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Artículo de método

In vivo Tomografía por emisión de positrones para revelar patrones de actividad inducida por estimulación cerebral profunda en ratas

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DOI:

10.3791/63478

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23 de marzo de 2022

 ,  ,  ,  , 
1Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), 2Laboratorio de Imagen Médica, Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón, 3Departamento de Bioingeniería e Ingeniería Aeroespacial, Universidad Carlos III de Madrid, 4CIBER de Salud Mental (CIBERSAM), 5High Performance Research Group in Physiopathology and Pharmacology of the Digestive System (NeuGut), Universidad Rey Juan Carlos

En este artículo

Resumen

Describimos un método experimental preclínico para evaluar la neuromodulación metabólica inducida por la estimulación cerebral profunda aguda con FDG-PET in vivo . Este manuscrito incluye todos los pasos experimentales, desde la cirugía estereotáxica hasta la aplicación del tratamiento de estimulación y la adquisición, procesamiento y análisis de imágenes PET.

Resumen

La estimulación cerebral profunda (DBS) es una técnica neuroquirúrgica invasiva basada en la aplicación de pulsos eléctricos a las estructuras cerebrales implicadas en la fisiopatología del paciente. A pesar de la larga historia de DBS, su mecanismo de acción y protocolos apropiados siguen sin estar claros, destacando la necesidad de investigación con el objetivo de resolver estos enigmas. En este sentido, evaluar los efectos in vivo de la ECP utilizando técnicas de imagen funcional representa una estrategia poderosa para determinar el impacto de la estimulación en la dinámica cerebral. Aquí, se describe un protocolo experimental para modelos preclínicos (ratas Wistar), combinado con un estudio longitudinal [18F]-tomografía por emisión de positrones fluorodesoxiclucosa (FDG-PET), para evaluar las consecuencias agudas de DBS en el metabolismo cerebral. Primero, los animales se sometieron a cirugía estereotáctica para la implantación bilateral de electrodos en la corteza prefrontal. Se adquirió una tomografía computarizada (TC) postquirúrgica de cada animal para verificar la colocación del electrodo. Después de una semana de recuperación, se adquirió un primer FDG-PET estático de cada animal operado sin estimulación (D1), y dos días después (D2), se adquirió un segundo FDG-PET mientras se estimulaban los animales. Para eso, los electrodos se conectaron a un estimulador aislado después de administrar FDG a los animales. Por lo tanto, los animales fueron estimulados durante el período de captación de FDG (45 min), registrando los efectos agudos de DBS en el metabolismo cerebral. Dada la naturaleza exploratoria de este estudio, las imágenes FDG-PET se analizaron mediante un enfoque de vóxeles basado en una prueba T pareada entre los estudios D1 y D2. En general, la combinación de DBS y estudios de imagen permite describir las consecuencias de la neuromodulación en las redes neuronales, lo que en última instancia ayuda a desentrañar los enigmas que rodean a DBS.

Introducción

El término neuroestimulación engloba una serie de técnicas diferentes dirigidas a estimular el sistema nervioso con un objetivo terapéutico1. Entre ellas, la estimulación cerebral profunda (ECP) destaca como una de las estrategias de neuroestimulación más extendidas en la práctica clínica. La DBS consiste en la estimulación de núcleos cerebrales profundos con pulsos eléctricos entregados por un neuroestimulador, implantados directamente en el cuerpo del paciente, a través de electrodos colocados en el objetivo cerebral para ser modulados por cirugía estereotáctica. El número de artículos que evalúan la viabilidad de la aplicación de DBS en diferentes trastornos neurológicos y psiquiátricos está creciendo continuamente2, aunque solo algunos de ellos han sido aprobados por la Food and Drug Association (FDA) (es decir, temblor esencial, enfermedad de Parkinson, distonía, trastorno obsesivo-compulsivo y epilepsia médicamente refractaria)3 . Además, se están investigando un gran número de dianas cerebrales y protocolos de estimulación para el tratamiento de la ECP de muchas más patologías de las aprobadas oficialmente, pero ninguna de ellas se considera definitiva. Estas inconsistencias en la investigación de ECP y los procedimientos clínicos pueden deberse en parte a la falta de comprensión completa de su mecanismo de acción4. Por lo tanto, se están haciendo grandes esfuerzos para descifrar los efectos in vivo de DBS en la dinámica cerebral, ya que cada avance, por pequeño que sea, ayudará a refinar los protocolos de DBS para un mayor éxito terapéutico.

En este contexto, las técnicas de imagen molecular abren una ventana directa para observar los efectos neuromoduladores in vivo de la ECP. Estos enfoques brindan la oportunidad no solo de determinar el impacto de la ECP mientras se aplica, sino también de desentrañar la naturaleza de sus consecuencias, prevenir efectos secundarios no deseados y mejoría clínica, e incluso adaptar los parámetros de estimulación a las necesidades del paciente5. Entre estos métodos, la tomografía por emisión de positrones (PET) con 2-desoxi-2-[18F]fluoro-D-glucosa (FDG) es de particular interés porque proporciona información específica y en tiempo real sobre el estado de activación de diferentes regiones cerebrales6. Específicamente, la imagen FDG-PET proporciona una evaluación indirecta de la activación neuronal basada en el principio fisiológico del acoplamiento metabólico entre las neuronas y las células gliales6. En este sentido, varios estudios clínicos han reportado patrones de actividad cerebral modulados por DBS usando FDG-PET (ver3 para revisión). Sin embargo, los estudios clínicos incurren fácilmente en varios inconvenientes cuando se centran en los pacientes, como la heterogeneidad o las dificultades de reclutamiento, que limitan fuertemente su potencial de investigación6. Este contexto lleva a los investigadores a utilizar modelos animales de condiciones humanas para evaluar enfoques biomédicos antes de su traducción clínica o, si ya se aplican en la práctica clínica, para explicar el origen fisiológico de los beneficios terapéuticos o efectos secundarios. Por lo tanto, a pesar de las grandes distancias entre la patología humana y la condición modelada en animales de laboratorio, estos enfoques preclínicos son esenciales para una transición segura y efectiva a la práctica clínica.

