Aislamiento y análisis funcional del endotelio arteriolar del parénquima cerebral de ratón

Resumen

La preparación intensiva de "tubos" endoteliales cerebrales intactos de ratón de las arteriolas del parénquima cerebral se ilustra para estudiar la regulación del flujo sanguíneo cerebral. Además, demostramos las fortalezas experimentales de este modelo de estudio endotelial para imágenes de fluorescencia y medición electrofisiológica de vías clave de señalización celular, incluidos los cambios en el [Ca²⁺] intracelular y el potencial de membrana.

Resumen

El flujo sanguíneo cerebral es transmitido por las arterias de resistencia vascular y las arteriolas parenquimatosas aguas abajo. La resistencia vascular en estado estacionario al flujo sanguíneo aumenta con la disminución del diámetro de las arterias a las arteriolas que finalmente se alimentan de los capilares. Debido a su menor tamaño y ubicación en el parénquima, las arteriolas han sido relativamente poco estudiadas y con menos reproducibilidad en los hallazgos que las arterias piales superficiales. En cualquier caso, la estructura y función de las células endoteliales arteriolares, parte integral de la fisiología y etiología de las enfermedades degenerativas crónicas, requiere una amplia investigación. En particular, la evidencia emergente demuestra que la función endotelial comprometida precede y exacerba el deterioro cognitivo y la demencia.

En la microcirculación parenquimatosa, la función del canal K⁺ endotelial es el estímulo más robusto para controlar finamente la propagación de la vasodilatación para promover aumentos en el flujo sanguíneo a áreas de actividad neuronal. Este artículo ilustra un método refinado para aislar recién aislados "tubos" endoteliales intactos y acoplados eléctricamente (diámetro, ~ 25 μm) de arteriolas parenquimatosas del cerebro de ratón. Los tubos endoteliales arteriolares se aseguran durante condiciones fisiológicas (37 °C, pH 7.4) para resolver variables experimentales que abarcan la función del canal K ⁺ y su regulación, incluida la dinámica intracelular de Ca^{2 +} , los cambios en el potencial de membrana y la regulación lipídica de membrana. Una clara ventaja técnica frente al endotelio arterial es la resolución morfológica mejorada de las dimensiones celulares y orgánulos (por ejemplo, mitocondrias), lo que amplía la utilidad de esta técnica. La perfusión cerebral saludable a lo largo de la vida implica una función endotelial robusta en las arteriolas parenquimatosas, vinculando directamente el flujo sanguíneo con el combustible de la actividad neuronal y glial a través de regiones anatómicas precisas del cerebro. Por lo tanto, se espera que este método avance significativamente en el conocimiento general de la fisiología vascular y la neurociencia con respecto al cerebro sano y enfermo.

Introducción

Las arteriolas parenquimatosas suministran directamente oxígeno y nutrientes esenciales en todo el cerebro¹. Mientras interactúan con los capilares, las arteriolas altamente vasoactivas responden a la señalización retrógrada iniciada por los canales iónicos capilares que detectan las señales metabólicas de regiones neuronales específicas². Dado que el parénquima cerebral ha recibido históricamente la mayor parte de la investigación, ahora ha surgido un papel para la disfunción endotelial para aclarar los mecanismos patológicos asociados con diversos trastornos cerebrovasculares que subyacen a la demencia (por ejemplo, accidente cerebrovascular isquémico, enfermedad de Alzheimer)3,4,5,6 . El endotelio es parte integral de la perfusión del cerebro de acuerdo con la heterogeneidad de la genética, la estructura y la función a lo largo de los segmentos vasculares⁷. Las arterias piales han sido ampliamente estudiadas debido a su tamaño relativamente grande, alta resistencia vascular segmentaria y papel en la distribución del flujo sanguíneo al cerebro subyacente ^8,9. Por lo tanto, una mejor comprensión de los mecanismos endoteliales arteriolares probablemente mejorará la comprensión de la regulación del flujo sanguíneo cerebral en la salud y la enfermedad hacia el desarrollo de nuevos regímenes terapéuticos.

