Administración intraductal y visualización por rayos X de la solución ablativa a base de etanol para la prevención y el tratamiento local del cáncer de mama en modelos de ratón

Resumen

Se describe un método de inyección intraductal de reactivos para una solución ablativa a base de etanol al árbol ductal mamario de ratón para imágenes in vivo y prevención del cáncer de mama. La inyección directamente en la abertura del pezón permite dirigirse a las células epiteliales mamarias con un daño mínimo en el tejido colateral.

Resumen

El cáncer de mama es el cáncer más prevalente y la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer para las mujeres en los Estados Unidos. Para las mujeres de alto riesgo, la mastectomía profiláctica es la estrategia de prevención primaria más efectiva. La mastectomía profiláctica es un procedimiento quirúrgico agresivo que elimina completamente las células epiteliales mamarias de las que surge el cáncer de mama junto con el tejido circundante. Buscamos desarrollar un procedimiento intraductal mínimamente invasivo como alternativa a la mastectomía profiláctica para extirpar localmente las células epiteliales mamarias antes de que puedan volverse malignas. Nosotros y otros hemos desarrollado un procedimiento de administración intraductal para alcanzar y tratar estas células epiteliales en modelos de roedores de cáncer de mama. Mientras que la glándula mamaria del ratón con una sola abertura de árbol ductal no anastomosada en el pezón tiene una arquitectura mucho menos compleja y tortuosa que la mama humana, los modelos de cáncer de mama inducidos químicamente y genéticamente modificados son valiosos para producir estudios de prueba de concepto de nuevas estrategias preventivas. Aquí, describimos un procedimiento para la administración intraductal de una solución ablativa a base de etanol que contiene un agente de contraste a base de tantalio micro-CT / rayos X dentro del árbol ductal mamario del ratón con el propósito terapéutico de la prevención primaria del cáncer de mama. La administración intraductal de reactivos acuosos (por ejemplo, compuestos citotóxicos, siRNAs, AdCre) se ha descrito previamente en modelos de ratón. Por lo tanto, centramos nuestra descripción del protocolo en modificaciones metodológicas y consideraciones experimentales únicas para optimizar la administración de etanol, minimizar los efectos secundarios locales y sistémicos de la administración de etanol y para la visualización in vivo del llenado del árbol ductal a través de imágenes de micro-CT / fluoroscopia. La visualización del árbol ductal inmediatamente después de la inyección de una solución que contiene contraste permite confirmar el llenado completo o los resultados fallidos, como el relleno insuficiente o el llenado excesivo. Este procedimiento se puede aplicar para la administración y la obtención de imágenes de otros compuestos ablativos destinados a prevenir la formación de tumores o tratar localmente tumores en etapa temprana accesibles a través del árbol ductal.

Introducción

El cáncer de mama es una enfermedad común y potencialmente letal con pocas opciones disponibles para la ^prevención1. La intervención más efectiva es la mastectomía profiláctica; sin embargo, solo las personas de alto riesgo optan por someterse a este procedimiento, ya que es una cirugía con importantes consecuencias que cambian la ^vida2. El procedimiento elimina completamente las células epiteliales mamarias de las que surge el cáncer de mama junto con el tejido circundante. Esto puede resultar en estrés físico, psicológico y social para el individuo, y a menudo disuade a las personas de proceder con este procedimiento quirúrgico como su primera línea de intervención primaria.

Hemos demostrado que la administración de una solución ablativa que contiene etanol al 70% (EtOH) directamente en el árbol ductal es efectiva para matar las células epiteliales mamarias con daño tisular colateral limitado y para prevenir tumores de mama en modelos de ^ratón3. EtOH se ha utilizado durante mucho tiempo clínicamente como un agente ablativo o esclerosante para el tratamiento local. La inyección percutánea de EtOH se utiliza como agente ablativo para tumores hepáticos irresecables, neoplasias renales y suprarrenales y tumores quísticos pancreáticos4,5,6; para la neurolisis del plexo celíaco para reducir el ^dolor7; y para el tratamiento de pseudoaneurismas ^mamarios8. La inyección intravascular de EtOH se utiliza como agente esclerosante para eliminar la hinchazón y la deformación de las malformaciones arteriovenosas (MAV) y para el tratamiento cosmético de arañas vasculares y venas varicosas9,10,11,12,13. Al igual que la mastectomía profiláctica, el éxito de la prevención con la administración local de una solución ablativa depende de la capacidad de eliminar completamente todas las células epiteliales mamarias de las que podría surgir el cáncer. Esto requiere la confirmación de que la sustancia ablativa ha llenado con éxito el árbol ductal, contactando así directamente con todas las células epiteliales mamarias. Se dispone fácilmente de medios clínicos para inyectar sustancias dentro de las glándulas mamarias y visualizarlas mediante fluoroscopia o ductografía guiada por ^{imágenes14,15}; por lo tanto, será posible entregar y confirmar el parto exitoso cuando este procedimiento pueda justificar la evaluación en ensayos clínicos.

