Bioprospección de microorganismos extremófilos para hacer frente a la contaminación ambiental

Los ambientes extremos de nuestro planeta son excelentes fuentes de microorganismos capaces de tolerar condiciones duras (es decir, temperatura, pH, salinidad, presión y metales pesados)^1,2, siendo Islandia, Italia, ESTADOS UNIDOS, Nueva Zelanda, Japón, África Central e India, las áreas volcánicas más reconocidas y estudiadas ^{3,4,5,6,7,8,9} . Los termófilos han evolucionado en ambientes hostiles en un rango de temperaturas de 45 °C a 80 °C 10,11,12. Los microorganismos termófilos, ya sean pertenecientes a los reinos arqueal o bacteriano, son un reservorio para el estudio de la biodiversidad, la filogénesis y la producción de biomoléculas exclusivas para aplicaciones industriales 13,14,15,16. De hecho, en las últimas décadas, la continua demanda industrial en el mercado global ha fomentado la explotación de extremófilos y termozimas para sus aplicaciones diversificadas en varios campos biotecnológicos 17,18,19.

Las aguas termales, donde los organismos viven en consorcios, son ricas fuentes de biodiversidad, representando así un hábitat atractivo para estudiar la ecología microbiana^20,21. Además, estas áreas volcánicas ricas en metales son comúnmente colonizadas por microorganismos que han desarrollado sistemas de tolerancia para sobrevivir y adaptarse a la presencia de metales pesados^22,23 y, por lo tanto, participan activamente en sus ciclos biogeoquímicos. Hoy en día, los metales pesados se consideran contaminantes prioritarios para los seres humanos y el medio ambiente. Los microorganismos resistentes a metales pesados son capaces de solubilizar y precipitar metales transformándolos y remodelando sus ecosistemas^24,25. La comprensión de los mecanismos moleculares de la resistencia a metales pesados es un tema candente para la urgencia de desarrollar nuevos enfoques verdes 26,27,28. En este contexto, el descubrimiento de nuevas bacterias tolerantes representa el punto de partida para desarrollar nuevas estrategias de biorremediación ambiental^24,29. Para acompañar los esfuerzos para explorar ambientes hidrotermales a través de procedimientos microbiológicos y aumentar el conocimiento sobre el papel del gen (s) que sustenta la tolerancia a los metales pesados, se realizó un cribado microbiano en el área de aguas termales de Campi Flegrei en Italia. Este ambiente rico en metales pesados muestra una poderosa actividad hidrotermal, fumarola y piscinas hirviendo, variables en pH y temperatura en dependencia de la estacionalidad, las precipitaciones y los movimientos geológicos subterráneos³⁰. En esta perspectiva, describimos una forma fácil de aplicar y eficaz de aislar bacterias resistentes a metales pesados, por ejemplo, Geobacillus stearothermophilus GF16³¹ (nombrado como aislado 1) y Alicyclobacillus mali FL18³² (nombrado como aislado 2) del área de Pisciarelli de Campi Flegrei.

1. Muestreo de microorganismos de sitios geotérmicos

1. Elija el sitio para el muestreo utilizando como criterio lugares con la temperatura y el pH deseados. Mida los parámetros físicos a través de una sonda de termopar digital, insertándola en las piscinas o lodos seleccionados.
2. Recolecte 20 g de muestras de suelos (en este caso, de lodo en el sitio hidrotermal de Pisciarelli Solfatara), recogiéndolos con una cuchara esterilizada. Tome al menos dos muestras para cada sitio elegido.
3. Coloque las muestras en tubos de polipropileno estéril de 50 ml y cierre inmediatamente.
4. Mida el pH y la temperatura con una sonda de termopar digital insertándola directamente en el sitio de muestreo. Después de su uso, enjuague la sonda cuidadosamente con agua desionizada.

2. Aislamiento de microorganismos resistentes a metales pesados

NOTA: Realice los pasos 2.1-2.7 bajo una capucha biológica estéril.

