Artículo de método

Evaluación del sesgo de juicio del ratón a través de una tarea de excavación olfativa

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DOI:

10.3791/63426

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4 de marzo de 2022

 ,  ,  , 
1Department of Integrative Biology, University of Guelph, 2Institute of Cell Biology and Neurosciences, National Scientific and Technical Research Council-University of Buenos Aires, 3Laboratory of Experimental Animals, Faculty of Veterinary Sciences, National University of La Plata, 4Department of Animal Biosciences, University of Guelph

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este artículo proporciona una descripción detallada de un nuevo protocolo de sesgo de juicio del ratón. También se demuestra la sensibilidad de esta tarea de excavación olfativa al estado afectivo y se discute su utilidad en diversos campos de investigación.

Resumen

Los sesgos de juicio (JB) son diferencias en la forma en que los individuos en estados afectivos / emocionales positivos y negativos interpretan la información ambigua. Este fenómeno se ha observado durante mucho tiempo en humanos, con individuos en estados positivos que responden a la ambigüedad "optimistamente" y aquellos en estados negativos que muestran "pesimismo". Los investigadores que tienen como objetivo evaluar el afecto animal han aprovechado estas respuestas diferenciales, desarrollando tareas para evaluar el sesgo de juicio como un indicador del estado afectivo. Estas tareas se están volviendo cada vez más populares en diversas especies y campos de investigación. Sin embargo, para los ratones de laboratorio, los vertebrados más utilizados en la investigación y una especie en la que se confía mucho para modelar trastornos afectivos, solo una tarea de JB ha sido validada con éxito como sensible a los cambios en el estado afectivo. Aquí, proporcionamos una descripción detallada de esta nueva tarea murina de JB, y evidencia de su sensibilidad al afecto del ratón. Aunque los refinamientos siguen siendo necesarios, la evaluación de JB de ratón abre la puerta para responder tanto a preguntas prácticas sobre el bienestar del ratón como a preguntas fundamentales sobre el impacto del estado afectivo en la investigación traslacional.

Introducción

Medir el sesgo de juicio modulado afectivamente (en adelante JB) ha demostrado ser una herramienta útil para estudiar los estados emocionales de los animales. Este enfoque innovador toma prestado de la psicología humana, ya que los humanos que experimentan estados afectivos positivos o negativos (emociones y estados de ánimo a largo plazo) demuestran de manera confiable las diferencias en la forma en que procesan la información 1,2,3. Por ejemplo, los humanos que experimentan ansiedad o depresión pueden interpretar las expresiones faciales neutrales como negativas, o las oraciones neutrales como amenazantes 4,5. Es probable que estos sesgos tengan un valor adaptativo y, por lo tanto, se conserven en todas las especies 6,7. Los investigadores que buscan evaluar el afecto animal han aprovechado hábilmente este fenómeno, operacionalizando el optimismo como la mayor expectativa de recompensa en respuesta a señales neutrales o ambiguas, y el pesimismo como el aumento de la expectativa de castigo o ausencia de recompensa 8,9. Así, en un entorno experimental, las respuestas optimistas y pesimistas a estímulos ambiguos pueden interpretarse como indicadores de afecto positivo y negativo, respectivamente10,11.

En comparación con otros indicadores de afectación animal, las tareas JB tienen el potencial de ser herramientas particularmente valiosas ya que son capaces de detectar tanto la valencia como la intensidad de los estados afectivos10,11. La capacidad de las tareas de JB para detectar estados positivos (por ejemplo, Rygula et al.12) es especialmente útil ya que la mayoría de los indicadores de afectación animal se limitan a la detección de estados negativos13. Durante las tareas de JB, los animales suelen ser entrenados para responder a una señal discriminativa positiva que predice la recompensa (por ejemplo, tono de alta frecuencia) y una señal discriminativa negativa que predice el castigo (por ejemplo, tono de baja frecuencia), antes de que se les presente una señal ambigua (por ejemplo, tono intermedio)8. Si en respuesta a señales ambiguas un animal "optimistamente" realiza la respuesta entrenada para la señal positiva (como si esperara una recompensa), esto indica un sesgo de juicio positivo. Alternativamente, si los animales demuestran la respuesta negativa entrenada para evitar el castigo, esto es indicativo de "pesimismo" o sesgo de juicio negativo.

