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Artículo de método

Förster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features

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DOI:

10.3791/63433

⸱

16 de marzo de 2022

 ,  , 
1Molecular Biology and Biochemistry Department, Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program, Wesleyan University

En este artículo

Resumen

El estudio detalla la metodología del mapeo FRET, incluida la selección de sitios de etiquetado, la elección de tintes, la adquisición y el análisis de datos. Esta metodología es efectiva para determinar los sitios de unión, los cambios conformacionales y los movimientos dinámicos en los sistemas de proteínas y es más útil si se realiza junto con la información estructural 3D existente.

Resumen

La transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) es un método establecido basado en la fluorescencia utilizado para medir con éxito las distancias en y entre las biomoléculas in vitro, así como dentro de las células. En FRET, la eficiencia de la transferencia de energía, medida por los cambios en la intensidad de la fluorescencia o la vida útil, se relaciona con la distancia entre dos moléculas fluorescentes o etiquetas. La determinación de la dinámica y los cambios conformacionales a partir de las distancias son solo algunos ejemplos de las aplicaciones de este método a los sistemas biológicos. Bajo ciertas condiciones, esta metodología puede agregar y mejorar las estructuras cristalinas de rayos X existentes al proporcionar información sobre la dinámica, la flexibilidad y la adaptación a las superficies de unión. Describimos el uso de FRET y las determinaciones de distancia asociadas para dilucidar las propiedades estructurales, a través de la identificación de un sitio de unión o las orientaciones de las subunidades de dímeros. A través de la elección juiciosa de los sitios de etiquetado y, a menudo, el empleo de múltiples estrategias de etiquetado, hemos aplicado con éxito estos métodos de mapeo para determinar las propiedades estructurales globales en un complejo proteína-ADN y el sistema de translocación de proteínas SecA-SecYEG. En el sistema SecA-SecYEG, hemos utilizado métodos de mapeo FRET para identificar el sitio de unión a preproteínas y determinar la conformación local de la región de secuencia de señales unidas. Este estudio describe los pasos para realizar estudios de mapeo FRET, incluida la identificación de sitios de etiquetado apropiados, la discusión de posibles etiquetas, incluidos los residuos de aminoácidos no nativos, los procedimientos de etiquetado, cómo realizar mediciones e interpretar los datos.

Introducción

Para las proteínas, la elucidación de la dinámica junto con el conocimiento estructural tridimensional (3-D) conduce a una mejor comprensión de las relaciones estructura-función de los sistemas biomoleculares. Los métodos estructurales, como la cristalografía de rayos X y la microscopía electrónica criogénica, capturan una estructura estática y, a menudo, requieren la determinación de múltiples estructuras para dilucidar aspectos de la unión y dinámica de biomoléculas1. En este artículo se describe un método basado en soluciones para mapear elementos estructurales globales, como sitios de enlace o interacciones de enlace, que son potencialmente más transitorios y menos fáciles de capturar mediante métodos estáticos. Los sistemas candidatos fuertes para esta metodología son aquellos en los que una estructura 3-D ha sido previamente determinada por cristalografía de rayos X, espectroscopia de RMN u otros métodos estructurales. En este caso, aprovechamos la estructura cristalina de rayos X del complejo SecA-SecYEG, un actor central en la vía secretora general de la proteína, para mapear la ubicación de un sitio de unión al péptido señal utilizando la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) antes del transporte de la preproteína a través de la membrana2. La manipulación del sistema biológico a través de modificaciones genéticas junto con nuestro conocimiento de la estructura 3-D permitió la determinación de la conformación de la secuencia de señal y la región madura temprana inmediatamente antes de la inserción en el canal 3.

FRET implica la transferencia de energía sin radiación de una molécula (donante) a otra (aceptor) de una manera dependiente de la distancia que es a través del espacio 4,5. La eficiencia de esta transferencia se controla a través de una disminución en el donante o un aumento en la intensidad de la fluorescencia del aceptor. La eficiencia de la transferencia de energía se puede describir como

E = R06/(R06 + R6)

en el que el valor R0 es la distancia a la que la transferencia es 50% eficiente6. La técnica ha sido descrita previamente como una regla molecular y es efectiva para determinar distancias en el rango de 2.5-12 nm, dependiendo de la identidad de los colorantes donante-aceptor 4,7,8,9. Las intensidades de fluorescencia del donante y las vidas útiles con o sin aceptor permiten determinar las eficiencias de transferencia y, en consecuencia, las distancias 5,8. Debido a la disponibilidad de la tecnología, la sensibilidad del método y la facilidad de uso, FRET también ha encontrado una amplia aplicación en áreas como la espectroscopia de fluorescencia de molécula única y la microscopía confocal6. El advenimiento de proteínas fluorescentes como la proteína fluorescente verde ha hecho que la observación de la dinámica intracelular y las imágenes de células vivas sean relativamentefáciles 10,11. Muchas aplicaciones FRET como estas se discuten en detalle en este número virtual.

