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Artículo de método

Motilidad de moléculas individuales y grupos de cinesina-5 cin8 bidireccional purificada a partir de células de S. cerevisiae

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DOI:

10.3791/63425

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2 de febrero de 2022

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1Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, Israel, 2Department of Biotechnology Engineering, Ben-Gurion University of the Negev, Israel

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Resumen

La kinesina-5 Cin8 mitótica bidireccional se acumula en grupos que se dividen y fusionan durante su motilidad. La acumulación en grupos también cambia la velocidad y direccionalidad de Cin8. Aquí, se describe un protocolo para ensayos de motilidad con Cin8-GFP purificado y análisis de propiedades móviles de moléculas individuales y grupos de Cin8.

Resumen

Los motores mitotic bipolares kinesina-5 realizan funciones esenciales en la dinámica del huso. Estos motores exhiben una estructura homo-tetramérica con dos pares de dominios motores catalíticos, ubicados en extremos opuestos del complejo activo. Esta arquitectura única permite que los motores de kinesina-5 se entrecrucen y deslicen los microtúbulos (TM) del husillo antiparalelo, proporcionando así la fuerza dirigida hacia afuera que separa los polos del husillo. Anteriormente, se creía que los motores de kinesina-5 estaban dirigidos exclusivamente al extremo superior. Sin embargo, estudios recientes revelaron que varios motores fúngicos de quinesina-5 son de extremo negativo dirigidos al nivel de una sola molécula y pueden cambiar de direccionalidad bajo diversas condiciones experimentales. La quinasina-5 Cin8 de Saccharomyces cerevisiae es un ejemplo de dicha proteína motora bidireccional: en condiciones de alta fuerza iónica, las moléculas individuales de Cin8 se mueven en la dirección del extremo inferior de los MT. También se demostró que Cin8 forma cúmulos móviles, predominantemente en el extremo inferior de los MT, y dicho agrupamiento permite que Cin8 cambie de direccionalidad y experimente una motilidad dirigida lenta y más al final. Este artículo proporciona un protocolo detallado para todos los pasos de trabajo con kinesina-5 Cin8 marcada con GFP, desde la sobreexpresión de proteínas en células de S. cerevisiae y su purificación hasta el ensayo de motilidad de molécula única in vitro . Un método recientemente desarrollado que se describe aquí ayuda a diferenciar entre moléculas individuales y grupos de Cin8, en función de su intensidad de fluorescencia. Este método permite un análisis separado de la motilidad de moléculas individuales y grupos de Cin8, proporcionando así la caracterización de la dependencia de la motilidad de Cin8 en su tamaño de racimo.

Introducción

Un gran número de eventos de motilidad dentro de las células eucariotas están mediados por la función de las proteínas motoras moleculares. Estos motores se mueven a lo largo de los filamentos citoesqueléticos, filamentos de actina y microtúbulos (TM), y convierten la energía química de la hidrólisis de ATP en fuerzas cinéticas y mecánicas necesarias para impulsar la motilidad biológica dentro de las células. La S. cerevisiae Cin8 basada en MT es una proteína motora bipolar homotetramérica de quinesina-5 que se entrelaza y desliza las MT del huso1. Cin8 realiza funciones esenciales durante la mitosis, en el ensamblaje del huso 2,3,4 y el alargamiento del huso durante la anafase 5,6,7. Anteriormente, se había demostrado que Cin8 es un motor bidireccional, que cambia la direccionalidad bajo diferentes condiciones experimentales. Por ejemplo, en condiciones de alta resistencia iónica, los motores Cin8 individuales se mueven hacia el extremo inferior de los MT, mientras que en los grupos, en los ensayos de deslizamiento MT multimotor y entre los MT antiparalelos, los motores Cin8 se mueven principalmente hacia los extremos superiores de los MT 8,9,10,11,12 . Estos hallazgos fueron altamente inesperados debido a varias razones. En primer lugar, Cin8 lleva su dominio motor catalítico en el extremo amino y anteriormente se creía que tales motores estaban dirigidos exclusivamente al extremo más, mientras que se demostró que el Cin8 estaba dirigido al extremo inferior dirigido al nivel de una sola molécula. En segundo lugar, se creía que los motores de kinesina eran unidireccionales, ya sea de extremo inferior o de extremo más, mientras que se demostró que Cin8 era bidireccional, dependiendo de las condiciones experimentales. Finalmente, debido a la orientación MT en el huso mitótico, el papel clásico de los motores de kinesina-5 en la separación de los polos del husillo durante el ensamblaje del husillo y la anafase B solo podría explicarse por su motilidad dirigida de extremo superior en los MT que se entrecruzan 1,13. Después de los primeros informes sobre la bidireccionalidad de Cin8, se demostró que algunos otros motores de kinesina son bidireccionales 14,15,16, lo que indica que la motilidad bidireccional de los motores de quinesina puede ser más común de lo que se creía anteriormente.

