La glándula pituitaria es el regulador clave del sistema endocrino del cuerpo. Este artículo describe el desarrollo de organoides a partir de la hipófisis del ratón como un nuevo modelo 3D in vitro para estudiar la población de células madre de la glándula, cuya biología y función siguen siendo poco conocidas.
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Artículo de método
Desarrollo de organoides a partir de la hipófisis del ratón como modelo in vitro para explorar la biología de las células madre hipofisarias
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Resumen
Resumen
La hipófisis es la glándula endocrina maestra que regula los procesos fisiológicos clave, incluido el crecimiento corporal, el metabolismo, la maduración sexual, la reproducción y la respuesta al estrés. Hace más de una década, se identificaron células madre en la glándula pituitaria. Sin embargo, a pesar de la aplicación de enfoques transgénicos in vivo , su fenotipo, biología y papel siguen sin estar claros. Para abordar este enigma, se desarrolla un nuevo e innovador modelo organoide in vitro para desentrañar profundamente la biología de las células madre hipofisarias. Los organoides representan estructuras celulares 3D que, bajo condiciones de cultivo definidas, se desarrollan a partir de las células madre (epiteliales) de un tejido y recapitulan múltiples características de esas células madre y su tejido. Aquí se muestra que los organoides derivados de la hipófisis del ratón se desarrollan a partir de las células madre de la glándula y recapitulan fielmente sus características fenotípicas y funcionales in vivo . Entre otros, reproducen el estado de activación de las células madre como in vivo que ocurre en respuesta al daño local infligido transgénicamente. Los organoides son expandibles a largo plazo mientras conservan robustamente su fenotipo de tallo. El nuevo modelo de investigación es muy valioso para descifrar el fenotipo y el comportamiento de las células madre durante las condiciones clave de remodelación de la hipófisis, que van desde la maduración neonatal hasta el desvanecimiento asociado al envejecimiento, y desde las glándulas sanas hasta las enfermas. Aquí, se presenta un protocolo detallado para establecer organoides derivados de la hipófisis del ratón, que proporcionan una herramienta poderosa para sumergirse en el pero enigmático mundo de las células madre hipofisarias.
Introducción
La hipófisis es una pequeña glándula endocrina ubicada en la base del cerebro, donde está conectada al hipotálamo. La glándula integra entradas periféricas y centrales (hipotalámicas) para generar una liberación hormonal sintonizada y coordinada, regulando así los órganos endocrinos objetivo aguas abajo (como las glándulas suprarrenales y las gónadas) para producir hormonas apropiadas en el momento adecuado. La hipófisis es el regulador clave del sistema endocrino y, por lo tanto, se denomina legítimamente la glándula maestra1.
La hipófisis del ratón consta de tres lóbulos (....
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Protocolo
Los experimentos con animales para este estudio fueron aprobados por el Comité Ético de Ku Leuven para la Experimentación Animal (P153/2018). Todos los ratones fueron alojados en las instalaciones de animales de la universidad en condiciones estandarizadas (temperatura constante de 23 ± 1,5 ° C, humedad relativa del 40% al 60% y un ciclo día/noche de 12 h), con acceso a agua y alimentos ad libitum.
1. Ratones
- Utilice cepas de ratón disponibles comercialmente, como ratones C57BL/6J, de edad adulta joven (8-12 semanas de edad). En general, 2-3 ratones proporcionan un número suficiente de células AL para el ....
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Resultados
Después del aislamiento y la disociación de la AL, las células individuales obtenidas se siembran en ECM y se cultivan en PitOM (Figura 1, Tabla 1). La Figura 3A muestra el cultivo celular y la densidad en la siembra (Día 0). Algunos pequeños escombros pueden estar presentes (Figura 3A, puntas de flecha blancas), pero desaparecerán al pasar. Catorce días después de la siembra, los organoides derivados de AL están co.......
