La espectrometría de movilidad iónica (SGI) es un complemento interesante de la espectrometría de masas para la caracterización de biomoléculas, en particular porque es sensible al isomerismo. Este protocolo describe un experimento en tándem IMS (IMS/IMS), que permite el aislamiento de una molécula y la generación de los perfiles de movilidad de sus fragmentos.
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Artículo de método
Uso de un espectrómetro de movilidad de iones cíclicos para experimentos de movilidad de iones en tándem
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Resumen
Resumen
La caracterización precisa de las estructuras químicas es importante para comprender sus mecanismos biológicos subyacentes y propiedades funcionales. La espectrometría de masas (EM) es una herramienta popular, pero no siempre es suficiente para revelar completamente todas las características estructurales. Por ejemplo, aunque los carbohidratos son biológicamente relevantes, su caracterización se complica por numerosos niveles de isomerismo. La espectrometría de movilidad iónica (SGI) es un complemento interesante porque es sensible a las conformaciones iónicas y, por lo tanto, al isomerismo.
Además, los avances recientes han mejorado significativamente la técnica: la última generación de instrumentos IMS cíclicos ofrece capacidades adicionales en comparación con los instrumentos IMS lineales, como un mayor poder de resolución o la posibilidad de realizar experimentos de movilidad iónica en tándem (IMS / IMS). Durante IMS/IMS, un ion se selecciona en función de su movilidad iónica, fragmentado y reanalizado para obtener información sobre la movilidad iónica sobre sus fragmentos. Trabajos recientes mostraron que los perfiles de movilidad de los fragmentos contenidos en dichos datos IMS / IMS pueden actuar como una huella digital de un glicano en particular y pueden usarse en una estrategia de redes moleculares para organizar conjuntos de datos glucómicos de una manera estructuralmente relevante.
El objetivo de este protocolo es, por lo tanto, describir cómo generar datos IMS / IMS, desde la preparación de la muestra hasta la calibración final de la sección transversal de colisión (CCS) de la dimensión de movilidad iónica que produce espectros reproducibles. Tomando el ejemplo de un glicano representativo, este protocolo mostrará cómo construir una secuencia de control IMS / IMS en un instrumento IMS cíclico, cómo contabilizar esta secuencia de control para traducir el tiempo de llegada de IMS en tiempo de deriva (es decir, el tiempo de separación efectivo aplicado a los iones) y cómo extraer la información de movilidad relevante de los datos sin procesar. Este protocolo está diseñado para explicar claramente los puntos críticos de un experimento IMS/IMS y, por lo tanto, ayudar a los nuevos usuarios de IMS cíclico a realizar adquisiciones sencillas y reproducibles.
Introducción
La caracterización química completa de las biomoléculas es clave para comprender sus propiedades biológicas y funcionales subyacentes. Con este fin, las ciencias "ómicas" se han desarrollado en los últimos años, con el objetivo de la caracterización a gran escala de estructuras químicas en concentraciones biológicas. En proteómica y metabolómica, la EM se ha convertido en una herramienta central para desentrañar la heterogeneidad estructural que se encuentra en los medios biológicos, especialmente gracias a su sensibilidad y capacidad para proporcionar información estructural a través de la EM en tándem (EM / EM). En las estrategias de EM/EM, un ion se selecciona de a....
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Protocolo
NOTA: En la Figura 1 se proporciona una descripción general del protocolo. Los parámetros utilizados para los experimentos descritos en el presente protocolo se pueden encontrar en la Tabla Suplementaria S1 y la Tabla Suplementaria S2.
1. Preparación de la solución de muestra
NOTA: El protocolo se describe utilizando un pentasacárido arabinoxilano (23-α-L-arabinofuranosil-xilotetraosa o XA2XX; ver la Tabla de Materiales) como ejemplo.
- Preparación del disolvente: 500 μM LiCl en 50:50
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Resultados
Se eligió un pentasacárido arabinoxilano, XA2XX, como ejemplo para ilustrar este protocolo. Este compuesto está disponible comercialmente, pero solo como mezcla con otro pentasacárido arabinoxilano, XA3XX (XA3XX puro también está disponible comercialmente). Las estructuras de XA2XX y XA3XX se dan en la Figura Suplementaria S1. Como la proporción de XA2XX y XA3XX en la mezcla comercial es de ~50:50, se preparó una solución a 20 μ.......