Se ha informado previamente que en las células, Cin8 también se mueve de manera bidireccional8, apoyando la noción de que la motilidad bidireccional de algunos motores de quinesina-5 es importante para sus funciones intracelulares. Además, dado que los tres motores de quinesina-5 que se informó que eran bidireccionales son de células fúngicas, recientemente se ha propuesto un posible papel para la bidireccionalidad de los motores de quinesina-5 en tales células10. Según este modelo, en la mitosis cerrada de las células fúngicas, donde la envoltura nuclear no se descompone durante la mitosis, los motores de kinesina-5 proporcionan la fuerza inicial que separa los polos del huso antes del ensamblaje del huso. Para realizar esta tarea, antes de la separación de los polos del husillo, los motores de kinesina-5 se localizan cerca de los polos del husillo, por su motilidad dirigida de extremo negativo en MT nucleares individuales. Una vez en esta posición, los motores de kinesina-5 se agrupan, cambian la direccionalidad, capturan y entrecruzan los MT de los polos del husillo vecinos. Posteriormente, los motores de kinesina-5 proporcionan la separación inicial de los polos por motilidad dirigida de extremo más en los MT que se entrecruzan. Según este modelo, tanto la motilidad dirigida de extremo inferior en MT individuales como la motilidad dirigida de extremo más en MT reticuladas durante el deslizamiento antiparalelo son necesarias para que los motores de kinesina-5 fúngica desempeñen sus funciones en el ensamblaje del husillo 1,13.

El objetivo general del método descrito es obtener cin8 fúngico de alta pureza marcado con GFP Cin8 y realizar ensayos de motilidad de molécula única (Figura 1) mientras se analiza por separado la motilidad de moléculas individuales y grupos de Cin8. La separación entre moléculas individuales y clusters es importante ya que uno de los factores que se ha demostrado que afectan a la direccionalidad de Cin8 es su acumulación en clusters en los MTs10,12. Los ensayos de motilidad alternativos, como los ensayos de deslizamiento de superficie MT y deslizamiento MT no proporcionan información sobre la actividad de proteínas motoras individuales17,18. Los robustos métodos de ensayo y análisis de motilidad de una sola molécula descritos aquí se han aplicado con éxito para caracterizar diferentes aspectos de los motores de kinesina-5, Cin8 y Kip1 10,11,12,14,19,20.

Aquí, se presenta un protocolo detallado para la sobreexpresión y purificación de Cin8, la polimerización de MT y el ensayo de motilidad de molécula única. Además, también se describen los análisis para diferenciar entre moléculas individuales y grupos de Cin8, y para determinar las velocidades de un solo motor y de clúster mediante el análisis de desplazamiento medio (DM) y desplazamiento cuadrado medio (MSD). Este protocolo tiene como objetivo ayudar a los investigadores a visualizar todos los pasos de los procedimientos y ayudar con la solución de problemas de este tipo de ensayos.

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Figura 1: Representación esquemática del ensayo de motilidad de una sola molécula. Los MT fluorescentes biotinilados se unen a la superficie del vidrio, recubiertos con Avidin que interactúa con el BSA biotinilado a la superficie. La flecha verde representa la dirección de movimiento de moléculas individuales de Cin8 en condiciones de alta resistencia iónica. +/- representa la polaridad de la MT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocolo

1. Preparación de tampones y reactivos

  1. Búferes
    1. -Mezcla de gotas de Leu aa: Mezclar 2 g cada uno de Adenina, Uracilo, Triptófano, Histidina, Lisina y Metionina y almacenar a temperatura ambiente.
    2. Medio selectivo de levadura con rafinosa (1 L): Mezcle 6,7 g de base de nitrógeno de levadura (con sulfato de amonio), 2 g de mezcla de gota de -Leu aa y 20 g de rafinosa en agua de doble destilación revolviendo (sin calentar) hasta que se disuelva por completo. Con un filtro de 0,22 μm, filtre la solución en un frasco estéril.
    3. Tampón de lisis: Prepare 25 mL de solución en agua triple destilada (TDW) que consiste en 50 mM Tris, 30 mM Pipes, 500 mM KCl, 10% de glicerol, 1.5 mM de β-mercaptoetanol, 1 mM MgCl2, 0.1 mM atp y 0.1% tritón X-100. Ajuste el pH a 8 usando 6 M HCl.
    4. Tampón de elución: Preparar 10 mL de solución en TDW que consiste en 50 mM Tris, 30 mM Pipes, 500 mM KCl, 350 mM imidazol, 10% glicerol, 1.5 mM β-mercaptoetanol, 1 mM MgCl2, 0.1 mM ATP y 0.1% Triton X-100. Ajuste el pH a 7.2 usando 6 M HCl.
    5. Búfer P12: Preparar 10 mL de una solución en TDW que consiste en tuberías de 12 mM, 1 mM de EGTA y 2 mM de MgCl2. Ajuste el pH a 6.9 usando 10 M NaOH.
    6. Tampón BRB80: Prepare 50 mL de una solución que consiste en tuberías de 80 mM, 1 mM de EGTA y 2 mM de MgCl2 en agua ultrapura. Ajuste el pH a 6.9 usando 10 M NaOH.
    7. General Tubulin Buffer (GTB): Prepare 50 mL de una solución que consiste en tuberías de 80 mM, EGTA de 0,5 mM y MgCl2 mM en agua ultrapura. Ajuste el pH a 6.9 usando 10 M NaOH.
    8. Solución tris-pipes: Prepare 40 mL de solución de 1M Tris-0.6 M Pipes mezclando 6.055 g de Tris y 9.07 g de Pipes en TDW y ajuste el pH a 7.2 usando 6 M HCl. Lleve el volumen final a 50 mL con TDW.
      NOTA: Los tampones P12, BRB80 y Tris-Pipes se utilizan para la preparación de soluciones madre para el ensayo de motilidad. Estos tampones pueden prepararse en grandes cantidades, alicitarse en tubos de 1,5 ml, congelarse a presión y almacenarse a -20 °C.
  2. Soluciones de stock para el ensayo de motilidad
    1. Tubulina (10 mg mL-1): Disolver 1 mg de tubulina liofilizada en 100 μL de tampón de tubulina general (GTB) frío (4 °C). Congela a ultrapresa 1 μL de alícuotas y guárdalas a -80 °C.
    2. Tubulina biotinilada (1 mg mL-1): Disolver 20 μg de tubulina liofilizada en 20 μL de GTB frío. Congela a ultrapresa 1 μL de alícuotas y guárdalas a -80 °C.
    3. Rodamina marcada tubulina (1 mg mL-1): Disolver 20 μg de tubulina liofilizada en 20 μL de GTB frío. Congela a ultrapresa 0,5 μL de alícuotas y guárdalas a -80 °C.
    4. GMPCPP (10 μM): GMPCPP se obtiene del proveedor como una solución acuosa de 100 μL y se almacena a -80 °C. Descongele el vial con GMPCPP sobre hielo. Preparar 1 μL de alícuotas, congelarlas a presión y almacenarlas a -80 °C.
    5. ATP: Preparar una solución de 500 μL de ATP de 100 mM en tampón Tris de 0,5 M (pH 8). Congela a ultrapresa 2 alícuotas de μL y guárdalas a -20 °C.
    6. MgCl2: Preparar 1 ml de solución de 200 mM de MgCl2 en tampón P12. Conservar 5 alícuotas de μL a -20 °C.
    7. Caseína: Preparar una solución de 1 ml de 5 mg de caseína mL-1 en tampón BRB 80. Congela a ultrapresa 10 μL de alícuotas y guárdalas a -20 °C.
    8. D-Glucosa: Prepare una solución de 1 ml de 1 M de D-glucosa en tampón P12. Conservar 10 μL de alícuotas a -20 °C.
    9. Glucosa oxidasa: Preparar una solución de 1 ml de 10 mg de glucosa oxidasa mL-1 en tampón P12. Congela a ultrapresa 2 alícuotas de μL y guárdalas a -20 °C.
    10. Catalasa: Preparar una solución de 1 ml de 0,8 mg de catalasa mL-1 en tampón P12. Congelar a ultrapresa 2 μL de alícuotas y conservar a -20 °C.
    11. Ditiotreitol (TDT): Preparar una solución de 1 mL de 1 M de TDT en tampón P12 en una campana extractora de humos. Congela a ultrapresa 10 μL de alícuotas y guárdalas a -20 °C.
    12. Fosfato de creatina: Prepare una solución de 1 ml de 1 M de fosfato de creatina en tampón P12. Congela a ultrapresa 2 alícuotas de μL y guárdalas a -20 °C.
    13. Creatina fosfoquinasa: Preparar una solución de 1 ml de 5 mg de creatina fosfoquinasa mL-1 en 0,25 M de glicilglicina, pH 7,4. Congela a ultrapresa 2 alícuotas de μL y guárdalas a -20 °C.
    14. EGTA: Prepare una solución de EGTA de 100 mM en agua ultrapura y guárdela a temperatura ambiente.
    15. KCl: Prepare una solución de KCl de 1 M en agua ultrapura y guárdela a temperatura ambiente.
  3. Tampón de motilidad y mezcla de reacción
    1. Tampón de motilidad (MB) con 145 mM KCl, 2x stock: Prepare 1 mL de 2x stock del buffer de motilidad mezclando 100 μL de solución Prefabricada de Tris-Pipes, 20 μL de 100 mM EGTA, 290 μL de KCl y 590 μL de TDW. Mantenga el amortiguador en hielo.
    2. Mezcla de reacción de motilidad: Prepare la mezcla de reacción de motilidad de acuerdo con la Tabla 1 y guárdela en hielo.
VolumenAcciónNombre del reactivo
50 μL2XMB (del paso 1.3.1)
40 μL-TDW
1 μL100 metrosATP
1 μL200 mMMgCl2
2 μL5 mg/mlCaseína
1 μL1 MGlucosa
1 μL1 MTDT
1 μL10 mg/mlGlucosa oxidasa
1 μL8 mg/mlCatalasa
1 μL1 MFosfocreatina
1 μL5 mg/mlCreatina fosfoquinasa
100 μLTotal