Demostrar la viabilidad de este enfoque guiado por imágenes en animales de laboratorio es un paso clave para establecer la eficacia y la viabilidad traslacional de la ablación intraductal (DI) como medida preventiva para el cáncer de mama. En nuestro laboratorio, hemos desarrollado un método para inyectar con éxito todas las glándulas mamarias en ratones con una solución ablativa que contiene un agente de contraste durante un curso de inyecciones semanales para garantizar que el animal no sucumba a una sobredosis de EtOH (Figura 1, Figura 2, referencia nos.3,16). Este procedimiento coloca una aguja de 34 G dentro de la abertura del pezón de un ratón anestesiado con isoflurano para inyectar la solución de prueba. Algunas mejoras clave del procedimiento incluyen el uso de jeringas gastight para líquidos y gases, la inyección de volúmenes más altos por árbol ^ductal17 y el tratamiento antiinflamatorio extendido. El tratamiento preclínico de 5 mg/kg de carprofeno, un AINE, desde 2 días antes hasta 7 días después del procedimiento de IDENTIFICACIÓN está en línea con el de la terapia esclerosante clínica para la MALV. Por lo general, después de la anestesia sistémica, los pacientes reciben medicamentos antiinflamatorios, como los AINE, durante 2 días después del procedimiento que pueden extenderse para mitigar cualquier inflamación o dolor ^local12. La intoxicación por alcohol se mitiga significativamente mediante la inyección intraperitoneal de una solución de sacarosa al 5% en ratones. Con la administración de esta solución de sacarosa, los ratones pueden ser inyectados de forma segura con hasta 160 μL de EtOH al 70% (hasta cuatro árboles ductales; aproximadamente 0,4 g / dL de contenido de EtOH en sangre); los animales se recuperaron completamente dentro de las 4 h posteriores a las inyecciones de ID. Para la inyección de más de cuatro glándulas en ratones y / o concentraciones más altas de EtOH, realizamos sesiones secuenciales para permitir suficiente tiempo de recuperación. La intoxicación por alcohol en las mujeres sería una preocupación menor debido a la menor proporción de cantidad de alcohol en relación con el peso corporal. Dado el número de árboles ductales en la mama ^humana14,15, alrededor de 16, y el volumen estimado para llenar cada árbol ^ducto18,19, se administrarán hasta 32 mL de EtOH al 70%. Esta cantidad será muy inferior a los 50 mL de EtOH al 95% administrados en otros procedimientos ^clínicos4,9. La administración intravenosa de tiamina y solución de glucosa podría usarse para minimizar aún más los efectos de la intoxicación por EtOH, especialmente en los casos en que sea necesario inyectar un mayor volumen total de EtOH y / o para mujeres que tienen una menor tolerancia al consumo de alcohol (por ejemplo, variantes alélicas en alcohol o aldehído deshidrogenasas).

Las imágenes a través de micro-CT / fluoroscopia nos permiten confirmar el llenado ductal exitoso de cada glándula (Figura 1, Figura 2, Figura 3). Esto se puede registrar para futuros análisis, o evaluarse en el momento a través de imágenes de fluoroscopia en tiempo real, como se haría en la aplicación clínica, para limitar la carga general de radiación impuesta al animal. Para mejorar aún más las características específicas de esta solución ablativa para la administración guiada por imágenes en tiempo real in vivo, comparamos previamente el contraste que contiene yodo aprobado por la FDA con una nanopartícula que contiene óxido de tántalo (TaOx) sintetizada por el laboratorio ^shapiro3,16. _TaOx mostró un rendimiento superior como agente de contraste micro-CT para visualizar el llenado inicial del árbol ductal (Figura 2, Figura 3). _TaOx se puede utilizar como contraste de referencia para realizar una evaluación más sistemática y longitudinal de otros agentes de contraste de piscinas sanguíneas basados en nanopartículas (por ejemplo, que contengan yodo, bismuto u oro) y la compatibilidad de _TaOx con diferentes concentraciones de etilcelulosa como agente gelificante20,21.