Desde el desarrollo de la primera tarea exitosa de JB para animales por Harding y sus colegas8, se han desarrollado varias tareas de JB para una amplia gama de especies en diversos campos de investigación7. Pero a pesar de su creciente popularidad, las tareas de JB de animales a menudo requieren mucha mano de obra. Además, tal vez porque son metodológicamente diferentes de las tareas humanas que los inspiraron, a veces producen resultados nulos o contraintuitivos14 y comúnmente producen solo tamaños de efecto de tratamiento pequeños15. Como resultado, las tareas de JB pueden ser difíciles de desarrollar e implementar. De hecho, para los ratones de laboratorio, los vertebrados más utilizados en la investigación16,17 y una especie en la que se confía mucho para modelar trastornos afectivos18, solo una tarea de JB ha sido validada con éxito como sensible a los cambios en el estado afectivo19 a pesar de muchos intentos en la última década (ver material complementario de Resasco et al.19  para un resumen). Este artículo describe la tarea JB murina recientemente validada, detallando su diseño biológicamente relevante y destacando las formas en que esta tarea humana se puede aplicar para probar hipótesis importantes relevantes para el afecto del ratón. En general, el protocolo se puede implementar para investigar los efectos afectivos de cualquier variable de interés en JB en ratones. Esto incluiría variables categóricas de tratamiento como se describe aquí (efectos de medicamentos o enfermedades, condiciones ambientales, antecedentes genéticos, etc.), o relaciones con variables continuas (cambios fisiológicos, comportamientos de jaulas domésticas, etc.).

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Protocolo

Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Cuidado Animal de la Universidad de Guelph (AUP # 3700), realizados de conformidad con las pautas del Consejo Canadiense de Cuidado Animal, e informados de acuerdo con los requisitos de ARRIVE (Investigación animal: Informes de experimentos in vivo )20 .