1. Inocular 2 g de cada muestra recogida en 50 ml de medio Luria-Bertani (LB) recién preparado, en el que el pH se ha ajustado a 4 o 7 mediante la adición de HCl o NaOH.
2. Incubar las muestras a la misma temperatura del sitio de muestreo y a ±5 °C (55 °C y 60 °C para muestras de Pisciarelli) en un agitador orbital con temperatura controlada durante 24 h con una velocidad de agitación de 180 rpm.
3. Placa 200 μL de las muestras cultivadas en agar LB (pH 4 o pH 7) e incubar en condiciones estáticas durante 48 h a 55 °C o 60 °C.
4. Aísle las colonias individuales y repita los ciclos de recubrimiento de rayas (pasos 2.3 y 2.4) al menos tres veces.
5. Para preparar reservas de células congeladas a -80 °C, cultive los cultivos durante la noche (ON) y agregue a las células cultivadas un 20% de glicerol (en un volumen final de 1 ml); use una mezcla de acetona y hielo seco para una congelación rápida.
6. Para preparar un inóculo a partir de una cepa de glicerol, inocular 50 μL en 50 ml de LB (pH 4 o pH 6) e incubar a 55 °C o 60 °C en el agitador orbital a 180 rpm ON.
7. Para obtener un perfil de crecimiento, diluya un precultivo (obtenido desde el paso 2.6) a 0.1 OD_{600 nm} en 10 mL de LB (pH 4 o pH 6), haga crecer las células a 55 °C o 60 °C durante 16 h en el agitador orbital y mida el OD_{600 nm} a intervalos de 30 min.
8. Construya una curva de crecimiento a partir de los datos obtenidos en el paso 2.7 con tiempo (min) en el eje X y OD_{600 nm} en el eje Y.
9. Realice la misma curva de crecimiento descrita en los pasos 2.7 y 2.8, pero variando el pH (± 1 unidad) del medio de cultivo (por ejemplo, pH 3 y 5 para muestras cultivadas a pH 4) para determinar el pH óptimo para condiciones de laboratorio.

3. Identificación de aislados microbianos

1. Preparación de ADN genómico
   1. Inocular el aislado rayado de la cepa de glicerol en 50 mL de lb medio (pH 4 o pH 6) y crecer en un agitador orbital a 55 °C o 60 °C a 180 rpm ON.
   2. Cosechar el cultivo ON por centrifugación durante 10 min a 5000 x g. Deseche el sobrenadante.
   3. Preparar 10 mL de tampón de lisis bacteriana compuesto por: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 2 mM EDTA, 1.2% Triton X-100 y lisozima (20 mg/mL) inmediatamente antes de su uso.
   4. Resuspend el pellet en 180 μL de tampón de lisis de bacterias. Incubar durante 30 min a 37 °C.
   5. Siga las pautas indicadas por un kit de purificación de ADN genómico (Tabla de materiales) para extraer ADN genómico.
   6. Cuantificar el ADN genómico extraído y su pureza mediante medición UV-Vis. Para la pureza, determine las proporciones: OD 260/280 nm y OD 260/230 nm.
   7. Evaluar la integridad del ADN genómico cargando 200 ng de cada muestra en un gel de agarosa al 0,8% y comparando la distribución del tamaño con un marcador molecular de alto peso.
   8. Encarga a un servicio externo la preparación del fragmento de ARNr 16S, secuenciación y análisis comparativo de la secuencia obtenida (1000 pb) con las presentes en la base de datos de nucleótidos del Centro Nacional de Información Biotecnológica de Estados Unidos (NCBI)³³.
2. Para corroborar los datos de la secuenciación del ARNr 16S, también se realiza un ribotipado automatizado sobre el ADN cromosómico digerido (servicio externo, Tabla de Materiales).
3. En el caso de que la identificación de la especie no pueda determinarse únicamente con datos de ribotipado, encargar un análisis MALDI-TOF MS para la identificación de ácidos grasos.
4. Para realizar un análisis filogenético del género identificado, analizar la secuencia de ARNr 16S del aislado con BLASTn³⁴. Las secuencias con identidades del 99% al 97% deben usarse para construir una alineación de secuencia múltiple utilizando CLUSTAL Omega³⁵. Construya un árbol de unión al vecino utilizando la opción predeterminada de ClustalW2 (Filogenia simple).