Tabla 1.

2. Sobreexpresión y purificación de Cin8 de las células de S. cerevisiae

  1. Cultivar células de S. cerevisiae que contengan el plásmido para la sobreexpresión de Cin8-GFP-6Sí a la fase de crecimiento exponencial (OD600 = 0.6-0.8) en 1 L de medio selectivo de levadura suplementado con rafinosa al 2% (ver paso 1.1.2) a 28 °C12.
  2. Inducir la sobreexpresión de Cin8-GFP-6Sis mediante la adición de galactosa al 2%. Monitoree el crecimiento del cultivo de levadura midiendo la absorbancia a 600 nm.
  3. Cinco horas después de la adición de galactosa, cosechar las células por centrifugación a 4.000 x g durante 15 min a 4 °C, suspender las células en el tampón de lisis y congelar en líquido N2.
    NOTA: Las células congeladas pueden almacenarse a -80 °C para su uso posterior o molerse inmediatamente en líquido N2.
  4. Moler las células congeladas en líquido N2 utilizando mortero refrigerado y mortero. Agregue el líquido N2 durante la molienda para mantener los extractos congelados. Por lo general, requiere 4-5 veces de adición de líquido N2.
  5. Monitoree la lisis celular mediante observación bajo contraste de fase o microscopio DIC.
  6. Descongelar las celdas de tierra y centrifugar a 21.000 x g durante 30 min a 4 °C. Cargue el sobrenadante en una columna de flujo de gravedad llena de 2 ml de Ni-NTA y preequilibrada con tampón de lisis. Deje que el sobrenadante fluya a través de la columna.
  7. Lave la columna con cinco volúmenes de columna de tampón de lisis, y luego con cinco volúmenes de columna de tampón de lisis complementados con imidazol de 25 mM.
  8. Elute Cin8-GFP-6Sué con búfer de elución (consulte el paso 1.1.4).
  9. Analizar las muestras eluidas mediante fraccionamiento SDS-PAGE, seguido de tinción azul de Coomassie y análisis de western blot sondeado con anticuerpo α-GFP19.
  10. Agrupar las fracciones que contienen Cin8-GFP-6His (pasos 2.8 y 2.9). Además, purificarlos mediante cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) a un caudal de 0,5 mL min-1 y límite de presión en columna de 1,5 MPa, con monitorización simultánea de la absorbancia a 280 nm y la emisión de florescencia GFP con excitación a 488 nm (Figura 2A).
  11. Recoger las fracciones correspondientes al tetrámero Cin8-GFP y analizarlas mediante SDS-PAGE y western blotting (ver paso 2.9) (Figura 2B).
  12. Estimar la concentración de proteínas mediante espectrofotometría o ensayos bioquímicos como el ensayo de Bradford, el ensayo de BCA, etc.
  13. Alícuota las fracciones seleccionadas, congele en líquido N2 y guárdelas hasta su uso a -80 °C. Estas muestras de proteína purificada se pueden utilizar durante 6 meses.
    NOTA: Cin8-GFP está sobreexpresado y purificado a partir de una cepa de S. cerevisiae deficiente en proteasa que contiene un plásmido de 2 μm para Cin8-GFP-6Su sobreexpresión del promotor inducible de galactosa, LGY 4093: MATα, leu2-3,112, reg-1-501, ura3-52, pep4-3, prb1-1122, gal1, pOS7 (2μ, LEU2, P GAL1-CIN8-GFP-6HIS). La cepa de levadura y el plásmido están disponibles bajo petición.

