Medición del contenido de hierro no hemo en tejidos utilizando un ensayo colorimétrico basado en batofenantrolina

El hierro es un micronutriente esencial, necesario para la función de las proteínas involucradas en procesos biológicos cruciales como el transporte de oxígeno, la producción de energía o la síntesis de ADN. Es importante destacar que tanto el exceso de hierro como la deficiencia de hierro son altamente perjudiciales para la salud humana, y los niveles de hierro en los tejidos están finamente regulados. La absorción anormal de hierro en la dieta, las dietas deficientes en hierro, las transfusiones de sangre repetidas y la inflamación crónica son causas comunes de trastornos asociados con el hierro que afectan a miles de millones de personas en todo el ^mundo1,2,3.

Los modelos animales experimentales de sobrecarga o deficiencia de hierro han sido fundamentales para avanzar en nuestro conocimiento de los mecanismos implicados en la regulación sistémica y celular de la homeostasis del ^hierro4. A pesar de los progresos sustanciales realizados durante las dos últimas décadas, muchos aspectos clave siguen siendo difíciles de alcanzar. En los próximos años, la medición precisa de los niveles totales de hierro en los tejidos animales seguirá siendo un paso crítico para avanzar en la investigación en el campo de la biología del hierro.

La mayoría de los laboratorios cuantifican el hierro tisular con espectroscopia de absorción atómica (AAS), espectrometría de masas de plasma acoplada inductivamente (ICP-MS) o un ensayo colorimétrico basado en la reacción del hierro no hemo con un reactivo de batofenantrolina. Este último se basa en el método original descrito por Torrance y Bothwell hace más de 50 ^años5,6. Si bien posteriormente se desarrolló una variación de este método empleando ferrozina como alternativa a la batofenantrolina7, este último sigue siendo el reactivo cromogénico más citado en la literatura.

El método de elección a menudo depende de la experiencia y la infraestructura disponibles. Si bien AAS e ICP-MS son más sensibles, el ensayo colorimétrico sigue siendo ampliamente utilizado porque presenta las siguientes ventajas importantes: i) excluye la contribución de hierro hemo derivado de la hemoglobina contenida en los glóbulos rojos; ii) no requiere habilidades analíticas sofisticadas o equipos altamente costosos; y iii) el ensayo original basado en cubeta se puede adaptar a un formato de microplaca, lo que permite un mayor rendimiento de la muestra. El enfoque colorimétrico presentado en este trabajo se utiliza rutinariamente para cuantificar alteraciones en los niveles de hierro no hemo tisular en una variedad de modelos animales experimentales de sobrecarga o deficiencia de hierro, desde roedores hasta peces y moscas de la fruta. Aquí, se proporciona un protocolo para la medición del contenido de hierro no hemo en los tejidos animales, utilizando un ensayo colorimétrico simple, bien establecido que la mayoría de los laboratorios deberían encontrar fácil de implementar.

Los ratones C57BL/6 fueron comprados comercialmente y los ratones con hepcidina nula (Hamp1^−/−) sobre un fondo C57BL/⁶⁸ fueron un amable regalo de Sophie Vaulont (Institut Cochin, Francia). Los animales fueron alojados en la instalación de animales i3S en condiciones específicas libres de patógenos, en un ambiente controlado por la temperatura y la luz, con libre acceso a chow y agua estándar para roedores. La lubina europea (Dicentrarchus labrax) se compró en una piscifactoría comercial y se alojó en las instalaciones de animales del ICBAS, en un entorno controlado por la temperatura y la luz, y se alimentó diariamente ad libitum con alimento estándar para lubinas. Todos los procedimientos que involucran animales vertebrados fueron aprobados por el Comité de Ética Animal i3S y la autoridad nacional, Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV). La información sobre reactivos comerciales, equipos y animales se enumera en la Tabla de materiales.

