Óptica no lineal sin etiquetas para el estudio de defectos dependientes de tubulina en mielina central

La obtención de imágenes ópticas de estructuras citoesqueléticas en tejidos y preparaciones de órganos no es una tarea fácil. Los filamentos citoesqueléticos son ubicuos, por lo que si se realiza una tinción genérica, por ejemplo, contra alfa-tubulina o beta-actina o potencialmente queratina en una muestra epitelial, la señal probablemente se distribuirá de manera bastante homogénea en toda la muestra. Para restringir la tinción a un subconjunto más significativo de componentes celulares, se pueden usar ratones transgénicos con expresión dirigida¹ o planear usar anticuerpos específicos de isoforma. Si bien muy pocos de estos últimos están en el mercado (y muy pocos existen en absoluto ^2,3,4), un modelo animal transgénico podría estar disponible. Sin embargo, debe ser adquirido por el laboratorio y alojado adecuadamente, con todos los gastos involucrados en el proceso. Ciertos anticuerpos o productos químicos, por ejemplo, fármacos conjugados con fluoróforos como la faloidina o el paclitaxel, pueden ser parcial o totalmente incompatibles con el uso en células o tejidos vivos, lo que limita su aplicabilidad solo a estudios de muestras fijas.

En el caso de la tubulina, se debe tener en cuenta un aspecto adicional, que es la sensibilidad del polímero a la fijación. La fijación química convencional con formaldehído es conocida por no ser adecuada para preservar de manera óptima la integridad de los microtúbulos⁵. Además, un informe reciente confirma que la reticulación de formaldehído induce cambios sutiles en la ultraestructura del microtúbulo, similar a lo que sucede con la unión de algunos fármacos o moléculas fisiológicas como GTP⁶.

La visualización directa de microtúbulos en muestras no teñidas y no fijadas es, por lo tanto, a menudo deseable. Para lograr esto, una solución técnica es la microscopía⁷ de segunda generación armónica (SHG), que se basa en la capacidad de los haces de microtúbulos paralelos para actuar como armonóforos y emitir luz duplicada en frecuencia cuando se iluminan adecuadamente con un láser infrarrojo intenso y pulsado. Aunque se puede generar una segunda señal armónica más fuerte y estable a partir del colágeno y la miosina, que son los únicos otros dos materiales biológicos conocidos por ser capaces de duplicar la frecuencia, la señal de la tubulina se ha utilizado hasta ahora principalmente para estudiar los reordenamientos del huso mitótico ^8,9,10 y la morfología de los microtúbulos axonales^11,12,13.

En este trabajo, presentamos un uso novedoso de la microscopía SHG como herramienta de diagnóstico para distinguir los tejidos del sistema nervioso central (SNC) afectados por la tubulinopatía por tubulina beta 4 A (TUBB4A) de sus contrapartes sanas¹⁴. Algunas de las mutaciones que ocurren en esta isoforma predominantemente neural de tubulina, como las que causan hipomielinización y atrofia de los ganglios basales y cerebelo (H-ABC), inducen el sobrellenado de microtúbulos en los oligodendrocitos^15,16; Las alteraciones citoesqueléticas, a su vez, están asociadas con efectos posteriores como la desmielinización, con un profundo deterioro de las vías motoras y sensoriales^16,17,18,19. El modelo murino taiep utilizado en este trabajo muestra un contenido anormal de microtúbulos en los oligodendrocitos y recapitula la mayoría de los síntomas sensorio-motores de los pacientes con H-ABC¹⁷. El protocolo explica cómo visualizar estructuras como el cuerpo calloso y el cerebelo, que generalmente están altamente mielinizadas y que se ven gravemente afectadas en pacientes humanos, así como en la rata taiep ¹⁹, para resaltar las diferencias en las señales de SH entre tejidos sanos y mutantes.

Todos los procedimientos descritos se realizaron en cumplimiento con las leyes y códigos aprobados en el título séptimo del Reglamento de la Ley General de Salud en Investigación en Salud del Gobierno de México (NOM-062-ZOO-1999) y de acuerdo con las recomendaciones de la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Experimentación y fueron aprobados por el comité institucional de bioética en investigación de la Universidad de Guanajuato y la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla.