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Figura 2: Purificación de Cin8-GFP. (A) El cromatograma de exclusión de tamaño de Cin8-GFP purificado de Ni-NTA, con detección continua de fluorescencia de GFP a través de excitación y emisión de 488 nm a ~ 510 nm. El tetrámero Cin8-GFP eluye a ~10 ml de la columna SEC (marcada con una flecha). (B) Gel SDS-PAGE teñido con coomassie (arriba) y α-GFP western blot (abajo) de fracciones Cin8-GFP eluidas de SEC. Las muestras en los carriles son las siguientes: M - Marcador de peso molecular, Ni2+- Muestra de Cin8-GFP purificada de Ni-NTA que se carga en la columna SEC, fracciones GF: fracción correspondiente a la elución Sec cin8-GFP como se indica en el panel A. La flecha de la derecha marca el tamaño del monómero Cin8-GFP (esperado en el SDS-PAGE). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Ensayo de motilidad de una sola molécula con el Cin8 purificado

  1. Polimerización de MT marcados con biotina y rodamina, estabilizados con GMPCPP.
    1. Comience la polimerización de MT mezclando los siguientes componentes en un tubo de 1,5 ml: 1 μL de proteína de tubulina de 10 mg/ml, 1 μL de tubulina biotinilada de 1 mg/ml, 0,5 μL de tubulina marcada con rodamina de 1 mg/ml, 1 μL de GMPCPP de 10 ml y 6,5 μL de tampón de tubulina general (GTB). Incubar la mezcla durante 1 h a 37 °C.
    2. Después de la polimerización MT, agregue 80 μL de GTB caliente (37 ° C), mezcle con cuidado y centrífique a 16,500 x g durante 20 min.
    3. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet cuidadosamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo con 50 μL de GTB caliente. Guarde la suspensión a 28 °C.
    4. Examine los MT con un microscopio de fluorescencia utilizando el canal de rodamina de 647 nm (Figura 3A).
      NOTA: Para obtener MT biotiniladas marcadas fluorescentemente, la reacción de polimerización contiene tubulina sin etiquetar, así como tubulina biotinilada y marcada fluorescentemente. En este protocolo, se utiliza tubulina marcada con rodamina, pero también se pueden utilizar otros conjugados fluorescentes.
  2. Montaje de la cámara de flujo
    1. Ensamble una cámara de flujo colocando cuatro tiras de cinta de doble cara (~ 4 cm x ~ 3 mm) en un portaobjetos de vidrio adhesivo avanzado (paralelo al borde más largo y ~ 3-4 mm de separación) para crear tres "carriles" entre las tiras de cinta. Retire el papel protector de las tiras de cinta y coloque un cubrehojassilanizadas 10 en las tiras de cinta para crear tres cámaras de flujo de ~ 10 μL de volumen.
  3. Inmovilización MT a la superficie recubierta de avidina (Figura 1)
    1. Cubra el cobertor silanizado perfundiendo con 15 μL de 1 mg/ml de albúmina sérica biotinilada bovina (b-BSA, disuelta en GTB) en la cámara de flujo utilizando una micropipeta. Después de 5 min, lave la cámara con 80 μL de GTB.
    2. Posteriormente, como en el paso 3.3.1, inserte en la cámara de flujo 15 μL de 1 mg/ml de Avidin (disuelta en GTB) que se une a la b-BSA. Después de 5 min, lave la cámara con 80 μL de GTB.
    3. Pasivar la superficie de la cubierta silanizada utilizando 20 μL de poloxámero al 1%. Después de 3 min, lavar con 80 μL de GTB.
    4. Conecte los MT biotinilados (paso 3.1) al cobertor recubierto de b-BSA-avidina insertando 20 μL de MT normalmente diluidos a 1:20 en GTB. Incubar los portaobjetos en posición invertida, es decir, con la cubierta hacia abajo en una cámara de humedad oscura (por ejemplo, una placa de Petri que contenga papel de seda húmedo) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Luego, lavar con 200 μL de GTB.
    5. Aplicar 30 μL de mezcla de reacción de motilidad (ver paso 1.3.2) en la cámara de flujo.
    6. Diluir los motores Cin8-GFP (paso 2.13) en 20 μL de mezcla de reacción de motilidad (ver Tabla 1) (típicamente a una concentración final de 5-10 μM). Aplíquelos a la cámara de flujo e inmediatamente obtenga imágenes del movimiento de los motores a lo largo de los MT.
  4. Imágenes de motilidad motora
    NOTA: La unión MT y la motilidad de los motores se monitorearon utilizando un microscopio invertido de epifluorescencia equipado con una lámpara de arco de mercurio, un objetivo de apertura numérica de 100x / 1.4 y dos conjuntos de filtros de paso de banda de fluorescencia, uno con una longitud de onda de 647 nm (para rodamina) y otro con una longitud de onda de 488 nm (para GFP).
    1. Coloque una gota de aceite de inmersión en el objetivo del microscopio. Coloque la cámara de flujo en el escenario del microscopio fluorescente con la cubierta hacia abajo mirando hacia el objetivo.
    2. Encienda el canal de rodamina para enfocar los MT conectados a la superficie del deslizamiento y adquiera la imagen con una exposición de 20 ms utilizando el software Micro-Manager ImageJ-Fiji21.
    3. Encienda el canal GFP y adquiera 90 imágenes de lapso de tiempo con intervalo de 1 s y exposición de 800 ms, para analizar la motilidad de Cin8-GFP.