La evidencia emergente destaca la importancia de estudiar las arteriolas parenquimatosas en relación con diferentes vías de señalización y enfermedades ^8,10. Sin embargo, este enfoque se ha limitado al uso de arteriola¹¹ presurizada intacta y/o preparaciones de arteriola capilar-parenquimatosa (CaPA)¹². Las células endoteliales arteriolares cerebrales nativas recién aisladas, desprovistas de otros tipos de células y factores de confusión no han sido examinadas, probablemente debido a dificultades técnicas en su aislamiento. En este trabajo se adelanta una técnica previa destacando el aislamiento del endotelio arterial pial¹³ para aislar ahora de forma fiable y reproducible el endotelio de las arteriolas parenquimatosas cerebrales (ancho: ~25 μm, longitud: ~250 μm). Esta técnica ayuda a lograr una resolución óptima de las células acopladas eléctrica y químicamente en su orientación individual y redes celulares.

Las vías clave de interés han incluido la interacción de la señalización intracelular de Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i) y la hiperpolarización del potencial de membrana (V_m)^14,15, integral a la vasodilatación¹⁶, para permitir que la sangre ingrese a los capilares y entregue oxígeno y nutrientes al parénquima activo¹⁷. Estas preparaciones permiten registros electrofisiológicos en tiempo real de canales iónicos, incluidos Ca²⁺ permeante, canales de potencial de receptor transitorio (TRP) y K⁺ y / o imágenes fluorescentes de orgánulos intracelulares dentro de tubos celulares endoteliales en condiciones casi fisiológicas. Esta es una técnica adecuada para investigadores interesados en los mecanismos celulares fisiológicos que gobiernan el control de las células endoteliales del suministro de flujo sanguíneo cerebral al parénquima cerebral. En conjunto, esta técnica ayudará a los investigadores a comprender mejor las vías fundamentales de señalización endotelial y la comunicación en red de las arteriolas incrustadas en el parénquima cerebral, al tiempo que aborda cuestiones relacionadas con la fisiología y la patología cerebrovasculares.

Protocolo

Los experimentadores deben asegurarse de que el uso designado de animales y los protocolos asociados sean aprobados por su Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) y se realicen de acuerdo con la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio" del Consejo Nacional de Investigación (^8ª Edición, 2011) y las pautas de ARRIVE. El IACUC de la Universidad de Loma Linda y la Universidad de Arizona han aprobado todos los protocolos utilizados para este manuscrito para ratones C57BL / 6N y 3xTg-AD (machos y hembras; rango de edad: 2-30 meses). Vea la Figura 1 como una visión general del aislamiento y examen de los tubos endoteliales arteriolares recién aislados de las arteriolas parenquimatosas del cerebro de ratón.

1. Materiales y equipos

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para todos los reactivos y materiales necesarios para este protocolo. Además, también se pueden consultar manuales y sitios web asociados con los respectivos proveedores según sea necesario. Anteriormente se han proporcionado ilustraciones de estaciones de disección y aparatos experimentales¹³.