En este estudio, nos centramos particularmente en el uso de mediciones FRET para obtener valores de distancia para determinar detalles estructurales. Anteriormente, las mediciones de FRET se han utilizado eficazmente para determinar la conformación de las moléculas de ADN cuando se unen a la proteína 12,13,14, la dinámica interna de las proteínas y las interacciones de unión a proteínas 15,16,17. Las ventajas de este método radican en la capacidad de determinar elementos estructurales flexibles y dinámicos en una solución con cantidades relativamente bajas de material. Significativamente, este método es particularmente efectivo cuando se usa junto con la información estructural existente y no se puede usar como un medio de determinación de la estructura 3D. El método proporciona la mejor visión y refinamiento de la estructura si el trabajo se basa en la información estructural existente a menudo junto con la simulación computacional18,19. Aquí, se describe el uso de distancias obtenidas de mediciones FRET en estado estacionario y resueltas en el tiempo para mapear un sitio de unión, cuya ubicación no se conocía, en una estructura cristalográfica existente del complejo SecA-SecYEG, proteínas principales en la vía secretora general3.

La vía secretora general, un sistema altamente conservado desde procariotas hasta eucariotas y arqueas, media el transporte de proteínas a través o dentro de la membrana a su ubicación funcional en la célula. Para las bacterias Gram-negativas, como E. coli, el organismo utilizado en nuestro estudio, las proteínas se insertan o translocan a través de la membrana interna hasta el periplasma. El complejo del canal SecY bacteriano (denominado translocon) se coordina con otras proteínas para translocar la proteína recién sintetizada, que se dirige a su ubicación correcta en la célula a través de una secuencia de señal típicamente ubicada en el extremo N20,21. Para las proteínas unidas al periplasma, la proteína ATPasa SecA se asocia con el túnel de salida del ribosoma, y con la preproteína después de que se hayan traducido aproximadamente 100 residuos22. Junto con la proteína chaperona SecB, mantiene la preproteína en un estado desplegado. SecA se une al translocón SecYEG, y a través de muchos ciclos de hidrólisis de ATP, facilita el transporte de proteínas a través de la membrana23,24.

SecA es una proteína multidominio que existe en formas citosólicas y unidas a la membrana. Una proteína homodimérica en el citosol, SecA consiste en un dominio de unión preproteica o de reticulación25, dos dominios de unión a nucleótidos, un dominio de ala helicoidal, un dominio de andamio helicoidal y el dedo de dos hélices (THF)26,27,28,29 (Figura 1). En estudios cristalográficos previos del complejo SecA-SecYEG, la ubicación del THF sugirió que participaba activamente en la translocación de proteínas y los experimentos posteriores de reticulación con el péptido señal establecieron aún más la importancia de esta región en la translocación de proteínas30,31. Estudios previos, utilizando la metodología de mapeo FRET, demostraron que los péptidos señal exógenos se unen a esta región de SecA 2,32. Para comprender completamente la conformación y la ubicación de la secuencia de señal y la región madura temprana de la preproteína antes de la inserción en el canal SecYEG, se creó una quimera de proteínas en la que la secuencia de señales y los residuos de la región madura temprana se unieron a SecA a través de un enlazador Ser-Gly (Figura 1). Utilizando esta construcción biológicamente viable, se demostró además que la secuencia de señales y la región madura temprana de la preproteína se unen al THF de manera paralela2. Posteriormente, se utilizó la metodología de mapeo FRET para dilucidar la conformación y localización de la secuencia de señales y la región madura temprana en presencia de SecYEG como se describe a continuación3.

El conocimiento de la estructura 3-D del complejo SecA-SecYEG 33,34,35 y la posible ubicación del sitio de unión nos permitió colocar juiciosamente etiquetas donante-aceptor en lugares donde la intersección de distancias FRET individuales identifica la ubicación del sitio de unión. Estas mediciones de mapeo FRET revelaron que la secuencia de señales y la región madura temprana de la preproteína forman una horquilla con la punta ubicada en la boca del canal SecYEG, lo que demuestra que la estructura de la horquilla se modela antes de la inserción del canal.

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Protocolo

1. Selección de sitios de etiquetado

  1. Identifique al menos tres posibles sitios de etiquetado para triangular el supuesto sitio de unión en las estructuras proteicas existentes. En este caso, se identificaron SecA, SecYEG y preproteína unida a SecA a través de la fusión genética2.
    1. Elija sitios de etiquetado dentro de 25-75 Å del sitio de unión putativo y en regiones relativamente estáticas de la proteína, la distancia determinará el par de tinte FRET específico que se utilizará36. Localice los sitios de etiquetado en regiones de proteínas que son relativamente distintas entre sí, de modo que los sitios describan los vértices de un triángulo con el supuesto sitio de unión ubicado en el centro (Figura 1A-D).
    2. Introducir o identificar residuos de cisteína (Cys) en los sitios de etiquetado de interés en una proteína que no tiene otros residuos de Cys, para mejorar la eficiencia de etiquetado del sitio específico37,38.
    3. Introducir aminoácidos no naturales, por ejemplo, p-azidofenilalanina para el etiquetado con química de clic, con el fin de etiquetar eficazmente una proteína en dos posiciones distintas con diferentes colorantes39,40.
    4. Pruebe los mutantes cys para detectar la pérdida de función. Verifique la actividad del mutante sin Cys y el mutante de aminoácidos no naturales utilizando un ensayo de actividad apropiado. En este caso, la actividad se verificó con un ensayo de crecimiento seguido de un ensayo in vitro de ATPasa verde de malaquita 32,41,42