Protocolo

Todos los experimentos descritos aquí se llevaron a cabo bajo protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Michigan.

1. Tratamiento antiinflamatorio prolongado

1. Asegúrese de que los ratones que reciben soluciones de inyección que contienen EtOH u otros irritantes potenciales reciban tratamiento antiinflamatorio desde 2 días antes de la inyección hasta 7 días después de la inyección. El método preferido de dosificación es la administración oral a través de una taza de gel de sucralosa que contiene carprofeno en una concentración adecuada.
2. Preparar carprofeno con la concentración requerida. Para este experimento, se preparó una solución de trabajo de 2 mg/mL (la solución madre es de 50 mg/mL) diluyendo en PBS estéril para inyectar 0,5 mL para lograr una dosis final de 1 mg por taza. Agregue un colorante alimentario azul estéril (BFD) al 1% v / v en lugar de una fracción del PBS del volumen total necesario para la dilución para visualizar mejor la mezcla completa del medicamento en el gel de sucralosa.
3. Prepare una taza para la adición de carprofeno según la recomendación del fabricante. A menos que se recomiende lo contrario, coloque la taza en un baño de agua a 60 °C durante 15 min. Retire las tazas y séquelas para minimizar la posibilidad de contaminación.
   1. Use 70% de EtOH o una toallita de EtOH para limpiar la superficie de la tapa de la taza y dejar secar. Use una jeringa para inyectar la cantidad necesaria de solución de carprofeno a través de la tapa. Para este experimento, se inyectan 500 μL. Cubra el lugar de inyección con una pegatina y agite vigorosamente durante 15 s.
   2. Vórtice la taza durante 15 s y luego guárdela para su uso posterior después de verificar visualmente la mezcla completa. Revise las tazas para una mezcla homogénea buscando grupos de color azul oscuro. Permita que las tazas lleguen a temperatura ambiente antes de pasar al refrigerador para su almacenamiento hasta un mes.
      NOTA: Estas tazas también se pueden almacenar a temperatura ambiente una vez dosificadas, si es necesario, pero tenga cuidado de prestar atención a la guía de eficacia del medicamento del fabricante. Fechar la pegatina ayuda a realizar un seguimiento de la fecha de inyección sin arriesgarse a que un bolígrafo o un marcador afilado perforen la tapa.
4. Cuando esté listo para usar, limpie el exterior de la taza con un 70% de EtOH. Despegue la tapa y coloque la taza en la jaula con los ratones. Reemplace las tazas cada dos días o cuando estén vacías. Una taza debería ser suficiente para hasta cinco ratones durante 1-2 días.

2. Preparación preoperatoria

NOTA: Este paso ocurrirá 2-3 días antes de la inyección.