1. Preparación del experimento

  1. Diseño experimental (ver Cuadro 1).
    NOTA: Esta prueba de comportamiento es una tarea de excavación Go/Go basada en olores, en la que los ratones tienen que cavar para obtener recompensas de alto o bajo valor. Utiliza una arena rectangular (Figura 1) con dos brazos, en los que un brazo está perfumado mientras que el otro no tiene perfume. Como se describe a continuación, los ratones están entrenados para discriminar entre señales de olor positivas y negativas antes de que se les presente una mezcla de olor ambigua.
    1. Asigne pseudoaleatoriamente jaulas a grupos de estímulo discriminativo positivo (DS+) de menta o vainilla de la siguiente manera.
      NOTA: Este protocolo solo ha sido validado para ratones asignados a la mezcla de olor DS+ de vainilla (ver Resultados Representativos y Resasco et al.19 para más detalles). Sin embargo, se recomiendan encarecidamente las pruebas piloto para confirmar que las mezclas DS+, DS-, y ambiguas cumplen con los requisitos para una evaluación válida de JB (pasos 4.7.3 y 5.3). Por lo tanto, los métodos descritos aquí incluyen la prueba de una vainilla y una menta DS +, para proporcionar un ejemplo de un grupo que cumple con éxito los requisitos para la evaluación de JB (los ratones DS + de vainilla) y un grupo que no lo hace (los ratones DS + de menta). Las pruebas piloto previas identificarían este tipo de problema de antemano.
    2. Ratones Mint DS+: para estos ratones, durante la configuración de la arena para el entrenamiento (consulte el paso 1.4 a continuación), marque los dispensadores de aroma y las macetas que contienen una recompensa de alto valor con la señal de olor a menta, y aquellos que no contienen recompensa con la señal de olor a vainilla.
    3. Ratones Vanilla DS+: para estos ratones, durante la configuración de la arena para el entrenamiento (consulte el paso 1.4 a continuación), marque los dispensadores de aroma y las macetas que contienen una recompensa de alto valor con la señal de olor a vainilla, y aquellos que no contienen recompensa con la señal de olor a menta.
      NOTA: Esta tarea consiste en ensayos de entrenamiento reforzado y ensayos de prueba no reforzados. Durante los ensayos de prueba no reforzados, los ratones no tienen acceso a recompensas (consulte el paso 1.4.3 a continuación) y la señal de olor ambigua para los ratones DS + de menta y vainilla es la misma mezcla de menta / vainilla 1: 1.
    4. Asigne pseudoaleatoriamente jaulas a grupos de brazos perfumados izquierdo o derecho (contrapeso a través de grupos de olor DS +) de la siguiente manera.
    5. Izquierda: para estos ratones, durante la configuración de la arena para el entrenamiento y las pruebas (consulte el paso 1.4 a continuación), marque el brazo izquierdo con la señal de olor DS + o DS- adecuada y asegúrese de que el brazo derecho siempre esté sin perfume (marcado solo con agua destilada).
    6. Derecha: para estos ratones, durante la configuración de la arena para el entrenamiento y las pruebas (consulte el paso 1.4 a continuación), marque el brazo derecho con la señal de olor DS + o DS- adecuada y asegúrese de que el brazo izquierdo esté siempre sin perfume (marcado solo con agua destilada).
    7. Asigne aleatoriamente a cada animal un "código ciego" de la siguiente manera.
      NOTA: El cegamiento permite al investigador que maneja a los ratones y califica su comportamiento permanecer inconsciente de la identificación o tratamiento del animal, evitando sesgos subjetivos indeseables. Este es un paso obligatorio para cumplir con las directrices ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) y otros documentos de referencia20.
    8. Agregue una columna para el código ciego en una hoja de cálculo que contenga cada identificación de animal y el tratamiento correspondiente al que se les ha asignado.
    9. Asigne aleatoriamente a cada animal un código único (por ejemplo, una combinación de letras y números "A2") que no esté relacionado con el número de jaula o el tratamiento.
      NOTA: Toda aleatorización debe llevarse a cabo utilizando un generador de números aleatorios (por ejemplo, Random.org). Durante este paso de aleatorización, contrapese el tratamiento, la tensión, etc., cuando corresponda. Haga que esto lo haga un asistente de investigación que permanecerá "inconsciente" al tratamiento a lo largo de los experimentos. Esta persona no debe recopilar datos durante las pruebas, para evitar evaluaciones sesgadas.
    10. Durante toda la recopilación de datos, proporcione al investigador "ciego" que tiene latencia de puntuación en vivo y video para cavar y la duración de la excavación solo con el código ciego del animal para mantener al investigador ciego al tratamiento.
      NOTA: Las hojas de cálculo utilizadas durante la recopilación de datos solo incluirán el código ciego del animal y la latencia correspondiente para cavar y la duración de la excavación para cada ensayo. Al final de los experimentos, la identificación del animal correspondiente y la información de tratamiento se pueden agregar a la hoja de cálculo, lo que "desenmascara" a los investigadores para los análisis de datos.
  2. Preparación de materiales.
    1. Recompensas de alimentos de alto valor: rompa los chips de plátano endulzados secos en trozos de aproximadamente 0,5 cm x 0,5 cm a mano.
    2. Recompensas de alimentos de bajo valor: usando una tabla de cortar y un cuchillo, corte el chow de roedores (de la dieta regular de los animales) en aproximadamente 0.125 cm3 piezas.
      NOTA: Las pruebas piloto para identificar recompensas de alto y bajo valor deben realizarse antes de comenzar la tarea.
    3. Esencias de menta y vainilla: Usando una jeringa o micropipeta de 1 ml, agregue extracto de menta y vainilla en tubos de centrífuga etiquetados. Diluir los extractos 1:4 con agua destilada y mezclar invirtiendo varias veces. Haga estos diariamente e invierta repetidamente antes de usarlos para asegurarse de que las mezclas sean frescas y consistentes.
    4. Mezcla de olor ambiguo: después de diluir las esencias de menta y vainilla, agregue volúmenes iguales a un tubo de centrífuga (creando una mezcla 1: 1 de las esencias diluidas). Haga estos el día de las respuestas de prueba a la mezcla de olor ambiguo e invierta repetidamente antes de usarlos para asegurarse de que la mezcla sea fresca y consistente.