1. Cámara de flujo
   1. Sujete una cámara de superfusión con una cubierta de vidrio a una plataforma compuesta de aluminio anodizado. Asegure la plataforma con la cámara en un escenario de microscopio de aluminio.
   2. Coloque un micromanipulador que sostenga una pipeta de fijación en cada extremo de la plataforma en el escenario del microscopio de aluminio.
      NOTA: Si es necesario, utilice un aparato de etapa transferible con una unidad de cámara de flujo para mover un tubo endotelial aislado y seguro de un aparato de microscopio a otro para la experimentación.
2. Microscopios
   1. Use estereomicroscopios (rango de aumento de 5x a 50x) y fuentes de luz de fibra óptica para los procedimientos de disección.
   2. Para el aislamiento de tubos endoteliales, utilice un equipo de microscopio invertido equipado con objetivos compatibles con contraste de fase o contraste de interferencia diferencial (DIC) (10x, 20x y 40x) y una etapa de aluminio.
   3. Tenga un controlador de bomba de microjeringa listo junto al aparato dedicado a aislar tubos endoteliales de vasos sanguíneos parcialmente digeridos.
   4. Configure el aparato experimental organizando un microscopio invertido (objetivos: 4x, 10x, 20x, 40x y 60x) y una etapa manual de aluminio en una mesa de aislamiento de vibraciones.
3. Aparato de control intracelular V_m
   1. Conecte el electrómetro a un cabezal compatible. Use accesorios, como un generador de funciones y un estimulador, para los protocolos que requieren inyección de corriente.
   2. Conecte las salidas del amplificador a un sistema digitalizador de datos, osciloscopio y monitores de línea de base audibles. Asegure el electrodo de baño de referencia (pellet Ag/AgCl) cerca de la salida de la cámara de flujo.
   3. Ensamble un sistema fotométrico con componentes integrados de una interfaz de sistema de fluorescencia, lámpara de arco de alta intensidad y fuente de alimentación, hiperinterruptor, tubo fotomultiplicador (o PMT) y cámara para medir [Ca²⁺]_i en células endoteliales.
   4. Ensamble un controlador de temperatura equipado con un calentador en línea para elevar y mantener una temperatura fisiológica (37 ° C) durante todo el experimento.
   5. Ensamble una plataforma multicanal conectada a un controlador de válvula con una válvula de control de flujo en línea para controlar la entrega de soluciones a los tubos endoteliales asegurados en la cámara.
4. Micropipetas y electrodos afilados
   NOTA: El experimentador necesitará un extractor de vidrio electrónico y una microtorra para preparar pipetas de trituración y fijación.
   1. Para separar el tubo endotelial del segmento arteriolar parcialmente digerido, prepare pipetas de trituración pulidas térmicamente (diámetro interno de la punta: 30-50 μm) de capilares de vidrio de borosilicato.
   2. Para asegurar el tubo endotelial en la cámara de superfusión, prepare pipetas de fijación pulidas térmicamente con un extremo esférico embotado (diámetro exterior: 50-70 μm) preparado a partir de capilares de vidrio de borosilicato de pared delgada.
   3. Para registrar V_m de una celda endotelial, prepare electrodos afilados con una resistencia de punta de ~ 150 ± 30 MΩ de capilares de vidrio usando solo el extractor de vidrio.