1. Anestesiar al ratón con un vaporizador de isoflurano (2%-3% de isoflurano, 1,5 L/min de oxígeno) y aplicar lubricante para los ojos. Mantenga la anestesia al 1% -3% de isoflurano según sea necesario durante todo el procedimiento con un cono nasal mientras monitorea cuidadosamente la frecuencia respiratoria del animal.
2. Aplique el lubricante para los ojos en los ojos del ratón mientras está en el cono de la nariz y luego coloque el mouse sobre su espalda. Use un aplicador con punta de algodón para aplicar crema depilatoria de venta libre en el área del pezón (el área de la glándula mamaria que se inyectará). Frote la crema en el área durante 10-30 s con el aplicador para ayudar a aflojar el pelaje rápidamente.
   NOTA: No deje la crema en el animal más tiempo del necesario y retírela por completo para evitar quemar la piel.
3. Después de 10-30 s de la aplicación, use agua tibia sobre una gasa para eliminar completamente la crema y aflojar el pelaje del animal. Realice al menos dos a cuatro enjuagues del área con gasa fresca para la eliminación de la crema antes de secar con una gasa seca limpia después del enjuague final. Verifique el área de eliminación de pieles para confirmar una buena visibilidad y acceso a los pezones. Repetir con aplicación de crema depilatoria si es necesario.
4. Coloque el ratón en una jaula de recuperación limpia y seca separada en una almohadilla térmica para recuperarse de la anestesia. Observe al ratón hasta que se haya recuperado completamente de la anestesia y devuélvalo a la jaula doméstica.
5. Proporcione a los ratones una taza de solución de gel de sucralosa que contenga carprofeno (1 mg / taza) para la dosificación previa del agente antiinflamatorio después de la recuperación. Una taza puede proporcionar hasta cinco ratones con carprofeno durante un máximo de 2 días. Revise la taza diariamente y reemplácela según sea necesario, o cada dos días si no se consume por completo.

3. Inyección intraductal

NOTA: Este paso ocurrirá 2-3 días después de la preparación preoperatoria.

1. Preparar una solución madre de óxido de tántalo (_TaOx) de 333,3 mM a partir de la formulación en polvo adquirida como se describe ^en16 utilizando solución salina tamponada con fosfato (PBS). Use calor suave si el polvo no se disuelve completamente en la solución.
2. Haga una solución de imágenes ablativas mezclando tres partes de _TaOx con siete partes 100% EtOH para una solución final de _TaOx 70% EtOH 100mM. Agregue un colorante alimentario azul al 1% v/v a la solución final para una visualización asistida durante la inyección. Prepare un volumen basado en la necesidad del experimento.
   NOTA: Los pares de glándulas 1 y 5 pueden contener hasta 30 μL de la solución, mientras que todos los demás pares se pueden inyectar con hasta 50 μL en ratones FVB de 9 semanas de edad o mayores.
3. Anestesiar al ratón con isoflurano como en la preparación preoperatoria y mover el ratón al cono de la nariz una vez completamente anestesiado. Aplique lubricante para los ojos antes de colocar al animal boca arriba para la inyección. Asegure el mouse debajo del estereoscopio con cinta adhesiva, si es necesario.
4. Prepare la jeringa con el volumen deseado de solución inyectable. Cargue 21-51 μL de la solución inyectable en una jeringa de 50 μL con una aguja de 34 G conectada. Cargue 1 μL adicional de la solución para tener en cuenta la posible fuga de ese volumen después de retirar la aguja del pezón.
   NOTA: Los volúmenes anteriores son para los procedimientos típicos presentados aquí. Uno puede inyectar cualquier volumen deseado con el entendimiento de que la mayoría de las glándulas se llenarán en exceso si superan los 30 μL o 50 μL en los pares de glándulas 1 y 5, o 2-4, respectivamente. Es útil llenar la aguja con volumen adicional de la solución de inyección para probar el flujo libre de la solución inmediatamente antes de la inyección. Si inyecta más de una glándula mamaria, llene previamente varias jeringas para ahorrar tiempo. Sin embargo, no deje la solución en la jeringa por mucho tiempo.
5. Prepare los pezones para la inyección eliminando cualquier piel muerta que cubra la abertura del pezón con pinzas puntiagudas finas.
6. Sostenga el pezón suavemente con pinzas. Con el bisel de la aguja visible, inserte la aguja en la abertura del pezón hasta que el bisel esté completamente cubierto con la ayuda de guía de fórceps de punta fina. Puede ser necesario tirar del pezón hacia arriba sobre la aguja en lugar de empujar la aguja hacia el pezón (Tabla 1).
7. Una vez que el bisel de la aguja esté completamente rodeado por el pezón y esté en el conducto principal, comience a inyectar la solución a una velocidad constante de aproximadamente 40 μL / min. Evite inyectar demasiado rápido para asegurarse de que el árbol ductal no esté dañado. Mantenga la aguja en el pezón durante 30 s después de que el volumen se inyecte completamente antes de retirar la aguja con ayuda usando los fórceps. Esto se hace para evitar que la solución se derrame fuera del pezón (Figura 2).
   1. Evalúe el área para detectar cualquier signo de inyección fallida. Una apariencia abovedada puede indicar una inyección de almohadilla de grasa o un traumatismo en el área.
   2. Proceda a inyectar las glándulas mamarias restantes.
8. Mientras el animal todavía está anestesiado, inyecte 200-250 μL de solución de sacarosa al 5% (hasta 10 ml / kg) por vía intraperitoneal para minimizar los efectos potenciales de la intoxicación por alcohol.