1. Ajustes del microscopio

1. Encienda el sistema de microscopía.
2. Encienda el láser pulsado para garantizar que estará listo para lase a un nivel de potencia óptimo y constante después de la extracción y preparación de la muestra.
3. Sintoniza el láser a 810 nm. Para estudiar los microtúbulos tisulares se utiliza el 10%-20% de la potencia láser disponible, que, en el sistema descrito, corresponde a 13-26 mW medidos en el plano focal posterior del objetivo.
4. Asegúrese de que el microscopio esté alineado con Köhler (Archivo suplementario 1), con el objetivo que se utilizará para la obtención de imágenes de SHG.
   NOTA: Esto es importante ya que, en la configuración comercial utilizada en este trabajo, la detección se realiza en modo de transmisión y a través del condensador.
5. Elimine los filtros no deseados de la ruta de detección óptica (Figura 1A).
6. Asegúrese de que el diafragma del condensador esté completamente abierto para garantizar que no se detenga innecesariamente la luz a este nivel.
7. Prepare un objetivo de inmersión en aceite de apertura numérica (NA) de 25x/0,8 con una pequeña gota de aceite de inmersión en el objetivo.
   NOTA: Este objetivo se utilizó para que coincida mejor con el condensador NA, que era 0.55 (idealmente, NA_cond≥ NA_obj).

2. Controles preliminares del microscopio

NOTA: Realice los controles preliminares del microscopio una vez, a menos que se modifique la configuración.

1. Imagen de almidón de maíz seco intercalado entre portaobjetos de vidrio con parámetros SHG para generar imágenes de SHG que revelan la dirección de polarización del láser. Siga los pasos indicados en el Archivo complementario 2, excepto la potencia del láser, que es inferior al 5% para el almidón de maíz.
2. Tome una imagen de granos de almidón de maíz dispersos y marque la orientación de los lóbulos SHG en el plano x-y. Esta orientación corresponde a la orientación del láser (Figura 2A).
3. Como control, tome otra imagen de la misma muestra, insertando en la trayectoria óptica una placa de media onda (posición mostrada en la Figura 1A) para alterar la dirección de oscilación del láser. La imagen resultante muestra lóbulos de señal SHG girados (Figura 2B, C).
4. Si utiliza un tipo diferente de filtro de paso de banda para el SHG, asegúrese de que tenga propiedades de transmisión óptimas comparando las imágenes (Figura 2D, E) y las intensidades de señal píxel por píxel a lo largo de un escaneo de línea (Figura 2F).

3. Extracción de tejidos

NOTA: Utilice siempre herramientas limpias para realizar los procedimientos quirúrgicos.

1. Use ratas taiep de 6 a 12 meses de edad y controles Sprague-Dawley (WT) de la misma edad.
2. Anestesiar a los animales con una inyección i.p. de una mezcla de ketamina-xilazina (0,125 mg/Kg y 5 mg/Kg) diluida en una solución estéril de NaCl al 0,9%.
   1. Verifique los reflejos del dolor y proceda solo si están ausentes.
3. Sacrificar el animal a través de la decapitación.
4. Una vez que la cabeza esté aislada, abra los huesos de la bóveda craneal cuidadosamente a lo largo de la línea media, comenzando desde el punto más caudal en la parte superior hacia la nariz, desde las cavidades orbitales hacia la línea media, y luego desde el punto más caudal hasta debajo del cerebro y el cerebelo.
   NOTA: Los cortadores de huesos y Rongeurs permiten la eliminación adecuada de los huesos de la cabeza sin dañar las estructuras cerebrales.
5. Liberar el cerebro y el cerebelo del hueso. Los dos hemisferios podrían separarse. Si los hemisferios están divididos, use una mitad para las imágenes de SHG y fije la otra mitad en paraformaldehído al 3,7% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 20 minutos dentro de una campana química para su posterior seccionamiento y tinción.