2. Etiquetado de la proteína

  1. Purifique la proteína o proteínas de interés hasta al menos un 95% de pureza para un etiquetado preciso. Purificar las proteínas SecA y SecYEG siguiendo los protocolos detallados en la referencia3. Asegúrese de tener al menos 5 μg de proteína purificada para este paso, ya que se perderá algo de proteína durante el proceso de etiquetado.
  2. Elija dos tintes para las mediciones FRET en función de su valor R0 y las distancias previstas entre los sitios etiquetados. Estimar los valores de R0 y observar la superposición de emisiones y absorbancia del aceptor del donante utilizando la información de la base de datos de proteínas fluorescentes, que también proporciona espectros para colorantes de uso común (https://www.fpbase.org/spectra/)36.
    NOTA: R0 se define como la distancia a la que la eficiencia de transferencia es del 50% para un par de tintes determinado. Para los experimentos de mapeo, las distancias predichas deben estar cerca del valor R0 del par de tintes para garantizar que las distancias se puedan medir con precisión.
  3. Etiquete las posiciones identificadas en el paso 1.1.1. con el par de colorantes donante-aceptor.
    1. Etiquete la proteína de acuerdo con las instrucciones del fabricante, prestando especial atención a parámetros como la concentración óptima de proteínas, la temperatura, el pH, la duración del tiempo y el tampón para los colorantes específicos utilizados43,44.
    2. Prepare la proteína a una concentración de 1-2 mg/mL o aproximadamente 10 μM en un tampón Tris-HCl (pH 7.5), 25 mM KCl, 1 mM EDTA (TKE) de 25 mM. Disolver el colorante en dimetilformamida (DMF) o dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración final de 1 mM. Agregue el colorante gota a gota a la solución mientras se agita para alcanzar una relación molar colorante:proteína de 5:1 (colorante de 50 μM: proteína de 10 μM).
    3. Deje que la reacción continúe durante 4 h a temperatura ambiente (RT) en un vial de vidrio con balanceo suave o durante la noche a 4 °C. Detenga la reacción agregando β-mercaptoetanol.
      NOTA: Si la proteína no es compatible con el tampón Tris, se pueden utilizar tampones de fosfato o HEPES. Mantenga el pH en el rango de 7.0-7.5. Si la proteína tiene enlaces disulfuro, agregue un agente reductor como TDT o TCEP antes del etiquetado. Retire la TDT mediante diálisis o filtración en gel antes de agregar el tinte.
  4. Para mediciones FRET precisas, retire el tinte libre con un concentrador centrífugo con un corte de peso molecular (MWCO) apropiado para dejar que el tinte libre fluya mientras retiene la proteína marcada.
    1. Prepare la membrana concentradora colocando ~ 1 ml de agua en la parte superior de un concentrador de 3 ml y luego centrífique el agua a través de la membrana (al menos 10 min a 4,300 x g).
    2. Retirar el colorante libre centrifugando la muestra etiquetada en concentrador (20 min a 4.300 x g). Repita 3-4 veces y deseche el flujo a través.
    3. Compruebe la eficiencia del etiquetado de la proteína marcada mediante espectroscopia de absorción UV-Vis.
      NOTA: Las mediciones fret requieren eficiencias de etiquetado del 50% o más. Las eficiencias de etiquetado más bajas reducen la señal FRET y pueden provocar imprecisiones en la medición.
    4. Obtener un espectro UV-Vis de la proteína marcada con un rango de 250-700 nm para observar tanto la banda de absorción de proteínas como la banda de absorción máxima del colorante. Mida la absorbancia en el pico de absorción del colorante y a 280 nm para la proteína.
    5. Determinar la concentración de proteína y corregir cualquier contribución del colorante utilizando el factor de corrección, CF, y las siguientes ecuaciones45,46:
      figure-protocol-1
      donde C es la concentración de la proteína (M), A280 es la absorbancia de la muestra a 280 nm, Amax es la absorbancia en el máximo de absorción del colorante, ε proteína es el coeficiente de extinción de la proteína a 280 nm y CF es el factor de corrección, A'280/A'max, donde A'280 es la absorbancia a 280 nm y A'max es la absorbancia en el máximo máximo para el colorante solamente.
    6. Determine la eficiencia del etiquetado mediante la siguiente ecuación:
      figure-protocol-2
      donde εcolorante es el coeficiente de extinción molar del colorante, C es la concentración de la proteína determinada en el paso 2.4.5, y E es la eficiencia de etiquetado. Repita el paso 2.4.2 hasta que el valor de eficiencia de etiquetado se haya estabilizado y sea inferior al 100%.