4. imágenes micro-CT

1. Después de inyectar todas las glándulas deseadas, mueva al animal rápidamente al sistema de micro-CT y continúe manteniendo la anestesia utilizando el vaporizador de isoflurano incorporado. El animal puede ser grabado con cinta adhesiva para estandarizar la posición de la imagen. Por ejemplo, pegar cada pata trasera en una posición extendida ayuda a mantener los huesos de las patas del animal más lejos de las glándulas inferiores de interés en la imagen resultante.
   NOTA: Los animales pueden ser fotografiados utilizando diferentes parámetros de escaneo para la visualización del árbol ductal si se tiene cuidado de determinar una dosis de radiación de por vida aceptable apropiada para el animal y las dosis acumuladas no exceden este nivel. Se pueden generar imágenes fijas y videos de fluoroscopia sin realizar exploraciones para reducir aún más la exposición a la radiación (Figura 2).
2. Coloque el ratón en el campo de visión apropiado con la función de vista previa de fluoroscopia.
3. Realice imágenes _TaOx del árbol ductal del ratón con buena resolución y oportunidad para repetir los escaneos de adquisición estándar (2 min). Utilice los siguientes parámetros de escaneo: 90 kVp/88 μA; campo de visión (FOV), 36 mm; número de rebanadas, 512; espesor de la rebanada, 72 μm; resolución de vóxel, 72 ^μm3.
   1. Adquiera escaneos de alta resolución más largos (4 o 14 minutos) para una resolución aún mejor en animales. Estos son aceptables como procedimientos terminales antes de la eutanasia. Sin embargo, estos no son aceptables para que los animales sean escaneados longitudinalmente utilizando los mismos parámetros, ya que causará la enfermedad por radiación.
4. Después de completar el protocolo de imágenes, retire al animal de la anestesia y transfiéralo a una jaula de recuperación limpia y seca separada en una almohadilla térmica. Observe al animal hasta que se recupere por completo y luego devuélvalo a la jaula del hogar. Mantenga a los animales inyectados con solución ablativa con carprofeno hasta 7 días después de la inyección.
5. Realice copias rápidas de cualquier imagen escaneada dentro del software micro-CT (sistema incorporado) para apreciar mejor cualquier fuga de contraste o falta de llenado (Figura 2) sin análisis formal.
6. Realizar un análisis formal adicional de la imagen para su publicación o análisis detallado de escaneos que permitan la segmentación del área de interés si se desea (Figura 3).
   Nota : la principal diferencia entre estos métodos será la capacidad de umbral sólo el árbol ductal (copia formal) frente a la necesidad de umbral de toda la imagen (copia rápida). Se pueden generar otras mediciones e imágenes utilizando los paquetes de software para demostrar mejor el éxito del llenado de árboles ductales.

5. Análisis de imágenes

1. Realice la representación del árbol ductal inyectado utilizando un paquete de software especializado. Para hacer esto, segmente la almohadilla de grasa mamaria con un procesamiento de imágenes adicional.
   1. Para segmentar la almohadilla de grasa (compartimento más oscuro en comparación con la cavidad peritoneal, los músculos femorales y la piel) dentro de la cual se encuentra el árbol ductal de interés, seleccione la opción Spline Trace en el menú manual. Rastree el contorno de la almohadilla de grasa en cada tercera rebanada de datos.
   2. Haga clic en la opción Propagar objetos del menú semiautomático para conectar todas las divisiones trazadas y no trazadas en un solo objeto.
2. Seleccione la opción Volumen de umbral del menú semiautomático para ingresar el rango de HU deseado (300-3,000 HU es un buen punto de partida) y luego haga clic en el botón Copia de umbral para crear una copia que solo muestre el contraste (TaOx) dentro del árbol ductal y elimine el tejido blando.
3. Cambie el botón Ver a Copia como principal para ver solo la copia 3D sin estructuras circundantes.
   NOTA: Las características adicionales del software permiten realizar mediciones de la copia 3D (es decir, longitud, volumen, etc.).

