gasa no adhesivo se coloca sobre el injerto de piel)
5. Asegúrese de que no se venda muy apretada (evaluar la respiración del animal) y que las armas son libremente móviles
6. Vendaje de seguro con una sola sutura de seda 2-0
7. Animales a cabo en jaula limpia (debajo de la lámpara de calefacción hasta los animales se ha recuperado lo suficiente de la anestesia)
8. Monitor de 1-2/day receptor de señales de angustia y administrar analgésicos si es necesario para aliviar el dolor

IV. Vendaje de eliminación (6-7 días después del trasplante)

1. Ratón anestesiar utilizando el procedimiento de aprobación
2. Cortar y retirar la sutura de seda
3. Utilizando tijeras de punta roma final, corte con cuidado a través de vendaje (teniendo cuidado de no perturbar injerto) y extraer con cuidado
4. Retorno del ratón de la jaula limpia
5. Compruebe injerto ~ 8 horas después de la eliminación vendaje en busca de signos de formación de costras o contracción. Si está presente, el injerto puede haber fallado a vascularizan y debe ser considerado como un fallo técnico.
6. Diario de los signos de rechazo (por lo general se define como la necrosis ~ 80% del tejido de un donante)
7. Los trasplantes alogénicos de piel por lo general rechazan entre d8-12 después de la operación

V. Consejos útiles

1. La recolección de los donantes de tejidos cerca de la base de la oreja: 1) maximizar el tamaño del injerto, y 2) proporcionar una proyección desigual ventral que faciliten la separación
2. Siempre use una hoja de afeitar nueva para el afeitado destinatario
3. Si analgésico se debe administrar ip, administrar antes del trasplante procedimiento para reducir al mínimo después de la operación de manejo (reducir al mínimo la posibilidad de interrumpir el injerto)
4. Si es posible, quítese los guantes antes de aplicar el vendaje. Guantes tienden a pegarse el vendaje y complican la aplicación
5. La colocación de una sutura simple en el extremo vendaje minimizar eliminación prematura
6. El vendaje tan apretado como lo permite evaluar y respiración antes de la colocación de sutura. Si venda está demasiado apretada, animal deja de respirar. Si vendaje está demasiado suelto, los animales se eliminará.

Discusión

Como se ha demostrado en este video-artículo, el modelo de trasplante de piel es un método fácil y rápido para el seguimiento alogénico de células T respuestas. Alogénico trasplante de piel tiene una amplia gama de aplicaciones y se ha utilizado para analizar la eficacia de una variedad de agentes inmunosupresores y los protocolos de inducción de la tolerancia, así como para investigar los efectos biológicos de diferentes anticuerpos bloqueantes.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pinzas microcirujanas (curvas)	Sigma-Aldrich	F4142
Pinzas dentadas (1x2 dientes, rectas)	Fine Science Tools	11053-10	n=2
Tijeras de estrabismo (extremo romo)	Fine Science Tools	14074-11
Pinzas de iris (curvas)	Fine Science Tools	11065-07
Tijeras de resorte (en ángulo)	Fine Science Tools	15006-09
Portaagujas micro Halsey	Fine Science Tools	12500-12
Placas de 10 cm	Corning	430167
PBS	Cellgro	21-040-CV
Bupernex (clorhidrato de buprenorfina)	Reckitt Benckiser	517201
Jeringas para insulina (29 Ga)	Monoject	8881 600145
Hisopos (Q-tips)	Solon Manufacturing Company	362
Cuchillas de afeitar de borde simple (#9)	Smith & Nephew Inc.	67-0238
Sutura de seda (2-0; PS-2)	Ethicon Inc.	583H