      NOTA: Se recomienda encarecidamente realizar pruebas piloto para identificar diluciones apropiadas y mezclas de olores intermedios para garantizar la utilidad de sondas ambiguas, ya que la intensidad puede variar entre fabricantes, lotes, etc. Si se ofrecen múltiples señales ambiguas, asigne aleatoriamente a los ratones a las señales de prueba casi positivas, de punto medio, casi negativas. Ver Discusión para más detalles.
    5. Almohadillas de algodón: corte cada almohadilla de algodón circular en seis piezas iguales (lo que les permite caber dentro de los casetes de tejido utilizados como dispensadores de aromas).
      NOTA: El número de recompensas de alimentos de alto y bajo valor, almohadillas de algodón y volúmenes de mezclas de olores dependerá del número de sujetos que se estén probando. Consulte la Tabla 1 para el número de ensayos por sujeto en cada fase y la Tabla 2 para los materiales requeridos en cada tipo de ensayo.
    6. Identifique el área experimental: Realice entrenamiento y pruebas en un banco en la sala de la colonia o en otro lugar. Realice todos los ensayos bajo luz roja durante la fase oscura cuando los ratones están activos.
  3. Pre-entrenamiento (1 semana antes de los experimentos) para cavar en la jaula del hogar.
    1. Para cada jaula que se está probando, vierta una pequeña cantidad de ropa de cama de mazorca de maíz en dos macetas de excavación (lo suficiente para cubrir el fondo de la olla) para ayudar a que las golosinas permanezcan en el centro de la olla cuando estén enterradas.
    2. En una olla, coloque piezas de recompensa de alto valor sobre la capa de mazorca de maíz para que cada ratón en la jaula pueda tener una pieza (por ejemplo, tres piezas de chips de plátano para una jaula de tres ratones). En la otra olla, coloque piezas de recompensa de bajo valor sobre la capa de mazorca de maíz para que cada ratón en la jaula pueda tener una pieza (por ejemplo, tres piezas de chow para una jaula de tres ratones).
    3. Vierta lentamente la ropa de cama de mazorca de maíz sobre las golosinas en cada maceta, cubriéndolas y llenando las macetas a una altura de 3 cm.
    4. Coloque simultáneamente una maceta de alto valor y una de bajo valor en cada jaula durante 10 minutos. Después de 10 minutos, retire las macetas de todas las jaulas.
    5. Deseche cualquier mazorca de maíz y golosinas que queden en la olla. Limpie todas las macetas a fondo con 70% de etanol para evitar que los olores de animales y jaulas influyan en futuros ensayos.
    6. Repita los pasos 1.3.1-1.3.5 una vez al día durante 5 días consecutivos.
      NOTA: El objetivo de esta fase es permitir que todos los compañeros de jaula tengan la oportunidad de cavar y comer una golosina antes del inicio del entrenamiento formal. Esto también facilita la habituación a las recompensas alimentarias.
  4. Arena preparada para entrenamiento y pruebas.
    1. Coloque la arena en un banco de trabajo bajo una luz roja. Limpie todos los componentes de la arena, las ollas de excavación y los dispensadores de aromas a fondo con etanol al 70% para eliminar el polvo y los olores de ensayos anteriores.
    2. Prepare las macetas de excavación de la siguiente manera.
    3. Coloque las recompensas de alimentos apropiadas en el "compartimento inaccesible" (ver Figura 1).
      NOTA: Las recompensas incluidas en este compartimento dependen de qué golosinas (si las hay) se entierran en un ensayo determinado (consulte la Tabla 2). Por lo tanto, cada olla siempre contendrá una pieza de chip de plátano y una pieza de chow en los dos compartimentos.
      1. Macetas de olor DS+: durante las pruebas reforzadas, coloque una pieza de chow en el compartimento inaccesible y entierre una pieza de chip de plátano en el área accesible de la olla.
      2. Macetas de olor a DS: durante las pruebas reforzadas, coloque una pieza de chow y una pieza de chip de plátano en el compartimento inaccesible. No habrá recompensas de alimentos disponibles en el área accesible de la olla.
      3. Macetas sin perfume: durante las pruebas reforzadas, coloque una pieza de chip de plátano en el compartimento inaccesible y entierre una pieza de chow en el área accesible de la olla.
      4. Durante todas las pruebas de prueba no reforzadas (positivas, negativas y ambiguas), coloque una pieza de chow y una pieza de chip de plátano en el compartimiento inaccesible. No habrá recompensas de alimentos disponibles en el área accesible de la olla.
        NOTA: Este paso es para evitar que el aroma de las golosinas enterradas revele qué olla es recompensada. Como tal, la barrera entre los dos compartimentos está perforada para facilitar la transmisión del olor.
    4. Vierta una pequeña cantidad de ropa de cama de mazorca de maíz en cada olla para mantener las recompensas de los alimentos centradas cuando sean enterrados. Coloque una pieza de la recompensa de alimentos apropiada (ver Tabla 2) sobre la capa de mazorca de maíz y vierta lentamente la ropa de cama de mazorca de maíz sobre las golosinas, cubriéndolas y llenando las macetas hasta una altura de 3 cm.
    5. Usando una jeringa o micropipeta de 1 ml, extraiga 0,1 ml de la mezcla de olor apropiada (es decir, menta, vainilla o mezclas ambiguas) o agua destilada (consulte la Tabla 2) e inyéctela directamente sobre la mazorca de maíz en un movimiento circular.
    6. Prepare dispensadores de aromas.
      1. Coloque una pieza de algodón en la base del cassette de tejido. Usando una jeringa o micropipeta de 1 ml, extraiga 0,1 ml de la mezcla de olor apropiada (es decir, menta, vainilla o mezclas ambiguas) o agua destilada (consulte la Tabla 2) e inyéctela sobre la pieza de algodón. Cubra el cassette de pañuelo de papel con su tapa para encerrar el algodón perfumado creando un dispensador de aroma.
    7. Coloque las macetas de excavación en los extremos de los brazos y los dispensadores de aroma al comienzo de cada brazo. Inserte la "puerta" extraíble inmediatamente antes de las ranuras del cassette para bloquear la entrada a los brazos de la arena y crear el compartimento de inicio (consulte la Figura 1).
      NOTA: Las macetas de excavación, los dispensadores de olores y las jeringas deben estar claramente etiquetados y solo usarse para un aroma a lo largo de los experimentos para evitar la mezcla involuntaria de señales de olor (es decir, usar un conjunto diferente de materiales para menta, vainilla, mezclas sin perfume y ambiguas en todas partes).