Resultados

Los ratones hembra tienen cinco pares de glándulas mamarias con un solo árbol ductal que se abre en el orificio del ^pezón22. En las puntas del árbol ductal en desarrollo se encuentran los brotes terminales (TEB), estructuras proliferativas que dirigen el crecimiento y la ramificación. Después de la pubertad, cuando se completa la fase de elongación, los TEB retroceden y se vuelven funcional y anatómicamente indistinguibles de los conductos terminales o las yemas ^alveolares23. Las unidades lobulillares ductales terminales cumplen una función similar en humanos a la de los TEB en ratones y son los sitios de donde surge predominantemente el cáncer de ^mama24,25. Podemos inyectar hasta 50 μL de solución de EtOH al 70% para llenar todo el árbol ductal de las glándulas mamarias torácicas y abdominales de FVB/N, NSG y otras cepas de ratón de 9 semanas de edad (Figura 1, Figura 2, Figura 3, ver referencias3,16). En un experimento típico, podemos inyectar hasta ocho glándulas mamarias con una solución ablativa de 70% EtOH y 100 mM _TaOx en dos procedimientos de IDENTIFICACIÓN consecutivos separados por 7 días para permitir la recuperación del animal (Figura 2). Los animales son fotografiados por micro-CT inmediatamente después de la última inyección de ID para evaluar la entrega exitosa de la solución a todo el árbol ductal (Figura 2). En nuestra experiencia, los pezones de las glándulas inguinales son adecuados para la inyección en aproximadamente el 60% de los animales, y los pezones de las glándulas cervicales en aproximadamente el 40%. Cuando sea adecuado, podemos inyectar hasta 30 μL de solución de EtOH al 70% para llenar todo el árbol ductal de las glándulas mamarias cervicales e inguinales (Figura 2). Las cepas FVB y NSG generalmente presentan pezones más adecuados para inyección que C57BL / 6J o cepas mixtas de fondo genético. El protocolo de tinción dual de montaje completo o la microscopía confocal 3D son buenos métodos ortogonales para confirmar hasta qué punto se llenó el árbol ductal (Figura 3). Estos análisis de correlación tisular son compatibles y se pueden realizar después de imágenes in vivo. La limitación obvia de estos métodos ortogonales es que requieren la terminación animal para la recolección y el análisis de tejidos; sin embargo, en una fase de optimización de una nueva formulación ablativa, proporcionan una validación independiente.