3. Determinar los valores de R 0

  1. Mida los valores de R0 in situ. Prepare dos muestras de proteínas a la misma concentración de proteína total, 4 μM, una con la proteína marcada solo con el colorante donante y otra con la proteína marcada solo con el colorante aceptor. Para SecA, una concentración de proteína de 4 μM de monómero SecA funciona bien para estas mediciones.
    1. Preparar volúmenes de muestra de 2,5 ml para una cubeta de 1 cm x 1 cm, 600 μL para una cubeta de 5 mm x 5 mm o 200 μL para una cubeta de 3 mm x 3 mm.
  2. Encienda el fluorómetro y abra el programa de adquisición y análisis espectral en el software de fluorescencia si utiliza un espectrofluorómetro. Haga clic en la M roja para conectar la computadora al instrumento (Figura 2A) y elija Espectros de emisión.
    1. Introduzca parámetros de exploración como la longitud de onda de excitación, el rango de exploración de emisión, la temperatura y la posición del cambiador de muestras mediante el elemento de menú Recopilar experimento (Figura 2B).
    2. Haga clic en RTC y optimice la configuración del instrumento (por ejemplo, ranuras espectrales) monitoreando la emisión de fluorescencia en el pico utilizando una longitud de onda de excitación establecida en el máximo de absorción del tinte. Para SecA, establezca la siguiente configuración: bandpass como 1 nm; hendiduras de excitación y emisión de 1 y 1,5 mm respectivamente, con la temperatura a 25 °C y la velocidad de agitación a 250 rpm.
      NOTA: No exceda la capacidad de conteo por segundo (cps) del instrumento (típicamente 2 x 106 cps).
  3. Coloque la muestra de proteína marcada por el donante en el soporte de la muestra y haga clic en Ejecutar para generar un escaneo de emisión de la proteína marcada solo con el colorante del donante (proteína solo del donante) excitando la muestra en el máximo de absorción del tinte (por ejemplo, 488 nm para AF488) y escaneando sobre el pico de emisión (505-750 nm para la proteína SecA solo del donante etiquetada con AF488).
  4. Establezca una línea de base para el análisis extendiendo el análisis 25-50 nm más allá del final del pico. Medir el rendimiento cuántico de la proteína solo donante, realizando mediciones de absorción y fluorescencia en muestras de diferentes concentraciones como se describe47. Mantenga la misma configuración de ranura para estas mediciones.
    1. Utilice el tinte de donante libre como referencia para el rendimiento cuántico. Obtener al menos cuatro mediciones de la proteína solo donante y el colorante libre a diferentes concentraciones para una determinación precisa.
    2. Trazar la intensidad de fluorescencia o el área integrada frente a la absorbancia de la proteína solo donante y el colorante o referencia libre. Determinar las pendientes para la proteína donante(PendienteD) y la referencia (PendienteR).
    3. El rendimiento cuántico (Φ) se calcula utilizando la siguiente ecuación:
      figure-protocol-3
      aquí ΦD es el rendimiento cuántico de la proteína donante solamente, ΦR es el rendimiento cuántico del colorante libre (esto generalmente se puede obtener del fabricante), SlopeD y SlopeR son las pendientes determinadas en el paso 3.4.2 para la proteína donante y referencia, respectivamente y ηD y ηR representan el índice de refracción de la proteína solo donante y las soluciones de colorante sin referencia, respectivamente 47.
  5. Obtenga un espectro de absorción de su proteína solo aceptora utilizando una célula de longitud de trayectoria de 1 cm. Genere un espectro de coeficiente de extinción de su proteína solo aceptora dividiendo el espectro de absorción por la concentración de colorante.
  6. Generar la integral de superposición espectral, J (λ) utilizando un programa de análisis gráfico. También se puede utilizar un programa de hoja de trabajo estándar (por ejemplo, hoja de cálculo) para este proceso.
    1. Multiplique el espectro de emisión de fluorescencia de la proteína solo donante (paso 3.4) por el espectro del coeficiente de extinción de la proteína solo aceptor para generar el espectro de superposición.
    2. Multiplique el espectro de superposición resultante por λ4.
    3. Determine el área bajo la curva mediante la integración de la región de superposición. La región de superposición se define como el área donde el espectro de emisión del donante multiplicado por el espectro del coeficiente de extinción del aceptor produce valores positivos. La integral de superposición espectral se define como:
      figure-protocol-4
      donde FD (λ) es el espectro de emisión de la proteína donante única (obtenida en la etapa 3.4) y εA(λ) es el espectro del coeficiente de extinción de la proteína aceptor única y tiene unidades de M-1 cm-1 (obtenidas en la etapa 3.5). La integral de superposición espectral resultante debe tener unidades de M-1 cm-1nm4.
    4. Normalizar la integral de superposición espectral. Divida la integral de superposición por el área integrada del espectro de proteínas del donante solo en el mismo rango espectral:
      figure-protocol-5
    5. Calcule el valor de R0 en Å utilizando la siguiente ecuación:
      figure-protocol-6
      donde κ2 es el factor de orientación, típicamente tomado como 2/3 para colorantes de rotación libre, η es el índice de refracción y puede aproximarse como 1.33 para soluciones acuosas diluidas, QD es el rendimiento cuántico del donante (paso 3.4) y J(λ) es la integral de superposición espectral según lo determinado en el paso 3.6.35. NOTA: Si los tintes no giran libremente, se pueden introducir correcciones como lo describe Ivanov 48 e implementarlas auclair49 y Zhang 2,3.