1. Preparación de la solución

NOTA: Manipule y prepare todos los reactivos y soluciones con cristalería sin hierro o artículos de plástico desechables. No permita que los materiales metálicos de laboratorio (por ejemplo, espátulas de acero inoxidable) entren en contacto con ningún reactivo o solución, debido al riesgo de contaminación por hierro. Asegúrese de que cualquier cristalería reutilizable esté libre de hierro. Lave los materiales con el detergente de laboratorio apropiado durante 30-60 min, enjuague con agua desionizada, remoje durante la noche en una solución de ácido nítrico al 37% diluida 1: 3 con agua desionizada, enjuague nuevamente con agua desionizada y deje secar.

1. Mezcla ácida: Agregue 10 g de ácido tricloroacético a 82.2 ml de ácido clorhídrico al 37% en una botella de vidrio, disuelva completamente y ajuste el volumen final a 100 ml con agua desionizada. Agitar antes de usar. Alternativamente, use solo ácido clorhídrico al 37% para la digestión de los tejidos.
   NOTA: La solución es estable durante al menos 2 meses cuando se almacena en botellas de reactivo de vidrio marrón oscuro.
   PRECAUCIÓN: El ácido clorhídrico y el ácido tricloroacético son corrosivos, y las formas concentradas liberan vapores ácidos tóxicos. Use prendas protectoras, guantes resistentes a los productos químicos y gafas de salpicaduras químicas en todo momento cuando manipule ácidos. Evite inhalarlos y siempre manipule los ácidos mientras está debajo de una campana de humos.
2. Acetato de sodio saturado: Agregue 228 g de acetato de sodio anhidro a 400 ml de agua desionizada en una botella de vidrio y agite durante la noche a temperatura ambiente. Deje que la solución descanse y precipite durante un día. Si no se produce precipitación, continúe agregando pequeñas cantidades de acetato de sodio. Guarde la solución en una botella de vidrio.
3. Reactivo de cromógeno: Para preparar 1 ml de reactivo de cromógeno, agregue 1 mg de sal disódica de ácido disódico disulfónico de 4,7-difenil-1,10-fenantrolina a 500 μL de agua desionizada y 10 μL de ácido tioglicólico concentrado (100%) y disuelva completamente. Enrasar el volumen final a 1 mL con agua desionizada.
   NOTA: Prepare tanto reactivo de cromógeno como sea necesario. La solución es estable durante 1 mes cuando está protegida de la luz.
4. Reactivo de cromógeno de trabajo (WCR): Agregue 1 volumen del reactivo de cromógeno a 5 volúmenes de acetato de sodio saturado y 5 volúmenes de agua desionizada.
   NOTA: Esta solución debe prepararse recién hecha el día de su uso.
5. Solución estándar de hierro en stock: Para preparar una solución de hierro de 20 mM, coloque 111,5 mg de polvo de hierro carbonilo en un matraz aforado de 250 ml que contenga 5.480 μL de ácido clorhídrico al 37%. Dejar disolver durante la noche a temperatura ambiente (o incubar en un baño de agua hirviendo). Luego, haga la solución a un volumen final de 100 ml con agua desionizada.
   NOTA: La solución estándar se puede mantener indefinidamente cuando se almacena en un recipiente herméticamente sellado.
6. Solución estándar de hierro de trabajo (WISS): Agregue 13.5 μL de ácido clorhídrico al 37% a 500 μL de agua desionizada. Añadir 10 μL de la Solución Estándar de Hierro Stock y constituir el volumen final a 1 mL con agua desionizada (11,169 μg de Fe/mL, 200 μM; medido por AAS).
   NOTA: La solución de trabajo debe prepararse recién hecha el día de su uso.

2. Secado de muestras

1. Corte una muestra de tejido que pese 10-100 mg con una cuchilla de bisturí. Péselo con precisión en una balanza analítica / de precisión sobre una pequeña pieza de parafilm (Fresh Weight).
2. Usando pinzas de plástico, coloque el trozo de tejido en una placa de 24 pocillos (sin deslizar para permitir la evaporación del agua) y déjelo secar en una incubadora estándar a 65 ° C durante 48 h.
3. Alternativamente, use un horno de digestión por microondas de laboratorio para secar muestras de tejido. Usando pinzas de plástico, coloque el pedazo de tejido pesado en una taza de teflón sin hierro y séquelo en el microondas. Establezca los parámetros de funcionamiento de acuerdo con el manual de instrucciones del instrumento.
   NOTA: Como referencia, los parámetros de funcionamiento para el secado de muestras de hígado utilizando el horno de digestión específico (ver Tabla de Materiales) se muestran en la Tabla 1.
4. Usando pinzas de plástico, coloque cada pieza seca de tejido sobre una pequeña pieza de parafilm dentro de una balanza analítica / de precisión y pésela con precisión (peso seco).