Figura 1: Flujo de trabajo de procedimiento intraductal y análisis de imágenes. Se destacan los pasos clave del procedimiento de identificación. Consulte el video para obtener más detalles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Canulación exitosa y entrega de solución ablativa a múltiples glándulas mamarias. (A) Variegación representativa del pezón en cepas de ratón FVB y NSG. Los pezones largos son más fáciles de cannular que los pezones cortos, mientras que los pezones demasiado cortos o vestigiales no se pueden canular. Una vez canulado, el tamaño del pezón no afecta el parto intraductal exitoso. (B) El análisis anatómico bruto del colorante azul en una solución ablativa proporciona evidencia ex vivo del llenado del árbol ductal y el éxito de la entrega. (C,D) La fluoroscopia en tiempo real y la reproducción posterior a la imagen 3D micro-CT proporcionan evidencia in vivo del éxito de la entrega. (D) Inyección exitosa de glándulas abdominales e inguinales, y tres de cada cuatro glándulas torácicas (inyección de almohadilla de grasa en la glándula # 2). Las barras de escala corresponden a 1 mm en imágenes con diferentes aumentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Demostración in vivo y ex vivo del relleno de árboles ductales. 70% EtOH/100 mM _TaOx nanopartículas/Evans Blue solución se inyectó por vía intraductal en la glándula mamaria abdominal del ratón e inmediatamente se tomó una imagen mediante micro-CT y se procesó para la tinción de montaje completo dual. El árbol ductal se reconstruyó utilizando un paquete de software de análisis de imágenes. La solución llena completamente el árbol ductal teñido de alumbre de carmín. Una glándula separada fue inmunoteñida para E-Cadherina (Cdh1), eliminada con Alcohol Bencílico:Benzoato de Bencilo y fotografiada por microscopía confocal como se ^describe26. El árbol ductal fue reconstruido utilizando un software de análisis de imágenes. La representación pseudocoloreada de la imagen confocal (es decir, fondo negro a blanco, señal de marcador verde a magenta) se obtuvo con la función de inversión de imagen del software de edición de imágenes. Las barras de escala corresponden a 1 mm en imágenes con diferentes aumentos. Esta cifra ha sido modificada a partir de la referencia nº ³. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Emitir	Apariencia		Solución
Pezón corto (Fig. 2)	El pezón tiene un perfil bajo: difícil de agarrar		A veces es más fácil sostener la piel cerca del pezón y apuntar al centro del pezón con la aguja. Es probable que la aguja se sumerja debajo de la piel. Tirar hacia arriba lentamente puede revelar que el pezón está ligeramente por encima de la punta de la aguja y dar espacio para agarrarlo y tirar de él el resto del camino sobre la aguja. Tenga mucho cuidado al bucear debajo de la piel sobre el ángulo de la aguja. Es fácil obtener inadvertidamente una inyección de almohadilla de grasa apuñalando en el ángulo equivocado.
Pezón gordo	Mucho más grande que otros pezones con poca piel muerta pelable, fácilmente visible sin alcance		Muy fácil de obtener una inyección de almohadilla de grasa en estos pezones. Tenga mucho cuidado con el ángulo de la aguja al insertarla en el pezón.
Inyección de almohadilla de grasa (Fig. 2)	Hinchado alrededor del pezón y posiblemente en el pezón mismo: es más fácil ver si se agrega color a la solución inyectable		Si el pezón está hinchado con los primeros ul inyectados, retire la aguja e intente insertarla nuevamente con más cuidado con el ángulo. Comience la inyección nuevamente y esté atento a una mayor hinchazón. Si la hinchazón continúa, abandone el intento. Es muy raro inyectar con éxito un pezón que ha comenzado como una inyección de almohadilla de grasa.
Heridas/costras	Herida abierta o costras cerca del sitio de inyección de la solución de EtOH		Aplique ungüento antibiótico triple a las heridas abiertas, pero deje las heridas con costras solas. La aplicación de ungüento a las costras puede aumentar la probabilidad de que el animal moleste la costra y la elimine. Revise cada 1-2 días hasta que esté curado, dependiendo de la gravedad de la herida. El carprofeno debe administrarse hasta que se cure, incluso si está más allá de la ventana normal.

Tabla 1: Solución de problemas y consejos útiles.

Discusión

La mastectomía profiláctica es actualmente la intervención más efectiva para el cáncer de mama, sin embargo, tiene algunos impactos negativos graves. La ablación local de células epiteliales mamarias con una solución basada en EtOH es una terapia alternativa prometedora, como demostramos en un estudio de prueba de concepto sobre el agresivo modelo de ratón FVB-Tg-C3(1)-TAg de cáncer de ^mama3. La inyección de ID de esta solución ablativa permite la orientación de las células epiteliales mamarias de las que surge el cáncer de mama con daños colaterales limitados. La adición de un agente de contraste de rayos X a la solución ablativa permite una mejor comprensión de la efectividad de la solución en la prevención, ya que podemos ver si cada árbol ductal se llena con éxito después de la inyección (Figura 2B). La visualización de las glándulas inyectadas por fluoroscopia inmediatamente después de la inyección refleja lo que probablemente se hará en la clínica para confirmar el llenado exitoso del árbol ductal. La confirmación visual de la entrega de la solución informará mejor si se ha llegado a todas las partes del árbol en tiempo real. Esto podría permitir que se realice una inyección adicional para completar el llenado en ese momento o en una sesión futura. Es de gran importancia que la solución ablativa llegue a todas las partes del árbol ductal para garantizar que se pueda acceder a todas las células epiteliales para matar (Figura 3). Dejar atrás las células epiteliales vivas dentro del árbol permitiría la posibilidad de que el cáncer de mama aún pudiera surgir. La utilización del contraste en las inyecciones de ID para obtener imágenes del éxito de la inyección también podría ser útil para otras formulaciones. La Tabla 1 proporciona solución de problemas y consejos útiles. Otros estudios han descrito protocolos de administración de ID para partículas virales (por ejemplo, AdCre, ARN guía CRISPR), hormonas, compuestos citotóxicos, siRNAs y/o agentes dirigidos en ratones3,16,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37 ^,38, ratas24,32,39,40,41 y conejos42,43,44,45,46,47. Estudios clínicos independientes informaron la canulación exitosa de hasta ocho conductos por mama para la administración local de quimioterapia40,48,49. Visualizar el llenado completo cuando se entregan otras soluciones dirigidas a la prevención o orientadas al tratamiento valdría la pena por razones similares. El conocimiento de que la solución ha llegado a todas las ramas y extremos terminales del árbol será informativo para evaluar la prevención o el tratamiento exitosos.