2. Soluciones y medicamentos

1. Solución salina fisiológica (PSS)
   1. Prepare un mínimo de 1 L de PSS usando 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico ácido (HEPES) y 10 mM de glucosa.
   2. Preparar las soluciones necesarias que carezcan de CaCl₂ (cero Ca²⁺ PSS) para la disección de arteriolas cerebrales y el aislamiento del tubo endotelial.
      NOTA: Preparar todas las soluciones en ultrapuro desionizado H₂O, seguido de filtración (0,22 μm). Asegúrese de que el producto final contiene un pH 7.4 con osmolalidad entre 290 y 300 mOsm.
2. Albúmina sérica bovina (BSA, 10%)
   1. Disolver 1 g del polvo de BSA liofilizado en un vaso de precipitados de 10 ml de ca²⁺ PSS cero. Cubra el vaso de precipitados y deje pasar al menos 2 h con agitación lenta para que el BSA se disuelva.
   2. Solución de filtro utilizando una jeringa de 10 ml más un filtro de 0,22 μm y preparar alícuotas de 1 ml para almacenar a -20 °C.
3. Solución de disección
   1. Agregue 500 μL de BSA (10%) a 49.5 mL de cero Ca²⁺ PSS para un volumen total de 50 mL.
   2. Transfiera la solución a una placa de Petri para disecciones arteriolares.
4. Solución de disociación
   1. Añadir 5 μL de solución de CaCl₂ (1 M) y 500 μL de BSA (10%) a 49,5 mL de cero Ca²⁺ PSS para un volumen total de 50 mL. Incubar la solución a temperatura ambiente durante al menos 1 h.
5. Enzimas
   1. Preparar 1 ml de solución de digestión con 100 μg/ml de papaína, 170 μg/ml de ditioeritritol, 250 μg/ml de colagenasa (mezcla tipo H) y 40 μg/ml de elastasa.
      NOTA: Las actividades enzimáticas pueden variar, aunque los protocolos exitosos probablemente requerirán las siguientes actividades enzimáticas: ≥ 10 unidades / mg para la papaína, ≥ 1 unidad / mg para la colagenasa y ≥ 5 unidades / mg para la elastasa.
6. Fura-2 y agentes farmacológicos
   1. Preparar fura-2 AM stock en dimetilsulfóxido (DMSO; 1 mM). Preparar 500 μL de concentración de trabajo (10 μM) añadiendo 5 μL de la culata a 495 μL de PSS para la carga.
   2. Preparar al menos 50 ml de concentraciones de trabajo de agentes farmacológicos en PSS o DMSO, según corresponda.
7. Solución conductora
   1. Preparar 2 M KCl disolviendo KCl en H₂O desionizado (7.455 g de KCl en 50 mL de H₂O). Pase la solución a través de una jeringa con un filtro de 0,22 μm antes de rellenar los electrodos afilados.
8. Rastreadores de orgánulos fluorescentes y anticuerpos
   1. Prepare los rastreadores de membrana plasmática u organelares (por ejemplo, núcleo, retículo endoplásmico) en la solución salina fisiológica adecuada de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   2. Prepare anticuerpos primarios y secundarios de acuerdo con las instrucciones del fabricante en la solución de sal fisiológica adecuada.

3. Disección y aislamiento de arteriolas cerebrales de ratón

NOTA: Se deben usar estereomicroscopios y herramientas de microdisección afiladas (por ejemplo, pinzas de punta fina, tijeras de disección estilo Vannas) para la ampliación de muestras (hasta 50x) en todos estos procedimientos de disección.