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Figura 3: MT y MT enlazados Cin8-GFP. (A) Imágenes de dos campos (izquierda y derecha) para MT polimerizadas siguiendo el protocolo descrito en el paso 3.1 e imágenes con el objetivo 100x como se describe en el paso 3.4. (B) Imágenes de dos campos (izquierda y derecha) para el Cin8-GFP (paneles inferiores, marcados con flechas) unidos a la MT que se muestra en los paneles superiores. Barra de escala: 4 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Análisis de motilidad

NOTA: Realice todos los análisis de imágenes y genere kymographs utilizando el software ImageJ-Fiji.

  1. Generación de Kymograph
    1. Abra la película de lapso de tiempo y la imagen de campo MT correspondiente. Sincronice estas dos ventanas eligiendo la siguiente opción: Analizar herramientas de > > Sincronizar ventanas.
    2. Resalte una MT usando la opción Línea segmentada y use la pestaña Analizar > Multi Kymograph para obtener un kymograph.
  2. Determinación del tamaño del grupo de Cin8-GFP (es decir, el número de moléculas de Cin8 en un clúster)
    1. Realice la sustracción de fondo y la corrección de la iluminación desigual mediante la opción Procesar > Restar fondo . Establezca el radio de la bola rodante en 100 píxeles y marque la opción Paraboloide deslizante .
    2. Siga la intensidad media de fluorescencia de un motor Cin8-GFP no móvil específico (Figura 3B) en función del tiempo dentro de un círculo de 4 píxeles de radio utilizando el complemento TrackMate del software ImageJ-Fiji eligiendo la siguiente opción: Complementos > Seguimiento > TrackMate > Detector LoG > Simple Lap Tracker.
    3. Repita el paso 4.2.2 para diferentes motores Cin8-GFP. Trazar la intensidad de fluorescencia de los diferentes motores Cin8-GFP en función del tiempo.
      NOTA: Una estrategia experimental para medir el tamaño del clúster, es decir, el número de moléculas de Cin8 en un clúster, establece una base para el análisis de la motilidad relacionada con el agrupamiento de Cin8. El fotoblanqueo de GFP unido a Cin8 se emplea para determinar la contribución de moléculas individuales de GFP a la intensidad total de los grupos de Cin8. Por ejemplo, las intensidades de fluorescencia disminuyen en pasos de ~ 50 unidades arbitrarias (u.a.), con cada paso probablemente representando el fotoblanqueo de una molécula de GFP (Figura 4A). Dado que Cin8 es una proteína motora homo-tetrámrica, contiene cuatro moléculas de GFP. Por lo tanto, es probable que todos los motores Cin8 que tengan una intensidad ≤ 200 u.a. sean moléculas tetraméricas individuales de Cin8. Siguiendo este método, los rangos de intensidad de la fluorescencia motora Cin8 se asignan como <200, 200-400 y >400 para moléculas individuales de Cin8, pares de moléculas de Cin8 (dímero de tetrámero de Cin8) y oligómeros de Cin8, respectivamente12.
  3. Análisis de distribución de intensidad para motores Cin8-GFP
    1. Mida la intensidad media de florescencia de todos los motores fluorescentes Cin8-GFP en el primer fotograma de la secuencia de lapso de tiempo utilizando el complemento TrackMate en ImageJ-Fiji como se describe en el paso 4.2.2.
    2. Trazar un histograma de las intensidades medias de Cin8-GFP con un tamaño de contenedor de 20 u.a. y ajustar el pico mayor del histograma a una curva gaussiana (Figura 4B).
      NOTA: El análisis de distribución de intensidad complementa la determinación del tamaño del clúster para motores Cin8-GFP de los experimentos de fotoblanqueo. La curva gaussiana ajustada al histograma de distribución de intensidad para la población de Cin8-GFP alcanza su punto máximo a ~ 125 u.a., lo que es consistente con la intensidad promedio de moléculas tetraméricas individuales de Cin8 que contienen una, dos, tres o cuatro moléculas GFP fluorescentes (no blanqueadas), con cada molécula GFP fluorescente contribuyendo con ~ 50 a.u. Por lo tanto, utilizando este método de distribución de intensidad, también se puede calcular la contribución de una molécula GFP, que se puede utilizar para asignar el tamaño del grupo de moléculas Cin8-GFP.