4. Realizar mediciones espectrales FRET

  1. Preparar muestras de proteína solo donante, proteína solo aceptor y proteína donante-aceptor a la misma concentración; se recomienda una concentración de 4 μM. Use 200 μL de solución, si usa una cubeta de 3 mm x 3 mm, 600 μL si usa una cubeta de 5 mm x 5 mm, o 2.5 mL si usa una cubeta de 1 cm x 1 cm.
    1. Prepare la muestra de proteína donante-aceptor utilizando cantidades molares iguales de la proteína donante solamente y solo aceptor.
    2. Mantener la misma cantidad de muestra marcada solo en muestras de proteínas del donante de control y solo del aceptor mediante la introducción de proteínas no etiquetadas en la misma cantidad molar a las muestras solo del donante o del aceptor solamente. Por ejemplo, para soluciones de la misma concentración, cada muestra FRET solo para donantes contendría 100 μL de proteína solo para donantes y 100 μL de proteína no etiquetada para un volumen de 200 μL.
  2. Generar espectros de emisión de fluorescencia de las muestras del donante solamente, del aceptor y del donante-aceptor. Optimice la señal como se describe en el paso 3.2. Una vez optimizado, mantenga la misma configuración para todas las muestras.
    1. Obtenga la exploración solo para donantes como se describe en el paso 3.3. Excite la solución en el máximo de absorción del colorante del donante y escanee sobre los picos de emisión del donante y del aceptor (esperado).
    2. Cambie la muestra a la proteína solo aceptora o cambie la posición del cambiador de muestra a la cubeta que contiene la proteína solo aceptor.
    3. Obtenga una exploración de emisión de la proteína marcada solo con colorante aceptor (proteína solo aceptor) utilizando la misma configuración que en el paso 4.2.1. Excitar la muestra en la longitud de onda de excitación del donante.
      NOTA: Este espectro proporciona una corrección para la cantidad de aceptor excitado en la longitud de onda del donante (FA en el paso 5.1.2)
    4. Cambie la muestra a la muestra de proteína donante-aceptor o cambie la posición del cambiador de muestra a la cubeta que contiene la proteína marcada donante-aceptor.
    5. Obtener una exploración de emisión de la muestra de proteína donante-aceptora utilizando los mismos ajustes que en los pasos 4.2.1 y 4.2.3.
    6. Para todos los espectros, corrija la fluorescencia de fondo restando los recuentos de fondo medidos al final de la exploración.
  3. Mida la vida útil del donante únicamente y las muestras del donante-aceptor preparadas como se describe en el paso 4.1.2. Utilice un instrumento de fluorescencia de conteo de fotón único correlacionado en el tiempo capaz de medir y resolver desintegraciones fluorescentes en el rango de tiempo de nanosegundos (10-9 s).
    NOTA: Para los pares de tintes FRET, haga coincidir la fuente de luz de excitación con el máximo de absorción del tinte donante.
    1. Encienda el instrumento. Abra el software de adquisición, use el software de control de instrumentos para la adquisición de datos con el espectrómetro de fluorescencia.
    2. Para la adquisición, seleccione TCSPC Decay, con un rango de tiempo de 55 ns, una ganancia de 1 y 4096 canales.
    3. Obtenga una función de respuesta del instrumento (IRF) utilizando una solución de crema no láctea o una solución de dispersión comercial y supervise la dispersión a 490 nm. Ajuste la configuración de la rendija y use filtros de densidad neutra según sea necesario para mantener una tasa de recuento lo suficientemente baja como para evitar la acumulación depulsos 5. Haga clic en Aceptar y, a continuación, en Iniciar. Esto iniciará la adquisición.
      NOTA: Se utiliza una tasa de recuento máxima de 4000 cps para una tasa de repetición de 180 kHz.
    4. Recoja el IRF a 490 nm hasta que el canal pico tenga un máximo de 20.000 recuentos. Recolecte un IRF antes y después de medir cada decaimiento de fluorescencia.
    5. Obtener las desintegraciones de fluorescencia del donante solamente y las muestras donante-aceptor mediante el monitoreo de la emisión de fluorescencia en la longitud de onda de emisión del donante, 520 nm.
    6. Ajuste la configuración de la ranura para una tasa de recuento máxima de 4000 cps o menos. Los ajustes de ranura suelen ser de 15-20 nm de paso de banda para muestras de proteínas. Recoge la descomposición hasta obtener 20.000 recuentos en el canal pico.
  4. Analizar la desintegración o la intensidad de fluorescencia (I) en función del tiempo (t) para la vida útil de la fluorescencia (τ). Ajuste la decadencia a una suma de exponenciales con la siguiente ecuación:
    figure-protocol-7
    donde αI es el factor preexponencial del componente iésimo y τI es la vida útil. El ajuste se vuelve a involucrar con el IRF para que coincida con la desintegración de la fluorescencia. Juzgue la calidad del ajuste a partir de los parámetros reducidosde Χ 2 .

