Motilidad de moléculas individuales y grupos de cinesina-5 cin8 bidireccional purificada a partir de células de S. cerevisiae

Himanshu Pandey; Tatiana Zvagelsky; Mary Popov; Mayan Sadan; Neta Yanir; Alina Goldstein-Levitin; Nurit Siegler; Shira Hershfinkel; Yahel Abraham; Roy Avraham; Levi A. Gheber; Larisa Gheber

doi:10.3791/63425

Artículo de método

Motilidad de moléculas individuales y grupos de cinesina-5 cin8 bidireccional purificada a partir de células de S. cerevisiae

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DOI:

10.3791/63425

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2 de febrero de 2022

Himanshu Pandey¹ , Tatiana Zvagelsky¹ , Mary Popov¹ , Mayan Sadan¹ , Neta Yanir¹ , Alina Goldstein-Levitin¹ , Nurit Siegler¹ , Shira Hershfinkel¹ , Yahel Abraham¹ , Roy Avraham¹ , Levi A. Gheber² , Larisa Gheber¹

¹Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, Israel, ²Department of Biotechnology Engineering, Ben-Gurion University of the Negev, Israel

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Resumen

La kinesina-5 Cin8 mitótica bidireccional se acumula en grupos que se dividen y fusionan durante su motilidad. La acumulación en grupos también cambia la velocidad y direccionalidad de Cin8. Aquí, se describe un protocolo para ensayos de motilidad con Cin8-GFP purificado y análisis de propiedades móviles de moléculas individuales y grupos de Cin8.

Resumen

Los motores mitotic bipolares kinesina-5 realizan funciones esenciales en la dinámica del huso. Estos motores exhiben una estructura homo-tetramérica con dos pares de dominios motores catalíticos, ubicados en extremos opuestos del complejo activo. Esta arquitectura única permite que los motores de kinesina-5 se entrecrucen y deslicen los microtúbulos (TM) del husillo antiparalelo, proporcionando así la fuerza dirigida hacia afuera que separa los polos del husillo. Anteriormente, se creía que los motores de kinesina-5 estaban dirigidos exclusivamente al extremo superior. Sin embargo, estudios recientes revelaron que varios motores fúngicos de quinesina-5 son de extremo negativo dirigidos al nivel de una sola molécula y pueden cambiar de direccionalidad bajo diversas condiciones experimentales. La quinasina-5 Cin8 de Saccharomyces cerevisiae es un ejemplo de dicha proteína motora bidireccional: en condiciones de alta fuerza iónica, las moléculas individuales de Cin8 se mueven en la dirección del extremo inferior de los MT. También se demostró que Cin8 forma cúmulos móviles, predominantemente en el extremo inferior de los MT, y dicho agrupamiento permite que Cin8 cambie de direccionalidad y experimente una motilidad dirigida lenta y más al final. Este artículo proporciona un protocolo detallado para todos los pasos de trabajo con kinesina-5 Cin8 marcada con GFP, desde la sobreexpresión de proteínas en células de S. cerevisiae y su purificación hasta el ensayo de motilidad de molécula única in vitro . Un método recientemente desarrollado que se describe aquí ayuda a diferenciar entre moléculas individuales y grupos de Cin8, en función de su intensidad de fluorescencia. Este método permite un análisis separado de la motilidad de moléculas individuales y grupos de Cin8, proporcionando así la caracterización de la dependencia de la motilidad de Cin8 en su tamaño de racimo.

Introducción

Un gran número de eventos de motilidad dentro de las células eucariotas están mediados por la función de las proteínas motoras moleculares. Estos motores se mueven a lo largo de los filamentos citoesqueléticos, filamentos de actina y microtúbulos (TM), y convierten la energía química de la hidrólisis de ATP en fuerzas cinéticas y mecánicas necesarias para impulsar la motilidad biológica dentro de las células. La S. cerevisiae Cin8 basada en MT es una proteína motora bipolar homotetramérica de quinesina-5 que se entrelaza y desliza las MT del huso¹. Cin8 realiza funciones esenciales durante la mitosis, en el ensamblaje del huso