Método de doble tinción para detectar la pectina en la interacción planta-hongo

Resumen

Este protocolo describe un método microscópico para detectar la pectina en la interacción café-hongo.

Resumen

Las células vegetales utilizan diferentes mecanismos estructurales, ya sean constitutivos o inducibles, para defenderse de la infección por hongos. La encapsulación es un mecanismo inducible eficiente para aislar los haustorios fúngicos del protoplasto de células vegetales. Por el contrario, la pectina, uno de los componentes poliméricos de la pared celular, es un objetivo de varias enzimas pectolíticas en interacciones necrotróficas. Aquí, se presenta un protocolo para detectar pectina e hifas fúngicas a través de microscopía óptica. Se investiga la encapsulación rica en pectina en las células de las hojas de café infectadas por el hongo de la roya Hemileia vastatrix y la modificación de la pared celular mesófila inducida por Cercospora coffeicola . Las muestras de hojas lesionadas se fijaron con la solución de Karnovsky, se deshidrataron y se incrustaron en metacrilato de glicol durante 2-4 días. Todos los pasos fueron seguidos por el bombeo de vacío para eliminar el aire en los espacios intercelulares y mejorar el proceso de incrustación. Los bloques incrustados se seccionaron en secciones de 5-7 μm de espesor, que se depositaron en un portaobjetos de vidrio cubierto con agua y posteriormente se calentaron a 40 ° C durante 30 min. A continuación, los portaobjetos se tiñeron dos veces con 5% de azul algodón en lactofenol para detectar el hongo y 0,05% de rojo rutenio en agua para detectar pectina (grupos ácidos de ácidos poliurónicos de pectina). Se encontró que los haustorios fúngicos de Hemileia vastatrix estaban encapsulados por pectina. En la cercosporiosis del café, las células mesófilas exhibieron disolución de las paredes celulares, y se observaron hifas y conidióforos intercelulares. El método presentado aquí es efectivo para detectar una respuesta asociada a la pectina en la interacción planta-hongo.

Introducción

Los mecanismos de defensa de la pared celular en las plantas son cruciales para contener la infección por hongos. Los estudios han reportado cambios en el grosor y la composición de la pared celular desde el^{siglo 19 1,2}. Estos cambios pueden ser inducidos por un patógeno fúngico que estimula la formación de una papila, que impide que los hongos entren en la célula o podría usarse para encapsular las hifas para aislar el protoplasto de la célula huésped de la haustoria fúngica. La producción de una barrera dinámica de la pared celular (es decir, papilas y un haustorio completamente encerrado) es impo....

Protocolo

1. Preparación de la solución tampón y los reactivos

1. Prepare un tampón de cacodilato de 2 M agregando 4.28 g de cacodilato de sodio a 100 ml de agua destilada y ajuste el pH a 7.25 con 0.2 N HCl.
2. Preparar 100 mL de la solución fijadora karnovsky mezclando 10 mL de glutaraldehído acuoso al 25%, 10 mL de formaldehído acuoso al 10%, 25 mL de tampón de cacodilato al 25% y 0,5 mL de CaCl_{2 26} M. Enrasar el volumen hasta 100 mL con agua destilada.
   NOTA: La solución se puede mantener en un refrigerador durante 6 meses.
   PRECAUCIÓN: La solución tampón de cacodilato es tóxica; por lo tanto, manipule la....

Resultados

La tinción de lactofenol azul algodón en la sección incrustada en GMA reveló la presencia de varias estructuras fúngicas entre y dentro de las células mesófilas del café en las interacciones fúngicas biotróficas y necrotróficas.

En el patosistema biotrófico, cuando se tiñe utilizando el método de doble tinción, las hifas de Hemileia vastatrix que contienen paredes celulares y el contenido denso de protoplastos aparecen en azul oscuro tanto en el parénquima esponjoso como en el de empa.......

Discusión

El presente trabajo introduce una prueba histoquímica alternativa de doble tinción para investigar la composición de pectina de las paredes celulares que encapsula la haustoria en un patológico biotrófico. El objetivo también es demostrar la eficacia del método para detectar hongos necrotróficos y cambios en la pared celular inducidos por él. Aquí, la pectina de las paredes celulares del parénquima del café puede encapsular tanto el cuello como el haustorio del hongo de la roya Hemileia vastatrix. Silva et al. t.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cuchillas DB80 HS	Leica	14035838383	Seccionamiento
Tampón de cacodilato	EMS	# 11652	Fijación
Algodón Azul Lactofenol	Metaquí mica	70SOLSIG024629	Tinción
de formaldehído EMS		#15712	Fijación
Glutaraldehído	EMS	#16216	Fijación
Historesin Kit	Technovit /EMS	#14653	Historesin para incrustar
Placa caliente	Dubesser	SSCD25X30-110V	Microscopía de tinción
	Zeiss	#490040-0030-000	Captura de imágenes
Microtomo (Leica RM 2540)	Leica	149BIO000C1 14050238005	Seccionamiento
Bandeja de vasos de moldeo de plástico	EMS	10176-30	Tinción
Rojo rutenio	LABHouse	#006004	de tinción
Axion Vision	Zeiss	#410130-0909-000 Captura de	imágenes
Bomba de vacío	Prismatec	131 TIPO 2 V.C.	fijación

Software