4. Susceptibilidad a los metales pesados y los antibióticos

1. Inocular el aislado de un stock de glicerol (ver paso 2.5) y cultivarlo en 200 mL de LB bajo las condiciones óptimas de pH y temperatura previamente determinadas.
2. Diluir cada precultivo a 0,1 OD_{600 nm} en 5 ml de lb medio (al pH apropiado) que contenga concentraciones crecientes de metales pesados. Las concentraciones varían de 0.01-120 mM para metales pesados [As(V), As(III), Cd(II), Co(III), Cr(VI), Cu(II), Hg(II), Ni(II), V(V)] o 0.5-1 mg/mL para los antibióticos [Ampicilina, Bacitracina, Cloranfenicol, Ciprofloxacina, Eritromicina, Kanamicina, Estreptomicina, Tetraciclina y Vancomicina].
3. Realice tratamientos con metales pesados y antibióticos por separado. Utilice un tubo de polipropileno de 50 ml y haga crecer las células en un agitador orbital con temperatura controlada con una velocidad de agitación de 180 rpm a 55 °C o 60 °C durante 16 h para cada condición/tratamiento.
4. Calcular la Concentración Inhibitoria Mínima (CMI) ya sea para antibióticos o metales pesados identificando los valores de concentración en los tubos donde no se produce crecimiento microbiano, es decir, determinando los valores que inhiben completamente el crecimiento celular después de 16 h.
5. Comprobar que la concentración es inhibitoria y no letal para las células mediante el recubrimiento de 200 μL del cultivo cultivado al valor que se considera como MIC en placas lb-agar (al pH y temperatura adecuados) y verificando la presencia de colonias después de la incubación ON.
   NOTA: Dado que el cultivo en placa de agar LB es viable a 4 °C solo durante unas pocas semanas, para preservar los aislados durante más tiempo, se prepararon y almacenaron existencias de glicerol a -80 °C. Para la determinación de la CMI, se llevaron a cabo al menos tres réplicas independientes utilizando cultivos independientes. La desviación estándar se calculó entre experimentos triplicados.

Sitio de muestreo
Este protocolo ilustra un método para el aislamiento de bacterias resistentes a metales pesados de una fuente termal. En este estudio, el área de Pisciarelli, un ambiente geotérmico ácido-sulfídico, se utilizó como sitio de muestreo (Figura 1). Este ecosistema se caracteriza por el flujo de fluidos sulfurosos agresivos derivados de actividades volcánicas. Se ha demostrado que las comunidades microbianas en los sistemas geotérmicos ácido-sulfídicos están sometidas a una presión selectiva extrema producida por la presencia de altas concentraciones de metales pesados. Las muestras se recogieron en dos periodos diferentes del año (abril y septiembre) desde2,21 una piscina de barro marginal con respecto a una piscina de barro burbujeante. En la piscina de barro, se registraron fluctuaciones en los valores de pH (~ pH 6 en abril y ~ pH 5 en septiembre), mientras que la temperatura fue de ~ 55 ° C en ambos casos. Sin embargo, también se registraron temperaturas más altas en la piscina de barro (~ 70 ° C) en otros años32.

Aislamiento e identificación
Las muestras recogidas se inocularon en medio LB y se incubaron durante 24 h a 55 °C y 60 °C como se informó anteriormente, estableciendo así las condiciones de laboratorio para el crecimiento de las muestras celulares para imitar las condiciones químico-físicas ambientales. Para favorecer el crecimiento celular, las colonias individuales se rayaron en la placa y se aislaron después de varias diluciones (al menos 3) en un medio rico en líquido; las cepas aisladas mostraron su temperatura óptima de crecimiento a 55 °C y 60 °C (Figura 2).. Para identificar los nuevos aislados, se llevó a cabo una preparación de ADN genómico y se realizó la secuenciación del ARNr 16S y el análisis de espectrometría de masas de ácidos grasos como un servicio externo. Como se informó, el análisis de los ácidos grasos es un poderoso método bioanalítico que ayuda en la identificación precisa de bacterias cuando se combina con otros enfoques36. Se utilizaron múltiples alineaciones de ARNr 16S para construir el árbol filogenético para identificar a los parientes más cercanos37.