2. Entrenamiento de excavación: 5 días, dos pruebas positivas por día (Tabla 2)

  1. Ratones rápidos durante 1 h antes de entrenar en su jaula casera retirando la comida de la tolva.
  2. Configure la arena para una prueba positiva reforzada siguiendo las instrucciones de configuración de la arena anteriores (paso 1.4).
  3. En el día 1 del entrenamiento de excavación, coloque las recompensas de comida sobre la ropa de cama de mazorca de maíz de 3 cm en lugar de enterrarlas.
  4. Entierre progresivamente las recompensas más profundamente debajo de la mazorca de maíz durante los siguientes 4 días, hasta que se encuentren en la parte inferior de la cama de 3 cm para el Día 5 (es decir, Día 1: encima de la mazorca de maíz, Día 2: enterrado por una capa muy delgada de mazorca de maíz, Día 3: enterrado a mitad de camino hasta el fondo de la olla, Día 4: enterrado tres cuartas partes del camino hasta el fondo de la olla, y día 5: enterrado en el fondo de la olla).
  5. Mueva a los ratones de su jaula doméstica a una jaula de transporte vacía. Coloque una tarjeta de referencia con el código ciego del animal en la parte superior de la jaula de transporte para que el investigador que realiza los experimentos permanezca ciego a la identificación y el tratamiento del animal. Llevar ratones al área experimental.
    NOTA: Los pasos 2.1 y 2.5 deben ser completados por un asistente de investigación familiarizado con los ratones. Los pasos posteriores durante los ensayos serán realizados por un investigador ciego a la identificación del animal (y el tratamiento, si corresponde). Manipule siempre los ratones utilizando el manejo de tazas (mano abierta) o el manejo de túneles (con un vaso de papel o un túnel de plástico) para evitar los efectos aversivos del manejo tradicional de la cola21.
  6. Mueva los ratones de la jaula de transporte al compartimiento de inicio de la arena. Retire la "puerta" de inicio, baje inmediatamente la tapa de plexiglás sobre la arena y encienda el temporizador de prueba de 5 minutos.
    NOTA: Si se están probando varios ratones de la misma jaula, esto debe hacerse simultáneamente. Sin embargo, el número de animales sometidos a ensayo al mismo tiempo dependerá del número de observadores ciegos disponibles; idealmente, un investigador observará y manejará un animal a la vez, pero un individuo puede observar y manejar dos animales simultáneamente, si es necesario.
  7. Latencia de puntuación en vivo para cavar y latencia para comer la recompensa en ambos brazos.
    1. Registre la latencia para cavar como el momento en que se observa la primera ocurrencia de excavación. La excavación se describe como un ratón que empuja o manipula activamente la ropa de cama de mazorca de maíz con las patas delanteras y / o el hocico.
    2. Registre la latencia para comer como el momento en que se observa la primera aparición de comer. Comer se describe como un ratón que consume una recompensa mientras lo sostiene en las patas delanteras y se sienta en las cojonadas.
  8. Cuando termine la prueba, levante la tapa de plexiglás y mueva el ratón de vuelta a su jaula de transporte.
  9. Deseche toda la ropa de cama de mazorca de maíz y las golosinas que queden en las macetas. Abra los casetes de tejido y deseche las piezas de algodón. Limpie todos los componentes de la arena y las ollas de excavación y huele bien los dispensadores con 70% de etanol.
  10. Configure la arena para una segunda prueba positiva (paso 1.4). Repita los pasos 2.6-2.9 para un ensayo positivo reforzado.
  11. Devuelva la jaula de transporte al asistente de investigación para que los ratones puedan ser colocados de nuevo en su jaula de origen.
  12. Repita los pasos 2.1-2.11 durante 5 días consecutivos.

3. Capacitación sobre discriminación: 10 días, cuatro juicios por día

  1. Configure el escenario para una prueba positiva o negativa (consulte la Tabla 2) siguiendo las instrucciones del paso 1.4.
  2. Realizar dos ensayos positivos y dos negativos por día siguiendo el orden descrito en la Tabla 2 (es decir, alternar ensayos positivos y negativos en los días 1-5 y orden pseudoaleatorio en los días 6-10).
  3. Siga las instrucciones del paso 2.1 al comienzo de cada día de entrenamiento y, a continuación, siga los pasos 2.5 a 2.10. Repita hasta que los ratones se hayan sometido a cuatro ensayos en total.
  4. Devuelva la jaula de transporte al asistente de investigación para que los ratones puedan ser colocados de nuevo en su jaula de origen.
  5. Repita los pasos 3.1-3.4 una vez al día durante 10 días en total (es decir, dos semanas de trabajo consecutivas de 5 días, separadas por un fin de semana de 2 días).

4. Pruebas

NOTA: La duración de la prueba es de 3 a 5 días (dependiendo del tiempo que tarda cada ratón en cumplir con los criterios de aprendizaje), cinco ensayos por día para las sesiones en las que se realizan ensayos positivos y negativos, y tres ensayos por día cuando se realiza la prueba ambigua.