1. Aislamiento del cerebro del ratón
   1. Anestesiar un ratón de laboratorio estándar (por ejemplo, C57BL/6, 3xTg-AD; 2-30 meses de edad, macho o hembra) utilizando inhalación de isoflurano (3% durante 2-3 min), seguido de decapitación inmediata con tijeras afiladas o guillotina según la aprobación de la IACUC. Coloque la cabeza del ratón en una placa de Petri (diámetro 10 cm, profundidad 1,5 cm) que contenga una solución de disección fría (4 °C).
   2. Mientras se ve bajo un estereomicroscopio, retire la piel y el vello sobre el cráneo y lave el exceso de sangre con una solución de disección fría. Usando las puntas de las tijeras de disección estándar (por ejemplo, cuchillas de 24 mm), haga una incisión comenzando con el hueso occipital y extendiéndose a través del hueso nasal del cráneo. Use fórceps de punta gruesa para abrir cuidadosamente el cráneo a lo largo de la incisión y separe el tejido conectivo (membrana meníngea) para aislar el cerebro que contiene un círculo de Willis intacto.
   3. Lave el cerebro aislado con una solución de disección fría en un vaso de precipitados o una placa de Petri para eliminar la sangre restante de la superficie del cerebro. Coloque el lado ventral del cerebro boca arriba en una cámara que contenga solución de disección en frío para el aislamiento de las arteriolas parenquimatosas (Figura 2A).
2. Aislamiento de arteriolas parenquimatosas
   NOTA: Las arteriolas que surgen de las arterias cerebrales medias (MCA) e incrustadas en el parénquima cerebral se eligen para este protocolo. Las arteriolas se aíslan como se describió anteriormente¹¹, con modificación.
   1. Use pasadores de acero (diámetro: 0,2 mm, longitud: 11 a 12 mm) para asegurar el cerebro aislado en una solución de disección en frío en una placa de Petri que contenga un recubrimiento de polímero de silicio con infusión de carbón (profundidad ≥ 50 cm).
   2. Usando tijeras de disección afiladas y alineadas, corte un rectángulo de tejido cerebral (longitud: 5 mm, ancho: 3 mm) (Figura 2B) alrededor del MCA mientras se asegura de que la parte superior del segmento de tejido esté más allá del punto de ramificación del Círculo de Willis. Corte otro rectángulo de tejido cerebral del otro hemisferio del cerebro para acceder a más arteriolas si es necesario.
   3. Asegure el segmento de tejido cerebral separado en el plato con el MCA mirando hacia arriba (distal desde el Círculo de Willis) usando pasadores de acero (diámetro: 0.1 mm, longitud: 13 a 14 mm). Haga con cuidado una incisión poco profunda cerca de los pasadores para quitar la pia con pinzas pequeñas, pelando suavemente de un extremo hacia el otro (Figura 2C). Retire la pia del otro segmento de tejido para acceder a más arteriolas si es necesario. Asegure cuidadosamente la pia aislada con arteriolas parenquimatosas ramificadas de MCA en el plato con los alfileres, y diseccione las arteriolas parenquimatosas (Figura 2D), asegurando que las arteriolas no estén dañadas.
      NOTA: Si las arteriolas no se extraen fácilmente con la pia del parénquima, use fórceps finos y profundice en el cerebro, comenzando en el punto de la rama MCA del Círculo de Willis. Localice la arteriola, afloje cuidadosamente el tejido alrededor de las arteriolas (Figura 2E) y extraiga suavemente la arteriola fuera del parénquima, sosteniendo el extremo superior de la arteriola (Figura 2F). Se pueden aislar múltiples arteriolas (longitud: ~ 1.5-2 mm) de un rectángulo de tejido cerebral.
   4. Asegúrese de que la arteriola esté limpia sin tejido adherido a ella, y corte las ramas distales restantes (Figura 3A). Use esta arteriola limpia e intacta para la digestión enzimática. Alternativamente, corte cada arteriola en dos trozos (longitud: 0.75-1 mm) para la digestión enzimática para la preparación de tubos endoteliales si lo desea.