5. Análisis de los datos de FRET

  1. Calcule la eficiencia de FRET a partir de la disminución de la intensidad del donante de la muestra donante-aceptor en relación con el donante solo con la siguiente ecuación.
    figure-protocol-8
    donde FDA es la intensidad de fluorescencia de la muestra donante-aceptor y FD es la intensidad de fluorescencia de la muestra del donante únicamente en el pico de la fluorescencia del donante. Utilice las áreas integradas de los picos si los datos son ruidosos.
    1. Corrija cualquier diferencia en el etiquetado entre las muestras del donante y las del donante-aceptor. Calcule las correcciones en función del grado de etiquetado del donante de la siguiente manera.
      figure-protocol-9
      donde fDA es la eficiencia de etiquetado del donante en la muestra donante-aceptor y fD es la eficiencia del etiquetado en la muestra solo del donante.
    2. Corregir cualquier contribución de la fluorescencia del aceptor al espectro excitado por el donante mediante la sustracción del espectro de proteínas solo aceptor (paso 4.2) del espectro de proteína donante-aceptor.
      figure-protocol-10
    3. Corregir las diferencias en la eficiencia de etiquetado de la proteína aceptora única en relación con la muestra de proteína donante-aceptor produciendo la siguiente ecuación para calcular la eficiencia:
      figure-protocol-11
      donde fA denota la cantidad fraccional de etiquetado del aceptor. Esta ecuación incluye todas las correcciones debidas al etiquetado del tinte y la fluorescencia del aceptor.
    4. Calcule las distancias FRET a partir de las eficiencias utilizando la siguiente ecuación:
      figure-protocol-12
      utilizando el valor R0 obtenido en el paso 3.6.5.
    5. Calcule la eficiencia de FRET utilizando la vida útil de fluorescencia del donante solo y las muestras de donante-aceptor medidas en los pasos 4.3.3-4.3.5:
      figure-protocol-13
    6. Utilice la vida útil ponderada por amplitud para calcular las eficiencias fret y compararlas con los resultados en estadoestacionario 5.
      figure-protocol-14
    7. Calcule la distancia como en el paso 5.1.4 a partir de las eficiencias determinadas por la vida útil de la fluorescencia. Compare los valores de estado estacionario y resueltos en el tiempo para las eficiencias y distancias de FRET y asegúrese de que estén dentro del error entre sí.

6. Mapeo de las distancias

  1. Utilice las distancias calculadas para asignar el sitio de enlace en la estructura tridimensional. Calcule las distancias y errores para todos los pares de tintes y ubicaciones examinados utilizando la ecuación dada en los valores del paso 5.1.4 y R0 obtenidos en el paso 3.6.5 para cada par FRET.
    1. Utilice un programa de visualización gráfica en 3D como PyMOL50 para mapear las distancias en la estructura (script dado en Archivo suplementario). Los comandos del script se pueden ingresar directamente en la ventana de comandos con la información de distancia adecuada.
    2. Genere un shell para cada distancia medida y el error asociado (Figura 3, Figura 4, Figuras suplementarias 1-3).
    3. Mapee la posición a través de la intersección de las diferentes conchas (Figuras suplementarias 1-3). El sitio de unión al péptido de señal se mapeó a través de las tres ubicaciones diferentes en SecA y SecYEG y cuatro ubicaciones diferentes en el péptido de señal (Figura 1).

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Resultados

Este estudio se centró en determinar la ubicación del sitio de unión a la preproteína en SecA antes de la inserción de la preproteína en el canal SecYEG. Para mapear el sitio de unión, se realizaron experimentos FRET entre diferentes regiones de la preproteína y tres ubicaciones distintas en las proteínas SecA y SecYEG (Figura 1A-D). A partir de las distancias obtenidas y las estructuras tridimensionales de SecA, SecYEG y la preproteína, se predijo la ubicac...

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Discusión

Mediante el uso de la metodología de mapeo FRET, identificamos el sitio de unión a la secuencia de señales en la proteína SecA. Es importante destacar que la presencia de una estructura cristalina 3D del complejo facilitó enormemente nuestro estudio. La fortaleza de esta metodología de mapeo radica en la capacidad de utilizar una estructura existente para identificar ubicaciones para el etiquetado. Esta metodología no se puede utilizar para determinar una estructura 3D; sin embargo, la determinación de elementos estructu...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la subvención R15GM135904 de los Institutos Nacionales de Salud (otorgada a IM) y la Subvención GM110552 de los Institutos Nacionales de Salud (otorgada a DBO).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Láser LED de 490 nmHoriba1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimida//DIBO AlkyneLife TechnologiesA20347
AgarDifcoDF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimida/DIBO AlkyneLife TechnologiesA10254
Alexa Fluor 488 DIBO AlkyneLife TechnologiesS10904
Alexa Fluor 647 DIBO AlkyneLife TechnologiesS10906
Amicon Ultra­ 4 Filtro centrífugo (50kDa MWCO)SigmaUFC805008
Dodecilmaltósido (DDM)AnatraceD310
E. coli péptido señal de fosfatasa alcalina SP22Biomolecules Midwest N/ASintetizado artículo personalizado
péptido señal extendido SP41Biomolecules Midwest N/AArtículo personalizado sintetizado
FluorEssenceProgramaHoriba versión 2.4para el espectrofluorómetro Fluoromax4
EspectrofluorómetroHoriba 4 HoribaN/A
GlobalsWELaboratorio de Dinámica de Fluorescencia, Universidad de California, IrvinePrograma de análisis espectral para desintegraciones resueltas en el tiempo
H­ 4 y tímido; Azido&tímido; Phe­ OHBACHEM4020250.0001
LB (Miller) CaldoFisher ScientificBP9723
Ludox HS-40 sílice coloidal (40 % en peso de suspensión en H2O)420816Sigma-Aldrichpara hacer una solución de dispersión adecuada
PTI Felix GXHoribaversión 4.1.0.4096Programa de adquisición espectral para el instrumento PTI Time Master
PTI Time Master InstrumentoHoribaNA
Pymol Molecular Graphics ProgramSchrödingerversión 2.4
Baño de aguaThermo ScientificNESLAB RTE 10
de adquisición espectral Se necesita una dilución de