  1. Ratones rápidos durante 1 h antes del entrenamiento / prueba en su jaula casera retirando la comida de la tolva.
  2. Realice un ensayo positivo y un ensayo negativo en un orden aleatorio (consulte la Tabla 1) siguiendo las instrucciones de configuración de la arena en el paso 1.4 y las instrucciones de prueba reforzadas en los pasos 2.5-2.10.
  3. Realice una prueba de prueba no reforzada grabada en vídeo.
    NOTA: Las pruebas no reforzadas son idénticas a las pruebas reforzadas, excepto por el lugar en el que se colocan las recompensas. Por lo tanto, en el juicio no reforzado, una pieza de cada recompensa de alto y bajo valor se coloca en el compartimento inaccesible tanto para las macetas perfumadas como sin perfume.
    1. Realizar un ensayo de prueba positivo o negativo para cada ratón diariamente hasta que se cumplan los criterios de aprendizaje (máximo 4 días; los criterios de aprendizaje se describen en el paso 4.7.3). Asegúrese de que las pruebas positivas y negativas se realicen en orden alterno a lo largo de los días (por ejemplo, Día 1: prueba positiva, Día 2: prueba negativa, Día 3: prueba positiva, etc.).
    2. Siga las instrucciones de configuración de la arena en el paso 1.4.
    3. Mueva los ratones de la jaula de transporte al compartimiento de inicio de la arena. Configure una cámara de video en un trípode para que ambas ollas en los extremos de los brazos estén a la vista y comience a grabar. Asegúrese de que la tarjeta de referencia con el código ciego del animal y el tipo de prueba (prueba positiva o prueba negativa) esté grabada en el video (como referencia durante la puntuación del video).
    4. Retire la "puerta" de inicio, baje inmediatamente la tapa de plexiglás sobre la arena e inicie el temporizador de prueba de 2 minutos.
    5. Cuando termine la prueba, detenga la grabación, mueva la cámara hacia un lado, levante la tapa de plexiglás, mueva el mouse de regreso a su jaula de transporte.
    6. Deseche toda la ropa de cama de mazorca de maíz y las golosinas que queden en las macetas. Abra los casetes de tejido y deseche las piezas de algodón. Limpie todos los componentes de la arena, las ollas de excavación y los dispensadores de aromas a fondo con etanol al 70%.
  4. Realice un ensayo positivo y un ensayo negativo en un orden aleatorio (consulte la Tabla 1) siguiendo las instrucciones de configuración de la arena en el paso 1.4 y las instrucciones de prueba reforzadas en los pasos 2.5-2.10.
  5. Devuelva la jaula de transporte al asistente de investigación para que los ratones puedan ser colocados de nuevo en su jaula de origen.
  6. Una vez que todos los ratones hayan completado sus cinco pruebas diarias, transfiera videos de la tarjeta de memoria de la cámara a una computadora para la puntuación de video.
  7. Califique los videos de prueba positivos y negativos el día de la prueba para evaluar si los ratones han cumplido con los criterios de aprendizaje. Asegure la puntuación de video el mismo día, ya que los animales que cumplan con los criterios de aprendizaje se someterán a pruebas ambiguas al día siguiente.
    1. Usando un software de grabación de eventos o un cronómetro, haga que el investigador que es ciego al tratamiento registre la latencia de cada ratón para cavar y cavar la duración en cada maceta durante el primer minuto de pruebas positivas y negativas.
    2. Registre la latencia para cavar como el momento en que se observa la primera ocurrencia de excavación. La excavación se describe como un ratón que empuja o manipula activamente la ropa de cama de mazorca de maíz con las patas delanteras y / o el hocico. Registre la duración de la excavación como el tiempo total que un ratón pasa cavando.
    3. Compare la duración de la excavación en el brazo perfumado entre los ensayos positivos (DS +) y negativos (DS-) para cada ratón para determinar si los animales pueden discriminar la tarea. Considere el criterio de aprendizaje que debe cumplirse si la duración de la excavación en el brazo perfumado DS+ es al menos el doble que para el brazo perfumado DS durante el primer minuto de prueba (con una duración mínima de excavación DS+ de 3 s).
  8. Repita los pasos 4.1-4.7 diariamente hasta que los ratones hayan cumplido con el criterio de aprendizaje.
    1. Excluir a las personas que no han cumplido con el criterio para el día 4 de los ensayos ambiguos (y, por lo tanto, la evaluación del sesgo de juicio).
  9. Para los ratones que han cumplido con los criterios de aprendizaje, pruebe las respuestas a la mezcla de olor ambiguo.
    1. Ratones rápidos durante 1 h antes del entrenamiento / prueba en su jaula casera retirando la comida de la tolva.
    2. Realice un ensayo reforzado positivo y uno negativo en un orden aleatorio siguiendo las instrucciones de configuración de la arena en los pasos 1.4 y las instrucciones de prueba reforzadas en los pasos 2.5-2.10.
    3. Realice una prueba de prueba no reforzada grabada en vídeo como se describe en el paso 4.3 utilizando la mezcla de olor ambiguo (consulte la Tabla 2).
  10. Puntúe videos de juicio ambiguos para evaluar el sesgo de juicio.
    1. Usando un software de grabación de eventos o un cronómetro, haga que un investigador ciego a la identificación y el tratamiento del animal registre la latencia de cada ratón para cavar (consulte el paso 4.7.2) en cada olla durante los primeros 1 minuto y 2 minutos de los ensayos de prueba.