3. Digestión ácida de la muestra

1. Usando pinzas de plástico, transfiera cada pieza seca de tejido a un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml.
2. Agregue 1 ml de la mezcla ácida y cierre el tubo de la microcentrífuga. Prepare un ácido en blanco de la misma manera, excepto que se omita el tejido.
   PRECAUCIÓN: La mezcla ácida es corrosiva y libera vapores tóxicos. Use prendas protectoras, guantes resistentes a los productos químicos y gafas de salpicaduras químicas cuando manipule la mezcla ácida. Evite respirarlo y siempre manipularlo mientras está debajo de una campana de humos.
3. Digiera los tejidos incubando los tubos de la microcentrífuga en una incubadora a 65 °C durante 20 h.
4. Después de enfriar a temperatura ambiente, transfiera 500 μL del extracto de ácido transparente (amarillo) (sobrenadante) a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml utilizando una micropipeta equipada con puntas de plástico. Si no es posible obtener un sobrenadante claro, realice un giro de centrifugación corto.
   PRECAUCIÓN: El sobrenadante es altamente ácido. Use prendas protectoras, guantes resistentes a los productos químicos y gafas de salpicaduras químicas cuando manipule los sobrenadantes. Siempre manipularlos mientras está debajo de una campana de humos.
   NOTA: En este punto, los extractos ácidos pueden usarse inmediatamente para el ensayo colorimétrico o congelarse a -20 ° C para su uso posterior. Descongelar completamente las muestras congeladas a temperatura ambiente y vórtice antes de su uso.

4. Desarrollo del color

1. Preparar las reacciones cromogénicas como se indica en la Tabla 2 en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml o, para un mayor rendimiento, directamente en las microplacas de poliestireno transparentes y sin tratar de fondo plano, de 96 pocillos. Prepare todas las reacciones (ácido en blanco, estándar y muestra) al menos por duplicado.
2. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min.

5. Lectura de absorbancia

1. Mida la absorbancia de la muestra en un espectrofotómetro o lector de placas a una longitud de onda de 535 nm contra una referencia de agua desionizada. Las placas se pueden leer sin deslizar o con tapa. En el estuche con tapa, elimine cualquier condensación formada debido a la liberación de vapores ácidos de la tapa justo antes de la medición para evitar posibles interferencias con la lectura de absorbancia.
   NOTA: La absorbancia óptica del ácido en blanco leído contra agua desionizada (referencia) debe ser inferior a 0,015; la absorbancia óptica del estándar y las muestras debe estar entre 0,100 y 1,000. Para muestras con un contenido de hierro muy alto o muy bajo, puede ser necesario ajustar los volúmenes de extracto ácido (sobrenadante) y _diH2O (Tabla 2): si la absorbancia es mayor que 1.0, use un volumen de muestra (sobrenadante) más pequeño; cuando la absorbancia sea inferior a 0,1, utilice un volumen mayor del sobrenadante. El volumen de la muestra (Vsmp) se tiene en cuenta al calcular el contenido de hierro _tisular de cada muestra (consulte el paso 6).