Prueba de susceptibilidad a metales pesados
La coexistencia de moléculas tóxicas caracteriza los ambientes solfatáricos. En particular, las aguas termales en Pisciarelli se caracterizan por altos niveles de CO2, H2S, NH4 en coexistencia con As, Hg, Fe, Be, Ni, Co, Cu30,38. Por esta razón, se realizó una caracterización fenotípica de los microorganismos aislados en presencia de una concentración creciente de metales pesados, como se informa en la Tabla 1. Curiosamente, el aislado 1 mostró una mayor tolerancia a As(V) y V(V). La alta resistencia tanto al arseniato como al vanadato puede deberse a sus estructuras químicas; de hecho, ambos iones son similares a los iones fosfato, lo que sugiere que V(V) y As(V) podrían ser absorbidos por las células a través de sistemas de transporte de fosfato. Estos aislados resultaron ser también resistentes a Cd(II), aunque el valor de MIC fue relativamente bajo. Este resultado puede explicarse por la ausencia de Cd(II) en el grupo. Aunque los dos microorganismos fueron muestreados en el mismo sitio, mostraron diferentes perfiles de resistencia a metales pesados. Sin embargo, fueron muestreados en diferentes períodos, señalando así la variación dependiente de la temporada en la concentración de metales pesados como la principal fuerza impulsora que da forma a la composición de las comunidades microbianas y su resistencia diferencial a los metales pesados39. A partir de estos datos comparativos, se ha demostrado que el aislado 1 tiene una fuerte resistencia a As(V), mientras que el aislado 2 para As(III). Se requieren más investigaciones genéticas para desentrañar los mecanismos de resistencia molecular y comprender mejor cómo los fenotipos se ven afectados por la presión selectiva de las aguas termales.

Pruebas de resistencia a los antibióticos
Las cepas microbianas evolucionadas en ambientes extremos generalmente exhiben resistencia a diferentes antibióticos. La correlación entre la resistencia a los metales pesados y los antibióticos es bien conocida40. Por esta razón, probamos la resistencia a los antibióticos para ambos aislados (Tabla 2). El aislado 1 mostró una alta sensibilidad a todos los antibióticos probados, incluso cuando se utilizaron concentraciones bajas. Por el contrario, el aislado 2 es resistente a todos los antibióticos probados, con la excepción de cloranfenicol y tetraciclina. Curiosamente, los valores de CMI determinados hacia la ampicilina, la eritromicina, la kanamicina, la estreptomicina y la vancomicina fueron comparables a los de otras bacterias resistentes a los antibióticos e incluso más altos para la bacitracina y la ciprofloxacina41. Estos datos fascinantes merecen más investigaciones; probablemente, debido a mutaciones aleatorias o transferencia horizontal de genes, el microorganismo ha adquirido resistencia a los antibióticos, lo que podría representar una ventaja selectiva en condiciones ambientales tan extremas.

Figura 1. Sitio de muestreo: zona solfatárica de Pisciarelli, Campi Flegrei (Nápoles, Italia).. El sitio de muestreo se encuentra a 40° 49' 45.3" N - 14° 08' 49.9 E, en el área geotérmica de la fumarola Pisciarelli. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Representación esquemática del procedimiento experimental. Los microorganismos se muestrean en aguas termales, se cultivan en el laboratorio, se aíslan a través de rayas y recubrimientos repetidos, y se identifican genotípicamente en la secuenciación del ARNr 16S. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1. Valores MIC hacia iones metálicos pesados de los aislados. Los MIC se consideran como los valores mínimos de concentración que inhiben completamente el crecimiento celular después de 16 h; los valores se informan como promedio de tres experimentos.

Tabla 2. Valores de MIC hacia antibióticos de los aislados. Los MICs se consideran como las concentraciones mínimas que inhiben completamente el crecimiento celular después de 16 h; los valores se informan como promedio de tres experimentos.

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.