4. Digestión de arteriolas parenquimatosas y preparación de tubos endoteliales

1. Disposición de equipos y pipetas
   NOTA: El aislamiento de los tubos endoteliales arteriales del cerebro ha sido descrito previamente^13,18. El protocolo actual incorpora modificaciones para el aislamiento del endotelio de las arteriolas parenquimatosas (intracerebrales). Múltiples arteriolas y / o pedazos de arteriolas se pueden usar juntos para la digestión enzimática.
   1. Montar el aparato de trituración¹³ para la preparación de tubos endoteliales utilizando una etapa de aluminio que soporta una cámara y micromanipuladores. Montar un microscopio equipado con objetivos (5x-60x) y una cámara conectada a un monitor de ordenador. Asegure una microjeringa con un controlador de bomba junto al escenario y la muestra.
   2. Asegure una pipeta de trituración rellena con aceite mineral sobre el pistón de la microjeringa. Use la microjeringa con el controlador de la bomba para retirar la solución de disociación en la pipeta de trituración (~ 130 nL) en la parte superior del aceite mineral mientras tiene cuidado de evitar burbujas de aire en la pipeta.
2. Digestión parcial de segmentos arteriolares
   1. Coloque los segmentos arteriolares intactos en 1 ml de solución de disociación en un tubo de vidrio de 10 ml que contenga 100 μg/ml de papaína, 170 μg/ml de ditioeritritol, 250 μg/ml de colagenasa y 40 μg/ml de elastasa. Incubar segmentos arteriolares a 34 °C durante 10-12 min.
   2. Después de la digestión, reemplace la solución enzimática con 3-4 ml de solución de disociación fresca a temperatura ambiente.
3. Aislamiento del tubo endotelial arteriolar
   NOTA: Después de la digestión y el reemplazo de la solución enzimática, transfiera uno o varios segmentos parcialmente digeridos a la solución de disociación en una cámara de superfusión conectada a una plataforma móvil. Mientras visualiza con un aumento de 100x a 200x, seleccione un segmento de vaso parcialmente digerido pero ininterrumpido y concéntrese en él bajo el microscopio.
   1. Coloque la pipeta de trituración unida con el inyector de microjeringa en la solución de disociación en la cámara y colóquela cerca de un extremo del segmento del vaso digerido. Establezca una velocidad dentro del rango de 1-3 nL / s en el controlador de la bomba para una trituración suave.
   2. Mientras mantiene un aumento de 100x a 200x, retire el segmento arteriolar en la pipeta y luego expulse para disociar las células adventicias y del músculo liso (Figura 3B). Triturar el segmento del vaso hasta que todas las células del músculo liso se disocien, y solo las células endoteliales permanecen como un "tubo" intacto.
      NOTA: Si es necesario durante la trituración, use cuidadosamente fórceps de punta fina para eliminar la adventicia disociada y la lámina elástica interna del tubo endotelial. Por lo general, solo unos pocos ciclos de trituración producen un tubo endotelial intacto.
   3. Utilice micromanipuladores para asegurar cada extremo del tubo endotelial en la cubierta de vidrio de la cámara con pipetas de fijación de vidrio de borosilicato (Figura 3C, D).
4. Asegurar el tubo endotelial arteriolar
   1. Reemplace la solución de disociación con una solución de superfusión (PSS que contiene 2 mM CaCl₂) mientras se asegura de que el material no endotelial se lave fuera de la cámara.
   2. Transfiera el tubo endotelial asegurado en la plataforma móvil a la plataforma de microscopio diseñada para la superfusión continua y las grabaciones / imágenes intracelulares o fluorescentes.
   3. Aplicar la entrega continua de PSS durante el experimento. Ajuste manualmente el caudal (5-7 ml/min) a lo largo del experimento utilizando la válvula de control de flujo en línea, consistente con el flujo laminar, al tiempo que hace coincidir la alimentación del flujo de solución con la extensión de la succión al vacío. Permita ≥5 min de flujo de PSS a la cámara para la superfusión del tubo endotelial antes de adquirir datos de fondo y / o carga de tinte.

5. Utilización de tubos endoteliales arteriolares para el examen de la fisiología celular

NOTA: Los tubos endoteliales arteriolares aislados y asegurados se pueden utilizar para registros intracelulares de dinámica [Ca²⁺]_i y V_m utilizando fotometría y electrofisiología de electrodos nítidos, respectivamente, como se ilustró anteriormente¹³ (Figura 4). [Ca²⁺] _i y V_m se pueden medir como variables experimentales separadas o combinadas según sea necesario¹³ (Figura 4). Sin embargo, los tubos endoteliales arteriolares son más delicados que el endotelio arterial, y el tiempo de experimentación no debe exceder de 1 h.