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Figura 4: Perfil de blanqueo Cin8-GFP y distribución de la intensidad. (A) Fotoblanqueo de GFP en cuatro motores Cin8-GFP diferentes. Los pasos individuales de fotoblanqueo, cada uno probablemente representando el fotoblanqueo de un GFP, conducen a una caída en la intensidad de fluorescencia de ~ 50 a.u. (B) La distribución de intensidad de los motores Cin8-GFP en el primer fotograma de una secuencia de lapso de tiempo (recuadro). El pico gaussiano (azul) centrado en ~125 a.u representa moléculas individuales de Cin8-GFP. Este pico exhibe la intensidad promedio de los tetrámeros Cin8 individuales con una, dos, tres o cuatro moléculas fluorescentes de GFP, con cada molécula de GFP contribuyendo ~ 50 u.a. a la intensidad total (es decir, (50 + 100 + 150 + 200) / 4 = 125). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Seguimiento de la motilidad de las moléculas Cin8-GFP a lo largo de las pistas mt
    1. Recorte la MT que se va a analizar en la secuencia de lapso de tiempo de los fotogramas grabados resaltándola con la herramienta Rectángulo y, a continuación, elija Imagen > Recortar.
    2. Elija una partícula fluorescente Cin8-GFP para el análisis. Registre las coordenadas de partícula en cada fotograma (punto de tiempo) de la secuencia de lapso de tiempo utilizando las opciones Herramienta de punto y Medida . Realice un registro similar de las coordenadas de otras partículas fluorescentes en la secuencia de lapso de tiempo.
    3. Asigne el tamaño del clúster a todas las partículas Cin8-GFP examinadas en el primer marco de su apariencia, como se describe en el paso 4.2.
  2. Análisis de desplazamiento medio (DM) y desplazamiento cuadrático medio (TME)
    1. A partir de las coordenadas de los movimientos Cin8-GFP determinadas en el paso 4.4, calcule los desplazamientos de Cin8-GFP en cada punto de tiempo con respecto a las coordenadas iniciales, utilizando la ecuación para el cálculo de la distancia entre dos puntos con coordenadas dadas:
      figure-protocol-4
      donde, dt son los desplazamientos de Cin8-GFP en el momento t, xt e yt son las coordenadas respectivas en el tiempo t. x0 e y0 son las coordenadas respectivas de Cin8-GFP en t = 0.
    2. Calcule a partir de estos valores de desplazamiento el desplazamiento para todos los intervalos de tiempo posibles para una partícula Cin8-GFP específica. Repita el procedimiento para todas las partículas Cin8-GFP examinadas.
    3. Trazar el desplazamiento medio (DM) de todas las partículas Cin8-GFP examinadas versus intervalo de tiempo y sujeto a un ajuste lineal, MD = v x t + c. La pendiente de este ajuste (v) representa la velocidad media de las partículas móviles Cin8-GFP.
      NOTA: De esta manera, la velocidad promedio de todas las moléculas de Cin8-GFP pertenecientes a cada tamaño de cúmulo se puede calcular por separado caracterizando la motilidad de los diferentes tamaños de cúmulo. Además del análisis de MD, el análisis de desplazamiento cuadrático medio (MSD) también se puede realizar cuadrando los valores de desplazamiento calculados en los pasos 4.5.1 y 4.5.2. Los valores de MSD se trazan frente al intervalo de tiempo y se ajustan a la curva polinómica MSD = v2 x t2 + 2D x t + c, dando el parámetro adicional D, que es el coeficiente de difusión del movimiento Cin8-GFP. El análisis de MD debe realizarse en MTsmarcados con polaridad 8,10, mientras que para el análisis MSD no es necesario el conocimiento de la polaridad MT.

