Eliminación de un sitio de inicio traslacional interno del ARNm mientras se conserva la expresión de la proteína de longitud completa

Daisuke Shimura; Jennifer Hunter; Makoto Katsumata; Robin M. Shaw

doi:10.3791/63405

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Artículo de método

Eliminación de un sitio de inicio traslacional interno del ARNm mientras se conserva la expresión de la proteína de longitud completa

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DOI:

10.3791/63405

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16 de marzo de 2022

Daisuke Shimura¹ , Jennifer Hunter¹ , Makoto Katsumata² , Robin M. Shaw¹

¹Nora Eccles Harrison Cardiovascular Research and Training Institute, University of Utah, ²Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center

En este artículo

Resumen

El presente protocolo describe una única mutación M213L en Gja1 que conserva la generación completa de Connexin43 pero evita la traducción de la isoforma GJA1-20k traducida internamente más pequeña.

Resumen

El sistema de edición de genes CRISPR-Cas9, basado en mecanismos de reparación del genoma, permite la generación de modelos de ratón modificados genéticamente de forma más rápida y sencilla en relación con la recombinación homóloga tradicional. El sistema CRISPR-Cas9 es particularmente atractivo cuando se desea una mutación de un solo punto. La proteína de unión de brecha, Connexin 43 (Cx43), está codificada por el gen Gja1, que tiene un solo exón codificante y no se puede empalmar. Sin embargo, Gja1 produce no solo la proteína Cx43 de longitud completa, sino hasta seis isoformas truncadas N-terminales mediante un proceso conocido como traducción interna, el resultado de la iniciación de la traducción ribosómica en los sitios de inicio internos de AUG (metionina). GJA1-20k es la isoforma truncada más comúnmente generada de Cx43 iniciada en el codón AUG en la posición 213 del ARNm Gja1. Debido a que el residuo 213 ocurre al final del último dominio transmembrana de Cx43, GJA1-20k es efectivamente la cola C-terminal de 20 kDa de Cx43 como una proteína independiente. Investigadores anteriores identificaron, en células, que un papel crítico de GJA1-20k es facilitar el tráfico de hemicanales de unión de brecha Cx43 de longitud completa a la membrana plasmática. Para examinar este fenómeno in vivo, se generó un ratón mutante con una mutación puntual Gja1 que reemplaza el ATG (Metionina) en el residuo 213 por TTA (mutación Leucina, M213L). El resultado de M213L es que el ARNm de Gja1 y el Cx43 de longitud completa todavía se generan, pero la traducción de Gja1-20k se reduce significativamente. Este informe se centra en la elección del sitio de la enzima de restricción para desarrollar un modelo de ratón mutado en un aminoácido (^{Gja1 M213L / M213L}). Este protocolo describe ratones modificados genéticamente por el sistema CRISPR-Cas9 y el genotipado rápido mediante la combinación de PCR y tratamientos con enzimas de restricción.

Introducción

La conexina 43 (Cx43) de longitud completa y la isoforma truncada N-terminal, GJA1-20k, codificadas por el mismo ARNm GJA1, pero utilizan diferentes codones de inicio¹ para iniciar la traducción. La traducción de Cx43 se produce en el primer codón de inicio de AUG, mientras que la traducción de GJA1-20k se inicia en el AUG en el residuo 213. Anteriormente se encontró que GJA1-20k tiene funciones esenciales para el tráfico de Cx43 de longitud completa, la estabilización de la actina y la regulación de la morfología mitocondrial in vitro ^1,2,3.<....