F&#246;rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features

Jack Northrop; Donald B. Oliver; Ishita Mukerji

doi:10.3791/63433

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Artículo de método

Förster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features

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DOI:

10.3791/63433

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16 de marzo de 2022

Jack Northrop¹ , Donald B. Oliver¹^,² , Ishita Mukerji¹^,²

¹Molecular Biology and Biochemistry Department, Wesleyan University, ²Molecular Biophysics Program, Wesleyan University

En este artículo

Resumen

El estudio detalla la metodología del mapeo FRET, incluida la selección de sitios de etiquetado, la elección de tintes, la adquisición y el análisis de datos. Esta metodología es efectiva para determinar los sitios de unión, los cambios conformacionales y los movimientos dinámicos en los sistemas de proteínas y es más útil si se realiza junto con la información estructural 3D existente.

Resumen

La transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) es un método establecido basado en la fluorescencia utilizado para medir con éxito las distancias en y entre las biomoléculas in vitro, así como dentro de las células. En FRET, la eficiencia de la transferencia de energía, medida por los cambios en la intensidad de la fluorescencia o la vida útil, se relaciona con la distancia entre dos moléculas fluorescentes o etiquetas. La determinación de la dinámica y los cambios conformacionales a partir de las distancias son solo algunos ejemplos de las aplicaciones de este método a los sistemas biológicos. Bajo ciertas condiciones, esta metodología puede agregar y mejorar las estructuras cristalinas de rayos X existentes al proporcionar información sobre la dinámica, la flexibilidad y la adaptación a las superficies de unión. Describimos el uso de FRET y las determinaciones de distancia asociadas para dilucidar las propiedades estructurales, a través de la identificación de un sitio de unión o las orientaciones de las subunidades de dímeros. A través de la elección juiciosa de los sitios de etiquetado y, a menudo, el empleo de múltiples estrategias de etiquetado, hemos aplicado con éxito estos métodos de mapeo para determinar las propiedades estructurales globales en un complejo proteína-ADN y el sistema de translocación de proteínas SecA-SecYEG. En el sistema SecA-SecYEG, hemos utilizado métodos de mapeo FRET para identificar el sitio de unión a preproteínas y determinar la conformación local de la región de secuencia de señales unidas. Este estudio describe los pasos para realizar estudios de mapeo FRET, incluida la identificación de sitios de etiquetado apropiados, la discusión de posibles etiquetas, incluidos los residuos de aminoácidos no nativos, los procedimientos de etiquetado, cómo realizar mediciones e interpretar los datos.

Introducción

Para las proteínas, la elucidación de la dinámica junto con el conocimiento estructural tridimensional (3-D) conduce a una mejor comprensión de las relaciones estructura-función de los sistemas biomoleculares. Los métodos estructurales, como la cristalografía de rayos X y la microscopía electrónica criogénica, capturan una estructura estática y, a menudo, requieren la determinación de múltiples estructuras para dilucidar aspectos de la unión y dinámica de biomoléculas¹. En este artículo se describe un método basado en soluciones para mapear elementos estructurales globales, como sitios de enlace o interacciones de enlace, que son potencialmente....