Referencias

  1. Thompson, M. C., Yeates, T. O., Rodriguez, J. A. Advances in methods for atomic resolution macromolecular structure determination. F1000Research. 9, (2020).
  2. Zhang, Q., Li, Y., Olson, R., Mukerji, I., Oliver, D. Conserved SecA signal peptide-binding site revealed by engineered protein chimeras and Forester resonance energy transfer. Biochemistry. 55 (9), 1291-1300 (2016).
  3. Zhang, Q., et al. Alignment of the protein substrate hairpin along the SecA two-helix finger primes protein transport in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9343-9348 (2017).
  4. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
  5. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. Boston, MA. (2006).
  6. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  7. Magde, D., Wong, R., Seybold, P. G. Fluorescence quantum yields and their relation to lifetimes of rhodamine 6G and fluorescein in nine solvents: improved absolute standards for quantum yields. Photochemistry and Photobiology. 75 (4), 327-334 (2002).
  8. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods in Enzymology. 211, 353-388 (1992).
  9. Scientific, T. F. R0 Values from Some Alexa Fluor Dyes - Table 1.6. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/tables/r0-values-for-some-alexa-fluor-dyes.html (2021).
  10. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors. 16 (9), Basel, Switzerland. 1488(2016).
  11. Day, R. N., Davidson, M. W. Fluorescent proteins for FRET microscopy: monitoring protein interactions in living cells. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular, and Developmental Biology. 34 (5), 341-350 (2012).
  12. Lee, S. J., Syed, S., Ha, T. Single-Molecule FRET Analysis of Replicative Helicases. Methods in Molecular Biology. 1805, Clifton, N.J. 233-250 (2018).
  13. Uhm, H., Hohng, S. Single-Molecule FRET Assay for Studying Cotranscriptional RNA Folding. Methods in Molecular Biology. 2106, 271-282 (2020).
  14. Globyte, V., Joo, C. Single-molecule FRET studies of Cas9 endonuclease. Methods in Enzymology. 616, 313-335 (2019).
  15. Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. Single-Molecular Förster Resonance Energy Transfer Measurement on Structures and Interactions of Biomolecules. Micromachines. 12 (5), 492(2021).
  16. Catipovic, M. A., Bauer, B. W., Loparo, J. J., Rapoport, T. A. Protein translocation by the SecA ATPase occurs by a power-stroke mechanism. The EMBO Journal. 38 (9), 101140(2019).
  17. Seinen, A. B., Spakman, D., van Oijen, A. M., Driessen, A. J. M. Cellular dynamics of the SecA ATPase at the single molecule level. Scientific Reports. 11 (1), 1433(2021).
  18. Dimura, M., et al. Quantitative FRET studies and integrative modeling unravel the structure and dynamics of biomolecular systems. Current Opinion in Structural Biology. 40, 163-185 (2016).
  19. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nature Methods. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  20. Paetzel, M. Structure and mechanism of Escherichia coli type I signal peptidase. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (8), 1497-1508 (2014).
  21. Ng, D., Brown, J., Walter, P. Signal sequences specify the targeting route to the endoplasmic reticulum membrane. The Journal of Cell Biology. 134 (2), 269-278 (1996).
  22. Huber, D., et al. SecA Cotranslationally Interacts with Nascent Substrate Proteins In Vivo. Journal of Bacteriology. 199 (2), 00622(2017).
  23. Lill, R., et al. SecA protein hydrolyzes ATP and is an essential component of the protein translocation ATPase of Escherichia coli. The EMBO Journal. 8 (3), 961-966 (1989).
  24. Lill, R., Dowhan, W., Wickner, W. The ATPase activity of SecA is regulated by acidic phospholipids, SecY, and the leader and mature domains of precursor proteins. Cell. 60 (2), 271-280 (1990).
  25. Kimura, E., Akita, M., Matsuyama, S., Mizushima, S. Determination of a region of SecA that interacts with presecretory proteins in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6600-6606 (1991).
  26. Hunt, J. F., et al. Nucleotide control of interdomain interactions in the conformational reaction cycle of SecA. Science. 297 (5589), New York, N.Y. 2018-2026 (2002).
  27. Sharma, V., et al. Crystal structure of Mycobacterium tuberculosis SecA, a preprotein tranlsocating ATPase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2243-2248 (2003).
  28. Vassylyev, D., et al. Crystal structure of the translocation ATPase SecA from Thermus thermophilus reveals a parallel, head-to-head dimer. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 248-258 (2006).
  29. Zimmer, J., Li, W., Rapoport, T. A. A novel dimer interface and conformational changes revealed by an X-ray structure of B. subtilis SecA. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 259-265 (2006).
