Medición del contenido de hierro no hemo en tejidos utilizando un ensayo colorimétrico basado en batofenantrolina

Resumen

Aquí, se proporciona un protocolo para la medición del contenido de hierro no hemo en tejidos animales, utilizando un ensayo colorimétrico simple y bien establecido que se puede implementar fácilmente en la mayoría de los laboratorios.

Resumen

El hierro es un micronutriente esencial. Tanto la sobrecarga como la deficiencia de hierro son altamente perjudiciales para los seres humanos, y los niveles de hierro en los tejidos están finamente regulados. El uso de modelos animales experimentales de sobrecarga o deficiencia de hierro ha sido fundamental para avanzar en el conocimiento de los mecanismos implicados en la regulación sistémica y celular de la homeostasis del hierro. La medición de los niveles totales de hierro en tejidos animales se realiza comúnmente con espectroscopia de absorción atómica o con un ensayo colorimétrico basado en la reacción del hierro no hemo con un reactivo de batofenolantrolina. Durante muchos años, el ensayo colorimétrico se ha utilizado para la medición del contenido de hierro no hemo en una amplia gama de tejidos animales. A diferencia de la espectroscopia de absorción atómica, excluye la contribución de hierro hemo derivado de la hemoglobina contenida en los glóbulos rojos. Además, no requiere habilidades analíticas sofisticadas ni equipos altamente costosos, y por lo tanto se puede implementar fácilmente en la mayoría de los laboratorios. Finalmente, el ensayo colorimétrico puede basarse en cubetas o adaptarse a un formato de microplaca, lo que permite un mayor rendimiento de la muestra. El presente trabajo proporciona un protocolo bien establecido que es adecuado para la detección de alteraciones en los niveles de hierro tisular en una variedad de modelos animales experimentales de sobrecarga o deficiencia de hierro.

Introducción

El hierro es un micronutriente esencial, necesario para la función de las proteínas involucradas en procesos biológicos cruciales como el transporte de oxígeno, la producción de energía o la síntesis de ADN. Es importante destacar que tanto el exceso de hierro como la deficiencia de hierro son altamente perjudiciales para la salud humana, y los niveles de hierro en los tejidos están finamente regulados. La absorción anormal de hierro en la dieta, las dietas deficientes en hierro, las transfusiones de sangre repetidas y la inflamación crónica son causas comunes de trastornos asociados con el hierro que afectan a miles de millones de personas en todo el

Protocolo

Los ratones C57BL/6 fueron comprados comercialmente y los ratones con hepcidina nula (Hamp1^−/−) sobre un fondo C57BL/⁶⁸ fueron un amable regalo de Sophie Vaulont (Institut Cochin, Francia). Los animales fueron alojados en la instalación de animales i3S en condiciones específicas libres de patógenos, en un ambiente controlado por la temperatura y la luz, con libre acceso a chow y agua estándar para roedores. La lubina europea (Dicentrarchus labrax) se compró en una piscifactoría comercial y se alojó en las instalaciones de animales del ICBAS, en un entorno controlado por la temperatura y la luz, y se alimentó diariam....

Resultados

Comparación de cubeta versus microplacas de 96 pocillos
La medición del hierro tisular no hemo por reacción con un reactivo de batofenolantrolina descrito originalmente por Torrance y ^Bothwell5,6 se basa en el uso de un espectrofotómetro para la lectura de la absorbancia. Por lo tanto, los volúmenes empleados en la reacción cromática son compatibles con el tamaño de una cubeta de espectrofotómetro regular. El presente trabajo describe un métod.......

Discusión

Se proporciona un protocolo para la medición del contenido de hierro no hemo en tejidos animales, utilizando una adaptación del ensayo colorimétrico basado en batofenantrolina descrito originalmente por Torrance y ^Bothwell5,6. Los pasos críticos del método son el secado de muestras de tejido; desnaturalización de proteínas y liberación de hierro inorgánico por hidrólisis ácida; reducción del hierro férrico (^Fe3+) al estado ferroso (^Fe2+) en .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa transparente UV de 96 pocillos	Sarstedt	82.1581.001
Balanza analítica	Kern	ABJ 220-4M
Acetato de sodio anhidro	Merck	106268
sulfonato de tofofenantrolina (ácido 4,7-difenil-1,10-fenantrolina dissulfónico)	Sigma-Aldrich	B1375
C57BL/6 ratones (Mus musculus)	Laboratorios
Polvo de hierro carbonilo, ≥ 99.5%	Sigma-Aldrich	44890
Cubetas desechables de polimetacrilato de metilo (PMMA)	VWR	634-0678P
Agua estéril de doble destilación	B. Braun	0082479E Lector de
microplacas de fluorescencia	BioTek Instruments	FLx800
Ácido clorhídrico, 37%	Sigma-Aldrich	258148
Horno de digestión por microondas y tazas de teflón blanco	CEM	MDS-2000
Ácido nítrico	Fisher Scientific	15687290
Oven	Binder	ED115
Comida para roedores	Harlan Laboratories	2014S	Teklad Global 14% Protein Dieta de Mantenimiento de Roedores que contiene 175 mg/kg de hierro
Lubina (Dicentrarchus labrax)	Sonrionansa
Pienso para lubina	Skretting	L-2 Alterna 1P
Espectrofotómetro UV-Vis de haz único	Shimadzu	UV mini 1240
Ácido tioglicólico	Merck	100700
Ácido tricloroacético	Merck	100807

Charles River