No tenemos conocimiento de ningún otro método de imagen intraductal en ^ratones33,34 u otros modelos ^animales47 que permitan la alta resolución de las nanopartículas de _TaOx. Cabe destacar que el _TaOx en el árbol ductal murino supera a los agentes de contraste aprobados por la FDA para la ductografía diagnóstica3,16. A medida que continuamos evaluando el procedimiento ablativo de ID por su capacidad para prevenir el cáncer de mama, podremos determinar con mayor precisión de qué glándulas surge el cáncer con la ayuda de datos adicionales proporcionados a través de imágenes después de la entrega de ID. Por ejemplo, se podría determinar si una glándula que solo se llenó parcialmente es más probable que una glándula no inyectada resulte en la formación de tumores, lo que aborda el perfil de seguridad y la preocupación de las inyecciones fallidas en una mujer de alto riesgo. Esta técnica tiene algunas limitaciones. Esta es una técnica de ratón relativamente desafiante que requiere destreza y competencia del operador para manipular y cannular con éxito cada conducto. Cada inyección individual es un evento independiente, por lo que la inyección fallida en una o más glándulas puede comprometer la interpretación del resultado. Dado el tamaño de la glándula mamaria murina y la fragilidad del pezón, la fluoroscopia o una técnica similar de guía de imágenes no está disponible para informar en tiempo real cuándo detener la infusión. Esta guía de imágenes en tiempo real será un requisito para la implementación clínica de la administración local de una solución ablativa.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
AnalyzeDirect v12.0	Calibrador	n/a	Para el procesamiento de imágenes por micro-TC
Carprieve, Carprofeno 50 mg/mL	Allivet	50647	Para el tratamiento antiinflamatorio
Evans blue	Sigma	E2129-50G	Para la visualización por inyección Baño
agua caliente	Toolots	Yidu_HH-S2	Para la preparación de copas de carprofeno
Imaris	Bitplane	n/a	Para el procesamiento de imágenes confocales
MediGel Cupos de sucralosa	ClearH2O	74-02-5022	Para la entrega de carprofeno
Jeringa Modelo 1705 RN, 50μ L	Hamilton	7655-01	Para inyección intraductal
Photoshop 2021	Adobe	n/a	Para el procesamiento de imágenes
Sistema de imágenes Quantum GX2 microCT	Perkin Elmer	CLS149276	Para la adquisición de imágenes micro-CT
Aguja RN de cubo pequeño, calibre 34, personalizado (ángulo de bisel de 12 grados, 0,375 pulgadas, estilo de punta 4)	Hamilton	207434	Para inyección
intraductalMicroscopio estereoscópico serie SZM	AmScope	SM-4TPZ-144	Para inyección intraductal
Colorante alimentario azul estéril	McCormick	930641	Para la visualización de inyección
Solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS)	ThermoFisher	14190250	Para la preparación de soluciones
Pegatinas	DOT Scientific	DOTSCI-C50	Para la preparación de tazas de carprofeno
Sacarosa	Calbiochem	8550-5KG	Para inyección intraductal
Jeringas	Fisher	14-826-79	Para la preparación de vasos de carprofeno
Vortex	VWR	10153-834	Para la preparación de vasos de carprofeno
Bomba(s) de calentamiento/almohadilla(s)	Braintree Scientific	HTP-1500 120V; AP-R 26E	Para inyección intraductal/preparación preoperatoria