  30. Zimmer, J., Rapoport, T. A. Conformational flexibility and peptide interaction of the translocation ATPase SecA. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 606-612 (2009).
  31. Bauer, B. W., Rapoport, T. A. Mapping polypeptide interactions of the SecA ATPase during translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (49), 20800-20805 (2009).
  32. Auclair, S., et al. Mapping of the signal peptide-binding domain of Escherichia coli SecA using Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 49 (4), 782-792 (2010).
  33. Zimmer, J., Nam, Y., Rapoport, T. A. Structure of a complex of the ATPase SecA and the protein-translocation channel. Nature. 455 (7215), 936-943 (2008).
  34. Li, L., et al. Crystal structure of a substrate-engaged SecY protein-translocation channel. Nature. 531 (7594), 395-399 (2016).
  35. Ma, C., et al. Structure of the substrate-engaged SecA-SecY protein translocation machine. Nature Communications. 10 (1), 2872(2019).
  36. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  37. Jilaveanu, L. B., Oliver, D. In vivo membrane topology of Escherichia coli SecA ATPase reveals extensive periplasmic exposure of multiple functionally important domains clustering on one face of SecA. The Journal of Biological Chemistry. 282 (7), 4661-4668 (2007).
  38. Ramamurthy, V., Oliver, D. Topology of the integral-membrane form of Escherichiacoli SecA protein. The Journal of Biological Chemistry. 272 (37), 23239-23246 (1997).
  39. Chin, J., et al. Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  40. Deiters, A., et al. Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae. Journal of the American Chemical Society. 125 (39), 11782-11783 (2003).
  41. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Analytical Biochemistry. 100 (1), 95-97 (1979).
  42. Mitchell, C., Oliver, D. B. Two distinct ATP-binding domains are needed to promote protein export by Escherichia coli SecA ATPase. Molecular Microbiology. 10 (3), 483-497 (1993).
  43. Thiol-reactive Probe Labeling Protocol. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/thiol-reactive-probe-labeling-protocol.html (2021).
  44. Click Chemistry - Section 3.1. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/reagents-for-modifying-groups-other-than-thiols-or-amines/click-chemistry.html (2021).
  45. Correction Factor. AAT Bioquest. , Available from: https://www.aatbio.com/resources/correction-factor/ (2019).
  46. Calculate dye:protein (F/P) molar ratios. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://tools.thermofischer.com/content/sfs/brochures/TR0031-Calc-FP-rations.pdf (2011).
  47. A Guide to Recording Fluorescence Quantum Yields. Horiba Scientific. , Available from: https://static.horiba.com/fileadmin/Horiba/Application/Materials/Material_Research/Quantum_Dots/quantumyieldstrad.pdf (2011).
  48. Ivanov, V., Li, M., Mizuuchi, K. Impact of emission anisotropy on fluorescence stectroscopy and FRET distance measurements. Biophysical Journal. 97 (3), 922-929 (2009).
  49. Auclair, S., Oliver, D., Mukerji, I. Defining the solution state dimer structure of Escherichia coli SecA using Forster resonance energy transfer. Biochemistry. 52 (14), 2388-2401 (2013).
  50. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.4. , Schrodinger, LLC. New York. Available from: https://pymol.org/2/ (2021).
  51. Musial-Siwek, M., Rusch, S. L., Kendall, D. A. Selective photoaffinity labeling identifies the signal peptide binding domain on SecA. Journal of Molecular Biology. 365 (3), 637-648 (2007).
  52. Miller, A., Wang, L., Kendall, D. A. Synthetic signal peptides specifically recognize SecA and stimulate ATPase activity in the absence of preprotein. The Journal of Biological Chemistry. 273 (19), 11409-11412 (1998).
  53. Gelis, I., et al. Structural basis for signal-sequence recognition by the translocase motor SecA as determined by NMR. Cell. 131 (4), 756-769 (2007).
  54. Erlandson, K. J., et al. A role for the two-helix finger of the SecA ATPase in protein translocation. Nature. 455 (7215), 984-988 (2008).
  55. Das, S., Oliver, D. Mapping of the SecA-SecY and SecA-SecG interfaces by site-directed in vivo photocross-linking. The Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12371-12380 (2011).
  56. Wheatley, E. G., Pieniazek, S. N., Vitoc, I., Mukerji, I., Beveridge, D. L. Molecular Dynamics Structure Prediction of a Novel Protein-DNA Complex: Two HU Proteins with a DNA Four-way Junction. Innovations in Biomolecular Modeling and Simulations: Volume 2. , The Royal Society of Chemistry. 111-128 (2012).
  57. Vitoc, C. I., Mukerji, I. HU binding to a DNA four-way junction probed by Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 50 (9), 1432-1441 (2011).
  58. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).

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