5. Análisis de datos

NOTA: Los análisis exactos requeridos dependerán de los detalles del diseño experimental. Aquí se describe una visión general, pero se recomienda encarecidamente a los investigadores que se refieran a Gygax22 al planificar análisis para experimentos de JB en animales, y a Gaskill y Garner23 al seleccionar el tamaño de la muestra (ya que los análisis requeridos a menudo son demasiado complejos para los análisis de potencia a priori ).

  1. "Desenmascarar" al investigador agregando la identificación del animal correspondiente y la información de tratamiento (por ejemplo, vivienda enriquecida o convencional; medicamento o placebo, etc.) para cada código ciego a la hoja de cálculo. Asegúrese de que la hoja de cálculo resultante incluya tres filas para cada animal que cumpla con los criterios de aprendizaje (es decir, para los ensayos de prueba positivos, negativos y ambiguos) que indiquen latencias para cavar en el brazo perfumado.
  2. Ejecute un modelo mixto lineal generalizado de medidas repetidas, utilizando el software estadístico preferido. Aquí, la variable de resultado será la latencia para excavar. Asegúrese de que el modelo incluya el tratamiento (o variable continua de interés), el tipo de ensayo y la interacción entre el tipo de ensayo y el tipo de ensayo como efectos fijos. Incluya el ID del ratón (anidado dentro del tratamiento) como un efecto aleatorio. Los términos adicionales incluidos en el modelo dependerán del diseño experimental aplicado.
    NOTA: Si los ratones son alojados en grupo (como es apropiado para esta especie social24) y se prueban los compañeros de jaula, entonces la jaula anidada dentro del tratamiento (si está presente) debe incluirse en el modelo como un efecto aleatorio (y la identificación del ratón debe anidarse posteriormente dentro de la jaula).
  3. Trazar las medias de latencia de mínimo cuadrado en cada tipo de ensayo para confirmar que la señal ambigua presentada se interpretó como intermedia (es decir, la estimación de las medias de latencia al mínimo cuadrado para la prueba ambigua debe caer en un punto medio entre las latencias positivas y negativas). Evalúe JB del ratón solo si se cumple este requisito.
  4. Evaluar el efecto simple del tratamiento (o variable continua de interés) sobre la latencia para profundizar en el ensayo ambiguo investigando la interacción Tratamiento x Tipo de ensayo para determinar si los ratones muestran JB modulado por afecto.

figure-protocol-1
Figura 1: Diagrama del aparato experimental. El aparato JB incluye una arena rectangular con dos brazos. Cada brazo contiene un dispensador de aroma ubicado al principio y una olla de excavación colocada al final. Reimpreso de Resasco et al.19 con permiso de Elsevier. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Fase:Diseño Experimental
TodoRecompensa de alto valorChip de plátano
Recompensa de bajo valorRoedor chow
DS+Menta o Vainilla (contrapesada)
DS-Menta o Vainilla (contrapesada)
Entrenamiento de excavaciónPrograma de entrenamiento de excavación5 días: 2 Pos pruebas/día
Duración de la prueba de excavación5 minutos
Capacitación sobre discriminaciónPrograma de capacitación sobre discriminación10 días: 4 ensayos/día
Orden de prueba de excavaciónDías 1-5: 4 ensayos/día
Prueba 1: Pos
Prueba 2: Neg
Prueba 3: Pos
Prueba 4: Neg
Días 6-10: 4 ensayos/día*
Duración del juicio por discriminación5 minutos
EnsayoPrograma de pruebas3-5 días (dependiendo del tiempo para cumplir con los criterios de aprendizaje)
5 ensayos/día
Orden de la fase de pruebaEnsayos 1 y 2: Pos o Neg**
Prueba 3: prueba de prueba
Ensayos 4 y 5: Pos o Neg**
Duración de la prueba2 min
* Los ensayos fueron pseudoaleatorizados, por lo que los ratones siempre tuvieron dos ensayos Pos y dos Neg por día.
** Los ensayos fueron pseudoaleatorios, por lo que los ratones siempre tuvieron un ensayo Pos y uno Neg antes y después del ensayo de prueba

Tabla 1: Resumen del diseño experimental y cronograma de entrenamiento y pruebas. Número y orden de ensayos por día para las fases de entrenamiento de excavación, entrenamiento de discriminación y prueba, además de los detalles de diseño experimental. Reimpreso de Resasco et al.19 con permiso de Elsevier.