6. Cálculo del contenido de hierro tisular

1. Calcule el contenido de hierro en tejidos no hemo con la siguiente ecuación:
   Hierro tisular (μg/g de tejido seco) =
   _AT = absorbancia de la muestra de prueba
   _AB = absorbancia del ácido en blanco
   _AS = absorbancia del estándar
   _Fes = concentración de hierro de WISS (μg Fe/ml)
   W = peso del tejido seco (g)
   _Vsmp = volumen de muestra (volumen variable de sobrenadante en la Tabla 2 convertido a mL)
   _Vf = volumen final de la mezcla ácida después de la incubación nocturna a 65 °C (correspondiente al volumen ácido más el volumen de tejido seco en ml; si los pesos de la muestra no difieren significativamente, supongamos un volumen constante ≈ 1 ml)
   _Vstd = volumen estándar de hierro (volumen de WISS en la Tabla 2 convertido a mL)
   _Vrv = volumen de reacción final (Volumen total en la Tabla 2 convertido a mL)

Comparación de cubeta versus microplacas de 96 pocillos
La medición del hierro tisular no hemo por reacción con un reactivo de batofenolantrolina descrito originalmente por Torrance y Bothwell5,6 se basa en el uso de un espectrofotómetro para la lectura de la absorbancia. Por lo tanto, los volúmenes empleados en la reacción cromática son compatibles con el tamaño de una cubeta de espectrofotómetro regular. El presente trabajo describe un método de adaptación en el que las reacciones cromáticas se preparan directamente en una microplaca de 96 pocillos para la medición de la absorbancia en un lector de microplacas, lo que requiere volúmenes de reactivos más pequeños y permite un mayor rendimiento.

Para comparar la sensibilidad de ambos enfoques, se preparó inicialmente una dilución en serie de la solución estándar de hierro de trabajo (WISS), y las reacciones cromáticas se ensamblaron en tubos de 1,5 ml o en placas de 96 pocillos, como se indica en la Tabla 2. La absorbancia se midió en un espectrofotómetro (con cubeta) o en un lector de microplacas, respectivamente. Las curvas estándar representativas generadas con los dos enfoques se representan en la Figura 1A. En ambos casos, la linealidad fue muy alta (r2 = 0,9996 y r2 = 0,9997 para microplaca y cubeta, respectivamente) en las concentraciones de hierro ensayadas.

Cabe destacar que se utilizó un WISS que contenía 11,169 μg de Fe/ml. Los datos actuales muestran que se pueden utilizar concentraciones más bajas de hierro para preparar la norma. Sin embargo, no se recomienda el uso de un WISS con concentraciones de hierro más altas, ya que esto podría conducir a valores de absorbancia que excedan el rango dinámico lineal de detección del espectrofotómetro, lo que podría hacer que las curvas estándar se estabilicen.

Para comparar aún más los ensayos basados en cubetas y microplacas, se midió el contenido de hierro no hemo en un total de 55 muestras de tejido de ratón (hígado, bazo, corazón, pulmón, médula ósea). Se observó un grado muy alto de correlación entre las dos metodologías (r = 0,999, p < 0,0001), lo que indica que el método basado en microplacas es una alternativa válida al método original basado en cubetas (Figura 1B).

Finalmente, los niveles de hierro no hemo en tejidos de ratón se cuantificaron con el método basado en microplacas después de la digestión ácida de muestras derivadas de los mismos tejidos con una mezcla de ácido clorhídrico y ácido tricloroacético (según la descripción del método original) o ácido clorhídrico solo. Se observó una correlación muy alta (r = 0,999, p < 0,0001, Figura 1C), mostrando que el ácido tricloroacético puede omitirse de la digestión ácida.

Los resultados representativos que se incluyen a continuación se obtuvieron midiendo la absorbancia de la muestra en placas de 96 pocillos.

Medición de los niveles de hierro no hemo tisular en un modelo de ratón de hemocromatosis genética
Utilizando el ensayo colorimétrico basado en batofenolatolina, se determinó el contenido de hierro no hemo en varios tejidos (hígado, bazo, corazón y páncreas) de la cepa de ratón comúnmente utilizada C57BL / 6 y de ratones knockout de hepcidina (Hamp1-/-) (en un fondo genético C57BL / 6). Los niveles representativos de hierro se representan en la Figura 2. La hepcidina es un regulador clave del metabolismo del hierro y su alteración conduce a un fenotipo de deposición de hierro similar a la hemocromatosis, con acumulación severa de hierro hepático, pancreático y cardíaco, y agotamiento esplénico de hierro8.