4. Sección de vibratoré

1. Prepare una bandeja tampón de vibratomo llena de solución salina equilibrada (HBSS) tibia (37 °C) de Hank's.
2. Fije el cerebro a la placa de la muestra usando pegamento de cianoacrilato a través de un trozo de cinta adhesiva. La porción / región más caudal entra en contacto con el pegamento para que se puedan cortar las secciones coronales utilizables de la porción rostral opuesta.
   1. Permita ~10 s para que el pegamento polimerice para obtener una unión efectiva de la muestra.
      NOTA: Los mejores resultados se obtienen cuando el cerebro está orientado de manera que la cuchilla corta "de arriba a abajo" en lugar de "de lado a lado" (Figura 1B).
3. Transfiera la placa de la muestra a su soporte magnético dentro de la bandeja intermedia.
4. Comience a cortar secciones de 300-500 μm hasta que las rebanadas producidas abarquen toda la superficie del cerebro.
5. En este punto, reduzca el grosor de la sección a 160 μm.
6. Una vez cortada una sección completa de 160 μm a nivel del cuerpo calloso, recuperarla con una pipeta Pasteur de vidrio modificada con un orificio grande y flameado (Figura 1C).
7. Transfiéralo a una placa de Petri limpia con HBSS nuevo y caliente o directamente sobre el soporte de vidrio para microscopía (cubreobjetos o plato con fondo de vidrio).
   NOTA: Para las condiciones experimentales descritas, agregar un cubreobjetos sobre la muestra es perjudicial para la imagen.

5. Transferencia al microscopio

1. Si el microscopio está en una habitación diferente, prepare una caja aislada con paquetes de gel calentados para transferir las secciones de tejido mientras mantiene la temperatura. La caja también sirve para mantener las secciones calientes hasta que se visualizen.
2. Coloque la muestra bajo el microscopio y asegúrese de que esté colocada correctamente debajo del objetivo mediante la observación directa a través de los oculares con luz transmitida.
   NOTA: El objetivo es alinear las estructuras emisoras previstas con la dirección de oscilación del láser para maximizar la señal SHG emitida (y, por lo tanto, detectada).
3. Retire el exceso de HBSS para que una película líquida delgada cubra toda la muestra. Revise visualmente la película líquida cada pocos minutos para evitar la evaporación excesiva y el secado de la muestra.
   NOTA: En las condiciones descritas, una sección se utiliza durante no más de 20 minutos. El secado de la muestra provoca efectos artificóficos drásticos (Figura complementaria 1A). En lugar de agregar más HBSS, se recomienda el remojo periódico de la sección en un medio cálido y fresco si se necesitan tiempos de imagen más largos. También se recomienda el uso de cámaras de perfusión y pegamento o agarosa de bajo punto de fusión para inmovilizar el tejido cuando se van a realizar experimentos más largos.
4. Prepare la etapa del microscopio para imágenes no escaneadas, lo que podría incluir cerrar todas las puertas de la cámara de incubación oscura o cubrir la cámara de incubación con una tela recubierta de poliuretano de nylon negro.

6. Imágenes

1. Seleccione el modo de imagen "no descanado" a lo largo de la ruta de transmisión. De esta manera, se optimizará la captura de la débil señal SH de tubulina.
2. Seleccione el objetivo LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA.
3. Establezca una potencia láser entre 13 mW y 26 mW, con un tiempo de permanencia de píxeles de 12,6 μs. Tome imágenes de no más de 512 píxeles x 512 píxeles, con una velocidad de 5 y un promedio de 2, para un tiempo de adquisición promedio de aproximadamente 15 s.
   NOTA: El uso de potencias láser más altas y/o tiempos de permanencia más largos puede dañar la muestra (Figura suplementaria 1B).
4. Tome imágenes primero con un filtro de paso corto de 485 nm (SP485) y, en un segundo paso, agregue un filtro de paso de banda nítido de 405 nm (BP405; Figura 3). Siga los pasos indicados en el Archivo complementario 2.
   NOTA: Las imágenes de campo de gran riesgo se pueden tomar a través del mismo detector utilizando la luz láser residual de una línea visible (los láseres de 405 nm o 488 nm funcionan mejor).

7. Procesamiento del cerebelo

1. Primero, corte el cerebelo con un bisturí en dos hemisferios y luego péguelos al soporte del vibratomo por la porción media (la parte plana obtenida después del corte).
2. Sección e imagen del cerebelo de la misma manera que se describió para el cerebro (secciones de 160 μm, mismos ajustes de vibratomo, misma cuchilla, mismos ajustes de microscopio, etc.).
   NOTA: Debido a la anatomía del cerebelo, su orientación en el momento de la sección no es crítica; En la mayoría de las rodajas generadas lejos de la superficie, habrá folia seccionada bien en la sustancia blanca.