Detalles de la prueba
FaseTipo de pruebaBrazo perfumadoBrazo sin perfume
Señal de olorRecompensa enterradaRecompensa inaccesibleSeñal de olorRecompensa enterradaRecompensa inaccesible
Capacitación en excavación y discriminaciónFormación PosDS+PlátanoChowAguaChowPlátano
Formación NegDS-Sin recompensaPlátano + chowAguaChowPlátano
EnsayoPrueba PosDS+Sin recompensaPlátano + chowAguaSin recompensaPlátano + chow
Prueba de NegDS-Sin recompensaPlátano + chowAguaSin recompensaPlátano + chow
Prueba ambiguaMenta/
mezcla de vainilla		Sin recompensaPlátano + chowAguaSin recompensaPlátano + chow
Criterio de aprendizajeLos ratones deben cavar el doble de tiempo en la olla DS + (prueba Pos) que la DS- pot (prueba Neg), y cavar durante un mínimo de 3 s

Tabla 2. Resumen de los detalles del juicio. Señales de olor y recompensas presentadas en cada tipo de prueba durante las fases de Entrenamiento de excavación, Capacitación de discriminación y Prueba. DS(+): estímulo discriminativo positivo, DS(-): estímulo discriminativo negativo, Pos: positivo, Neg: negativo. Reimpreso de Resasco et al.19 con permiso de Elsevier. Véase el cuadro suplementario S2 en el artículo original para el cuadro ampliado.

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Resultados

Los resultados aquí presentados reflejan los hallazgos relevantes del Experimento 1 de Resasco et al.19. Los sujetos en este experimento fueron 18 hembras C57BL / 6NCrl ('C57') y 18 ratones Balb / cAnNCrl ('Balb'). Los animales llegaron a la instalación a las 3-4 semanas de edad y fueron asignados al azar a tratamientos de alojamiento enriquecidos ambientalmente o convencionales (EH o CH, respectivamente) en cuartetos de cepas mixtas25. Cada jaula contenía un C57 y un Balb,...

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Discusión

El protocolo de excavación basado en olores y los resultados descritos aquí demuestran la capacidad de esta novedosa tarea de JB para detectar cambios en el estado afectivo del ratón. Por lo tanto, la tarea presenta una herramienta valiosa para diversos campos de investigación. Similar a cualquier tarea de JB, para evaluar el afecto animal es fundamental que los animales primero aprendan a discriminar entre señales (paso 4.7.3) y que el estímulo ambiguo se interprete como intermedio (paso 5.3). Aunque es simple, cumplir ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Miguel Ayala, Lindsey Kitchenham, la Dra. Michelle Edwards, Sylvia Lam y Stephanie Dejardin por sus contribuciones al trabajo de validación de Reseasco et al.19 en el que se basa este protocolo. También nos gustaría agradecer a los ratones y a nuestros maravillosos técnicos de cuidado de animales, Michaela Randall y Michelle Cieplak.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Etanol absolutoAlcohol comercialP016EAANDiluir al 70% con agua destilada, para la limpieza
Tubos de centrífugaFischer55395Tubos de 15 mL utilizados para diluir esencias aquí. Sin embargo, el tamaño puede seleccionarse en función del volumen total requerido para el tamaño de la muestra
Cheerios (original)CheeriosN/ADisponible comercialmente. Se utiliza como recompensa para entrenar a los animales para que entren en la jaula anexa para su manipulación
Lecho de mazorca de maízEnvigo7092Teklad 1/8 lecho de mazorca de maíz utilizado en macetas de excavación y jaulas de animales
Almohadillas de algodónEquateN/ADisponible comercialmente. Modificado en laboratorio para caber dentro de casetes de pañuelos para dispensación de aromas
Macetas de excavaciónRubbermaidN/ADisponible comercialmente. Los recipientes se modificaron para adaptarse al aparato en el laboratorio
Chips de plátano secos y endulzadosCaldo y barrilN/ADisponible comercialmente. Recompensa de alto valor en la tarea JB
APARATON / AEl aparato se fabricó en el
laboratorio JWatcher software de grabación de eventosLaboratorio de Comportamiento Animal, Universidad de MacquarieVersión 1.0Disponible gratuitamente para descargar en línea. Se utiliza para puntuar el comportamiento de excavación durante la tarea JB
Extracto de mentaFleiborN/AComercialmente "Menta (Solució n)". Estímulo discriminativo olfato
Dieta de roedoresEnvigo2914Teklad global 14% proteína dietas de mantenimiento de roedores. Recompensa de bajo valor en la tarea JB y dieta regular en la jaula doméstica
Software estadístico SASSASVersión 9.4Otros programas de software comparables (por ejemplo, R) también son apropiados
Extracto de vainillaFleiborDisponible comercialmente "Vainilla (Solució n)". Estímulo discriminativo de olor
Cámara de vídeoSonyDCR-SX22Sony handycam.
JB

Referencias

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