La transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) es un método establecido basado en la fluorescencia utilizado para medir con éxito las distancias en y entre las biomoléculas in vitro, así como dentro de las células. En FRET, la eficiencia de la transferencia de energía, medida por los cambios en la intensidad de la fluorescencia o la vida útil, se relaciona con la distancia entre dos moléculas fluorescentes o etiquetas. La determinación de la dinámica y los cambios conformacionales a partir de las distancias son solo algunos ejemplos de las aplicaciones de este método a los sistemas biológicos. Bajo ciertas condiciones, esta metodología puede agregar y mejorar las estructuras cristalinas de rayos X existentes al proporcionar información sobre la dinámica, la flexibilidad y la adaptación a las superficies de unión. Describimos el uso de FRET y las determinaciones de distancia asociadas para dilucidar las propiedades estructurales, a través de la identificación de un sitio de unión o las orientaciones de las subunidades de dímeros. A través de la elección juiciosa de los sitios de etiquetado y, a menudo, el empleo de múltiples estrategias de etiquetado, hemos aplicado con éxito estos métodos de mapeo para determinar las propiedades estructurales globales en un complejo proteína-ADN y el sistema de translocación de proteínas SecA-SecYEG. En el sistema SecA-SecYEG, hemos utilizado métodos de mapeo FRET para identificar el sitio de unión a preproteínas y determinar la conformación local de la región de secuencia de señales unidas. Este estudio describe los pasos para realizar estudios de mapeo FRET, incluida la identificación de sitios de etiquetado apropiados, la discusión de posibles etiquetas, incluidos los residuos de aminoácidos no nativos, los procedimientos de etiquetado, cómo realizar mediciones e interpretar los datos.