1. Medición de [Ca²⁺]_i
   1. Encienda el equipo y el software para las grabaciones de [Ca²⁺]_i mientras mantiene la superfusión continua a un caudal de 5-7 ml/min.
   2. Cargue el tubo endotelial con el tinte Ca²⁺ Fura-2 AM durante 30 min a temperatura ambiente. Lave las células con solución de superfusión durante otros 20-30 minutos mientras eleva gradualmente la temperatura del baño a 37 ° C. Mantenga la temperatura a 37 °C durante todo el experimento.
   3. Ajuste manualmente la ventana de imágenes utilizando un software de fotometría para enfocar ~ 20 células endoteliales (Figura 4A). En ausencia de luz, encienda el PMT en la interfaz de fluorescencia y comience la adquisición de [Ca²⁺]_i excitando Fura-2 alternativamente (≥10 Hz) a 340 nm y 380 nm mientras recoge la emisión de fluorescencia a 510 nm. Una vez que se establece un registro basal estable de [Ca²⁺]_i , aplicar agentes farmacológicos (por ejemplo, agonistas del receptor purinérgico) por objetivo experimental (Figura 4B).
2. Medición de V_m
   1. Encienda el equipo y el software para grabaciones de V_m y establezca la velocidad de adquisición de datos (≥10 Hz) mientras mantiene la superfusión continua a un caudal de 5-7 ml / min. Aumente gradualmente la temperatura del baño a 37 ° C y manténgala hasta el final del experimento.
   2. Tire de un electrodo afilado con un capilar de vidrio de borosilicato, rellene con 2 M KCl y asegúrelo sobre un alambre de plata recubierto de cloruro en el soporte de la pipeta unido a un electrómetro, que a su vez, está sostenido por un micromanipulador.
   3. Mientras visualiza a través del objetivo 4x, use un micromanipulador para colocar cuidadosamente la punta del electrodo afilado justo sobre una celda del tubo endotelial arteriolar en el PSS que fluye en la cámara.
   4. Aumente gradualmente la ampliación a 400x y reposicione la punta del electrodo según sea necesario.
   5. Usando el micromanipulador, inserte suavemente la punta de un electrodo afilado en una de las celdas del tubo endotelial y comience a registrar V_m usando un electrómetro (Figura 4A).
   6. Una vez que el V_m en reposo endotelial sea estable (−30 a −40 mV), aplicar los agentes farmacológicos deseados por objetivo experimental (Figura 4C).

6. Imágenes celulares

NOTA: Los tubos endoteliales asegurados en la cámara de la plataforma móvil también se pueden utilizar para imágenes microscópicas tanto en condiciones vivas como fijas¹⁹ utilizando fluorescencia estándar o microscopía confocal. También se puede aplicar inmunohistoquímica con diferentes anticuerpos para receptores y canales iónicos como se describió anteriormente²⁰.

1. Cargue el tubo endotelial con el rastreador de fluorescencia para la membrana plasmática o el orgánulo deseado (por ejemplo, núcleo, retículo endoplásmico) a 37 °C durante 15-30 min.
2. Lave las células con PSS de superfusión fresca e imagine células vivas bajo el microscopio en la longitud de onda de excitación de los colorantes respectivos (Figura 4D, E).
   NOTA: La inmunohistoquímica se puede realizar en este modelo de tubo utilizando anticuerpos de interés.

Resultados

Una demostración del protocolo se muestra en la Figura 1 con los pasos de disección arteriolar y aislamiento del tubo endotelial como la Figura 2 y la Figura 3, respectivamente. Aquí, la función endotelial se evaluó midiendo [Ca²⁺]_i y V_m utilizando fotometría Fura-2 y electrofisiología de electrodos afilados (Figura 4A) en respuesta a un agente farmacológico [2-metiltioa...