Las imágenes obtenidas con esta metodología tienen un nivel de fondo intrínsecamente bajo debido al número muy limitado de armonóforos presentes en los tejidos biológicos, que es una de las ventajas significativas del método.

Cuando se obtienen imágenes de las fibras del cuerpo calloso, se pueden encontrar consistentemente estructuras cortas similares a fibras y elementos redondeados en el cerebro taiep (Figura 3B), mientras que el cuerpo calloso del cerebro control muestra una señal mucho más heterogénea e isotrópica en toda la región del cerebro (Figura 3A). El origen de la señal diferencial se encuentra específicamente en el fenómeno de segunda generación armónica, ya que agregar el filtro de paso de banda estrecho solo disminuye la intensidad de la señal no específica de las imágenes de control (Figura 3C-D) mientras elimina selectivamente esta señal baja y difusa de alrededor del soma y las estructuras cortas y alargadas en las imágenes taiep, que siempre generan luz SH intensa (Figura 3E-F).

La otra estructura analizada, la sustancia blanca cerebelosa, da resultados comparables. Específicamente, mientras que en el tejido control hay una ausencia casi completa de señal SH (Figura 4B), y las células de Purkinje son apenas visibles cuando se usa el filtro de paso corto, las estructuras alargadas y redondeadas persisten en la imagen SH del tejido taiep (Figura 4D).

Figura 1: Microscopio y seccionamiento . (A) Esquema del microscopio utilizado, con los componentes relevantes resaltados. Flechas: 1 = puerto NDD donde se encuentra el SP485 cerca del detector; 2 = marcos extraíbles donde se coloca el BP405; 3 = posición debajo del objetivo donde se coloca la placa de media onda (HWP) para experimentos de control. El recuadro muestra el marco donde se podría insertar el HWP. (B) Vista superior de la bandeja amortiguadora de vibratomo con el cerebro pegado listo para ser seccionado con precisión. (C) La pipeta Pasteur original (superior) y modificada (abajo) utilizada para transferir las secciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Controles preliminares. (A) La señal SHG emitida por los granos de almidón de maíz muestra una orientación predominante que coincide con la dirección de oscilación del láser (horizontal en este caso). (B) Después de insertar una placa de media onda con su eje rápido orientado a 45° con respecto a la horizontal, la señal se gira 90°. (C) Fusión de la señal antes y después de la inserción de la placa de media onda. (D) La señal por debajo de 485 nm emitida por los granos de almidón de maíz. (E) La señal SHG de los granos de almidón detectados a 405/10 nm. (F) Gráfico que muestra una comparación de las dos señales correspondientes a los escaneos lineales mostrados en las inserciones ampliadas de D y E. El filtro SHG utilizado causa una pérdida de señal insignificante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Imágenes SHG de taiep y WT corpus calloso. Ejemplos representativos de (A) WT y (B) señales taiep obtenidas del cuerpo calloso. (C) Imagen filtrada SP485 de un cuerpo calloso WT. (D) Imagen filtrada BP405 de la misma muestra que en C. (E) SP485 imagen filtrada de un cuerpo calloso taiep . (F) Imagen filtrada BP405 de la misma muestra que en E. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Imágenes SHG de cerebelos taiep y WT. Ejemplos representativos de señales (A-B) WT y (C-D) taiep obtenidas de folios cerebelosos. (A) Una imagen filtrada SP485 de un folio WT; sólo algunas células de Purkinje son visibles. (B) Una imagen filtrada BP405 de la misma muestra que en A. (C) Una imagen filtrada SP485 de un folio taiep. (D) Una imagen filtrada BP405 de la misma muestra que en C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Ejemplos de artefactos. (A) Artefacto debido al secado de la muestra. (B) Artefacto debido a una exposición excesiva. Barras de escala: 30 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 1: Alineación de Köhler. El archivo presenta los pasos para realizar la alineación de Köhler. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Pasos del software ZEN para la adquisición de imágenes SHG. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.