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Resultados

El experimento tiene como objetivo investigar las características de motilidad de la proteína motora bidireccional Cin8 de diferentes tamaños de grupo en TM individuales. La motilidad representativa de Cin8-GFP también es evidente en los kymographs de la Figura 5A, donde se muestra la posición espacial del motor a lo largo del tiempo.

Para el análisis de las propiedades móviles de Cin8-GFP, primero, se asigna el tamaño del clúster (paso 4.3) a cada partícula cin8-...

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Discusión

En este trabajo se presenta un protocolo para el ensayo de motilidad monomolécula con la kinesina-5 Cin8 bidireccional y el análisis de motilidad. El Cin818 de longitud completa, incluida la señal de localización nuclear nativa (NLS) en el terminal C, se ha purificado del huésped nativo S. cerevisiae. Como el Cin8 es una proteína motora nuclear, la molienda de las células de S. cerevisiae bajo nitrógeno líquido se encuentra como el método más eficiente para la lisis celular. Desp...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada en parte por la subvención de la Fundación de Ciencias de Israel (ISF-386/18) y la subvención de la Fundación Binacional de Ciencias de Israel (BSF-2019008), otorgada a L.G.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AdeninaFORMEDIUMDOC0230
ATPSigmaA7699
Biotinilado-BSASigmaA8549
CaseínaSigmaC7078
Catalasa (C40)SigmaC40
Creatina-QuinasaSigmaC3755
Ditiotreitol (DTT)SigmaD0632
EDTASigmaE5134
EGTASigmaE4378
Juego de filtros de fluorescencia para GFPChroma49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)
Juego de filtros de fluorescencia para RhodamineChroma49004: ET-CY3/TRITC
Microscopio invertido de fluorescenciaZeissAxiovert 200M
GalactosaTivan BiotechGAL02
GlucosaSigmaG8270
Glucosa OxidasaSigmaG7141
GlicerolSigmaG5516
GlicilglicinaMerckG0674
GMPCPPJana BioscienceNu-405L
GTBCitoesqueletoBST01-010
GTPSigmaG8877
HistidineDuchefa BiochemieH0710.0100
Software ImageJ-FIJIhttps://imagej.net/plugins/trackmate/versión 2.1.0/1.53c; Java,1.8.0_172 [64 bits] para Windows 10
ImidazolSigmaI0125
InstantBlue Coomassie Protein StainAbcamab119211
LenteZeiss100x/1.4 aceite DIC objetivo Lisina
FORMEDIUMDOC0161
Cloruro de magnesioSigmaM8266
MetioninaDuchefa BiochemieM0715.0100
NeoAndor TechnologiessCMOS
NeutraAvidinLifeA2666
Ni-NTA AgarosaInvitrogenR901-15
Fosfo-CreatinaSigmaP1937
PipasSigmaP1851
Ácido plurónico F-127 (poloxámero)SigmaP2443
Cloruro de potasioSigmaP9541
RafinosaTivan BiotechRAF01
Instrumento de cromatografía de exclusión por tamañoGE HealthcareAKTA Espectrofotómetro puro
ThermoFisher ScientificNanoDrop
Superose-6 10/300 GLGE Healthcare17-5172-01
TrisRoshe10708976001
Triton X-100SigmaT8787
TriptófanoDuchefa BiochemieT0720.0100
Proteína de TubulinaCitoesqueletoT240
Tubulina, Citoesqueleto biotiniladoT333P
Tubulina, TRITC Citoesqueleto de rodaminaTL530M
UracilSigmaU0750-100G
Levadura base nitrogenadaFORMEDIUMCYN0401S
α-GFP anticuerpoSanta Cruz BiotechnologySC8036
β-mercaptoetanolSigmaM3148
Cámara

Referencias

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells
Posted by JoVE Editors on 6/09/2022. Citeable Link.

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Roy Abraham

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Roy Avraham

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Motilidad de la kinesina 5prote na motora Cin8motilidad de mol cula nicaagrupamiento de prote nas motorasdin mica de microt bulosprote na motora bidireccionalcromatograf a de exclusi n molecularmicroscop a de fluorescenciaSaccharomyces cerevisiaemarcado con GFP
Motilidad de moléculas individuales y grupos de cinesina-5 cin8 bidireccional purificada a partir de células de S. cerevisiae
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