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Discusión
Los organoides derivados de AL, como se describe aquí, representan un poderoso modelo de investigación para estudiar las células madre hipofisarias in vitro. En la actualidad, este enfoque organoide es la única herramienta disponible para crecer y expandir de manera confiable y robusta las células madre hipofisarias primarias. Anteriormente se ha notificado un modelo organoide hipofisario derivado de células madre embrionarias (ESC) o células madre pluripotentes inducidas (iPSC), que recapitula estrechamente la.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Fondo de Investigación de Ku Leuven y el Fondo para la Investigación Científica (FWO) - Flandes. E.L. (11A3320N) y C.N. (1S14218N) están respaldados por una beca de doctorado de la FWO / FWO-SB.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Placas de 48 pocillos, tratadas con TC, envueltas individualmente | Costar | 734-1607 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | |
| Albúmina Bovina (grado de cultivo celular) | Serva | 47330 | |
| B-27 Suplemento ( 50X), menos vitamina A | Gibco | 12587010 | |
| Moldes base VWR | 720-1918 | ||
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Casetes, Q Path Microtwin | VWR | 720-2191 | |
| Filtro de células, 40 µ m mesh, desechable | Falcon | 352340 | |
| Toxina del cólera de Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Desoxirribonucleasa I del páncreas bovino | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| D-glucosa | Merck | 108342 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM, en polvo, alta glucosa | Gibco | 52100039 | |
| Eppendorf Tubos Safe-Lock, 1,5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Epredia SuperFrost Plus Portaobjetos de adherencia | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Epredia Estación de trabajo de integración HistoStar, de 220 a 240 VCA | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| etanol absoluto 99,8+% | Thermo Fisher Scientific | ||
| Suero fetal bovino (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| GlutaMAX Suplemento | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| HEPES Solución tampón | Gibco | 15630056 | |
| InSolution Y-27632 | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| L-Glutamina (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Matrigel Factor de Crecimiento Reducido (GFR) Matriz de Membrana Basal, sin LDEV | Corning | 15505739 | |
| Mr. Frosty Contenedor de congelación | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| N-2 Suplemento (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-acetil-L-cisteína | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nunc Biobanco y Tubos Criogénicos de Cultivo | Celular Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Paraformaldehído para síntesis (PFA) | Merck | 818715 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicilina G sal sódica | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Rojo fenol | Merck | 107241 | |
| Cloruro de potasio (KCl) | Merck | 104936 | |
| Proteína EGF humana recombinante, CF | R& Sistemas D | 236-EG | |
| FGF humano recombinante básico/FGF2/bFGF (157 aa) Proteína | R& Sistemas D | 234-FSE | |
| Recombinante Humano FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinante Humano IGF-1 | Peprotech | 100-11 | |
| Recombinante Humano IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| Recombinante Humano Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Recombinante Humano R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
| Humano/Murino Recombinante FGF-8b | Peprotech | 100-25 | |
| Ratón Recombinante Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus | R& D systems | 464-SH | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
| SeaKem LE Agarosa | Lonza | 50004 | |
| Cloruro de sodio (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Fosfato de dihidrógeno de sodio 1-hidrato | PanReac-AppliChem | A1047 | |
| Sodio Carbonato de hidrógeno (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Piruvato de sodio (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Stericup-GP, 0.22 µ m | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Unidad de filtro superior de tubo de centrífuga estéril, 0.22 μ m | Millipore | SCGP00525 | |
| Agua estéril | Fresenius | B230531 | |
| Sal de sulfato de estreptomicina | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Thermo Scientific Excelsior ES Procesador de tejidos | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Titriplex III | Merck | 108418 | |
| TrypL Express Enzyme (1X), rojo fenol | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | |
| Inhibidor de tripsina de Glycine max (soja) | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| Solución de tripsina 2.5 % | Thermo Fisher Scientific 15090046 |
Referencias
- Melmed, S. The pituitary. 3rd ed. , Elsevier/Academic Press. Cambridge. 1(2011).
- Chen, J., et al. The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics. Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).
- Chen,....
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Reimpresiones y permisos