Medición de los niveles de hierro no hemo en el hígado de lubina después de la modulación experimental del hierro
Utilizando el ensayo colorimétrico basado en batofenantrolina, se determinaron los niveles de hierro no hemo en el hígado de lubina europea sana (control), tratada con hierro (2 mg de dextrano de hierro administrada por vía intraperitoneal) y anémica (2% v/p de sangre extraída de los vasos caudales) europea (Dicentrarchus labrax). Como era de esperar, los niveles de hierro hepático aumentaron masivamente en animales tratados con hierro, mientras que la anemia causó una reducción leve en las reservas de hierro hepático (Figura 3).

Medición de los niveles de hierro no hemo en Drosophila melanogaster entera
Aunque el método actual no es apropiado para medir los niveles de hierro no hemo en moscas Drosophila individuales debido a su pequeña masa corporal (el peso promedio es de 0,6 mg y 0,8 mg para machos y hembras, respectivamente)9, se puede usar con éxito con moscas agrupadas. La Figura 4 muestra los niveles representativos de hierro no hemo para grupos de 20 moscas macho enteras, ya sea de tipo salvaje Oregon-R o Malvolio (Mvl) knockout. Mvl es el homólogo del gen SLC11A2 de mamíferos, que codifica para una proteína llamada transportador de metal divalente 1 (DMT1), y su alteración genética conduce a la deficiencia de hierro10. Como era de esperar, las moscas Mlv presentaron un contenido de hierro no hemo sustancialmente más bajo en el cuerpo en comparación con el tipo salvaje.

Tabla 1: Parámetros de funcionamiento para el secado del hígado en un horno de digestión por microondas utilizado aquí.

Tabla 2: Preparación de reacciones de cromógenos en tubos de 1,5 ml o placas de 96 pocillos.

Figura 1: Determinación del hierro no hemo mediante los ensayos colorimétricos basados en microplacas de cubeta o 96 pocillos. (A) curvas estándar para ensayos basados en microplacas (cuadrados abiertos) y cuvette (triángulos abiertos Δ). (B) Correlación entre los niveles de hierro no hemo a base de cubeta y a base de microplacas en 55 muestras de tejido de ratones machos C57BL/6 de 6 meses de edad, incluyendo hígado (círculos sólidos), bazo (círculos abiertos), corazón (triángulos sólidos), pulmón (asteriscos) y médula ósea (diamantes). (C) niveles de hierro no hemo en un subconjunto de tejidos de ratones machos de 6 meses de edad (hígado, círculos sólidos; bazo, círculos abiertos) medidos con el ensayo basado en microplacas de 96 pocillos después de la digestión ácida de muestras con una mezcla de ácido clorhídrico y ácido tricloroacético (HCl + C2HCl3O2) o ácido clorhídrico solo (HCl). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Contenido de hierro no hemo determinado en varios tejidos mediante ensayo colorimétrico basado en batofenantrolina. Niveles de hierro no hemo en el hígado, el bazo, el corazón y el páncreas de ratones machos C57BL/ 6 de tipo salvaje (círculos abiertos ) y ratones Hamp1-/- machos con deficiencia de hepcidina en antecedentes genéticos C57BL/6 (cuadrados abiertos ) a la edad de 8 semanas, medidos con el ensayo colorimétrico basado en batofenolatolina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Niveles hepáticos de hierro no hemo en lubina europea hembra juvenil tras la modulación experimental del hierro. La sobrecarga de hierro se logró mediante la administración intraperitoneal de 2 mg de dextrano de hierro, mientras que la anemia fue inducida por la extracción del 2% v/ p de sangre de los vasos caudales. Los hígados se recolectaron a los 4 días después del tratamiento con hierro o la recolección de sangre. Los animales de control eran lubinas sanas y no tratadas. Los niveles de hierro no hemo se midieron con el ensayo colorimétrico basado en batofenolantrolina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Niveles de hierro no hemo en Drosophila de 1 mes de edad, medidos con el ensayo colorimétrico basado en batofenantrolina. Los resultados muestran (A) el contenido de hierro no hemo en cada grupo de 20 moscas o (B) el contenido estimado de hierro de cada mosca individual, considerando un peso promedio de 0,64 mg / mosca. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen conflictos de intereses.