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Discusión
El SELECT SERIES Cyclic IMS es una poderosa herramienta que permite seleccionar una población iónica definida, de una movilidad m/z e iónica dada, sin necesidad de separación cromatográfica aguas arriba. El instrumento ofrece la posibilidad de generar un mapa de fragmentación bidimensional de esta población iónica, del que se pueden extraer los espectros MS/MS e IMS/IMS. Sin embargo, el usuario debe tener en cuenta varios puntos críticos que requieren atención durante el proceso experimental.
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Divulgaciones
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.
Agradecimientos
S.O. agradece a la Agencia Nacional de Investigación de Francia la financiación de su doctorado (beca ANR-18-CE29-0006).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Mezcla de 33-&alfa;-L- más 23-&alfa;-L-Arabinofuranosil-xilotetraosa (XA3XX/XA2XX) | Megazyme Ltd., Wicklow, Irlanda | O-XAXXMIX | XA2XX + XA3XX mezcla |
| 33-α-L-Arabinofuranosil-xilotetraosa (XA3XX) | Megazyme Ltd., Wicklow, Irlanda | O-XA3XX | XA3XX puro estándar |
| Tubos Eppendorf Safe-Lock, 1,5 mL, Calidad Eppendorf, incoloros, 1.000 tubos | Eppendorf, Hamburgo, Alemania | 0030120086 | Se utiliza para preparar la solución madre de carbohidratos y la dilución |
| FALCON 50 mL Tubo cónico de polipropileno 30 x 115 mm | Corning Science Mé xico S.A. de C.V., Reynosa, Tamaulipas, México | 352070 | Se utiliza para preparar la solución madre acuosa de cloruro de litio LiCl 100 mM |
| (reactivo ACS, ≥ 99 %) | Sigma-Aldrich Inc., Saint Quentin Fallavier, Francia | 310468 | Se utiliza para dopar la muestra con litio |
| Major Mix IMS/Tof Calibration Kit Waters | Corp., Wilmslow, Reino Unido | 186008113 | Solución de calibración para MS e IMS |
| MassLynx 4.2 SCN1016 Release 6 (Waters Embedded Analyser Platform for Cyclic IMS 2.9.1 Release 9) | Waters Corp., Wilmslow, Reino Unido | 721022377 | Software de proveedor de IMS cíclico para el control de instrumentos y el procesamiento de datos |
| Metanol para HPLC PLUS Grado de gradiente | Reactivos Carlo-Erba, Val de Reuil, Francia | 412383 | Disolvente de alta pureza |
| MS Leucina Encefalina Kit | Waters Corp., Wilmslow, Reino Unido | 700002456 | Compuesto de referencia utilizado para la puesta a punto del espectrómetro de masas |
| SCHOTT DURAN Botella de vidrio de borosilicato de 100 ml | VWR INTERNATIONAL, Radnor, Pensilvania, US 218012458 | Se utiliza para preparar la solución de 500 µ M LiCl en 50:50 MeOH/Agua | |
| SELECCIONAR SERIE Cíclico IMS | Waters Corp., Wilmslow, Reino Unido | 186009432 | Espectrómetro de masas de movilidad iónica equipado con una célula IMS cílica |
| Sitio web: http://mzmine.github.io/ | MZmine Development | Team-Enlace | para descargar el software MZmine |
| Sitio web: | https://github.com/siollivier/IM-MN INRAE, UR BIA, BIBS Facility, Nantes, Francia | - | Enlace a un script de R interno que contiene una función de calibración CCS |
Referencias
- Allard, P. -M., et al. Integration of molecular networking and in-silico MS/MS fragmentation for natural products dereplication. Analytical Chemistry. 88 (6), 3317-3323 (2016).
- Wang, M., et al. Mass spectrometry searches using MASST. <....
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Reimpresiones y permisos