Discusión

La creciente evidencia sugiere que la enfermedad cerebrovascular (ECV), el envejecimiento y la enfermedad de Alzheimer están fuertemente correlacionados y son un tema actual de la investigación de la demencia 4,8,14,21. Por lo tanto, es obvio que los estudios de la red cerebrovascular tendrían un amplio impacto en la salud, al tiempo que requerirían una investigación exhaustiva continua durante...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Amplificadores	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE. UU.	Axoclamp 2B & Monitores de referencia Axoclamp 900A
Audible	Ampol US LLC, Sarasota, FL, EE. UU. &	nbsp; Enfriador de baño BM-A-TM
(Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Capilares de vidrio de borosilicato (fijación)	Warner Instruments	G150T-6
Capilares de vidrio de borosilicato (electrodos afilados)	Warner Instruments	GC100F-10
Capilares de vidrio de borosilicato (trituración)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, EE. UU.	1B100-4
BSA: Albúmina sérica bovina	Sigma	A7906
CaCl2: Cloruro de calcio	Sigma	223506
colagenasa (mezcla tipo H)	Sigma	C8051
Cubierta de vidrio (2.4  y tiempos;   5.0  cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Digitalizador	Dispositivos moleculares, Sunnyvale, CA, EE. UU.	Plato de disección Digidata 1550A
(Petri de vidrio con fondo de Sylgard de carbón)	Instrumentación de sistemas vivos, St. Albans City, VT, EE. UU.	DD-90-S-BLK
Dithioerythritol	Sigma	D8255
DMSO: Dimetilsulfóxido	Sigma	D8418
Elastasa (páncreas porcino)	Sigma	E7885
Rastreador de retículo endoplásmico (ER-Tracker Red, BODIPY TR glibenclamida)	ThermoFisher Scientific	E34250
Fuentes de luz de fibra óptica	Schott, Maguncia, Alemania & KL200, Válvula de control de flujo Zeiss	Fostec 8375
Warner	Instruments	FR-50
Interfaz del sistema de fluorescencia, lámpara ARC y fuente de alimentación, hiperinterruptor y PMT	Dispositivos moleculares, Sunnyvale, CA, EE. UU.	Pinzas de los sistemas
(punta fina, afiladas)	FST	Dumont #5 & Generador de funciones Dumont #55
	EZ Digital, Seúl, Corea del Sur	FG-8002
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.	F14185
Glucosa	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.)	G7021
HCl: Ácido clorhídrico	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, EE. UU.)	A466250
Cabeceras	Molecular Dispositivos	HS-2A & HS-9A
HEPES: (4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico Acidor)	Sigma	H4034
Calentador de solución en línea	Warner Instruments	SH-27B
KCl: Cloruro de potasio	Sigma	P9541
MgCl2: Cloruro de magnesio	Sigma	M2670
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, EE. UU	MF-900
Micromanipulador	Siskiyou
(digital)	Sutter Instruments, Novato, CA, EE. UU	P-97 o P-1000
(Nikon-invertido)	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, EE. UU	Ts2
(Nikon-invertido)	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor) y 40X (Plan Fluor)
Plataforma de microscopio (aluminio anodizado; diámetro, 7,8   cm)	Warner Instruments	PM6 o PH6
Etapa de microscopio (aluminio)	Siskiyou, Grants Pass, OR, EE. UU	8090P
	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, EE. UU	SYS-MICRO4
MTA: 2-metiltioadenosina difosfato sal trisódica	Tocris	1624
NaCl: Cloruro de sodio	Sigma	S7653
NaOH: hidróxido de sodio	Sigma	S8045
tinción nuclear (reactivo NucBlue Live ReadyProbes; Hoechst 33342)	Osciloscopio ThermoFisher Scientific	R37605
	Tektronix, Beaverton, Oregón, EE. UU.	nbsp; TDS 2024B
Papain	Sigma	P4762
Objetivos de contraste de fase	Nikon Instruments Inc	( Ph1 DL; 10X & 20X)
Tinción de membrana plasmática (CellMask Deep Red)	ThermoFisher Scientific	C10046
Cámara de superfusión de plexiglás	Warner Instruments, Camden, CT, EE. UU	Tijeras RC-27
(hojas de 3 mm y 7 mm)	Fine Science Tools (o FST), Foster City, CA, EE. UU	Moria MC52 y 15000-00
(estilo Vannas; 9.5  mm & 3  hojas de mm)	World Precision Instruments	555640S, 14364
Microscopios estereoscópicos	Zeiss, NY, EE. UU	Stemi 2000 & 2000-C
Filtro de jeringa (0.22 y micro; m)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Controlador de temperatura (doble canal)	Sistema	Warner Instruments TC-344B o C
	Warner Instruments	VC-6
Mesa de aislamiento de vibraciones Fabricación	técnica, Peabody, MA, EE. UU. &	nbsp; Micro-g