Este manuscrito describe un protocolo experimental de DBS para modelos murinos, combinado con un estudio longitudinal de FDG-PET, con el fin de evaluar las consecuencias agudas de DBS en el metabolismo cerebral. Los resultados obtenidos con este protocolo pueden ayudar a desentrañar los intrincados patrones moduladores inducidos en la actividad cerebral por DBS. Por lo tanto, se proporciona una estrategia experimental adecuada para examinar in vivo las consecuencias de la estimulación, lo que permite a los médicos anticipar los efectos terapéuticos en circunstancias específicas y luego adaptar los parámetros de estimulación a las necesidades del paciente.

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Protocolo

Los procedimientos con animales de experimentación se realizaron de acuerdo con la Directiva 2010/63/UE del Consejo de Comunidades Europeas, y aprobados por el Comité de Ética para la Experimentación Animal del Hospital Gregorio Marañón. Un resumen gráfico del protocolo experimental se muestra en la Figura 1A.

1. Localización del objetivo cerebral mediante neuroimagen in vivo

  1. Preparación animal
    NOTA: Se utilizaron ratas Wistar macho de ~300 g.
    1. Coloque al animal en una caja de inducción de anestesia y selle la parte superior.
    2. Enciende el vaporizador de sevoflurano (5% para inducción en 100%O2). Cuando la rata esté anestesiada, cambie el flujo de gas a la nariz. Confirme el estado de la anestesia pellizcando la pata de rata.
    3. Coloque al animal en decúbito supino sobre el lecho de TC, manteniendo la anestesia con sevoflurano (3% para mantenimiento en 100%O2).
  2. Imágenes por TC
    NOTA: La selección de amperaje, voltaje, número de proyecciones, número de disparos y resolución de vóxel depende del tomógrafo. Aquí, se utilizaron los siguientes parámetros: 340 mA, 40 KV, 360 proyecciones, 8 disparos y resolución de 200 μm 7,8,9.
    1. Asegure la mascarilla o el cono de la nariz a la rata.
    2. Asegure el cuerpo de la rata en la cabeza, los hombros, las caderas y la cola con cinta adhesiva de seda para proporcionar suficiente sujeción sin daños.
    3. Monitoree la rata continuamente.
    4. Localice la cabeza en el centro del campo de visión del tomógrafo.
    5. Proceda a adquirir la imagen de TC utilizando parámetros de adquisición de acuerdo con las especificaciones del escáner.
    6. Después de 10 minutos, cuando se haya completado la tomografía computarizada in vivo , detenga el flujo de sevoflurano y coloque la rata en el escáner de resonancia magnética.
  3. Imágenes por RM
    NOTA: Las especificaciones de adquisición de escaneo varían entre los escáneres, incluidos los diferentes sistemas de software y, lo que es más importante, la pregunta de investigación específica. Aquí, se utilizó un escáner de 7 Teslas. Se utilizó una secuencia de espín-eco ponderada T2 7,8,9 con TE = 33 ms, TR = 3732 ms, y un grosor de corte de 0,8 mm (34 cortes), tamaño de matriz de 256 x 256 píxeles con un campo de visión de 3,5 x 3,5 cm2.
    1. Coloque al animal en decúbito supino en la cama de resonancia magnética, manteniendo la anestesia con sevoflurano (3% para mantenimiento en 100%O2).
    2. Asegure la cabeza a un marco estereotáctico colocado en la cama del escáner para evitar movimientos de la cabeza durante la adquisición de la resonancia magnética. Además, asegure el resto del cuerpo de la rata con cinta adhesiva de seda.
    3. Localice la cabeza en el centro del campo de visión del escáner de resonancia magnética.
    4. Una vez que la posición sea correcta, proceda a adquirir la imagen de resonancia magnética.
    5. Cuando se complete la resonancia magnética in vivo , detenga el flujo de sevoflurano y coloque a la rata en su jaula.
    6. Localice una lámpara de calefacción cerca de la jaula porque las ratas generalmente reducen su temperatura corporal durante la exploración.
    7. Monitoree a la rata hasta la recuperación de la anestesia.
  4. Colocalización del Atlas y cálculo de coordenadas objetivo
    1. Una vez que las imágenes de TC y RM se adquieren y reconstruyen siguiendo las recomendaciones del escáner, co-registre las imágenes de TC y RMN.
    2. Utilizar un software de procesamiento de imágenes para normalizar espacialmente la TC y la RM utilizando un algoritmo de registro rígido automático basado en información mutua10.
    3. Localice la línea de Bregma en la imagen co-registrada y mida la distancia en el eje anterior/posterior (AP: +3.5 mm), línea media/lateral (ML: +0.6 mm) y dorsoventral (DV: -3.4 mm) desde Bregma hasta el objetivo (es decir, corteza prefrontal medial, mPFC), de acuerdo con el atlas cerebral de ratas Paxinos y Watson11.
      NOTA: Las coordenadas desde Bregma hasta el objetivo pueden diferir entre ratas cuando el peso, el tamaño, el sexo y la raza son diferentes.

2. Cirugía estereotáxica

PRECAUCIÓN: Autoclave todo el material quirúrgico, implantes y unidades estereotáxicas antes de su uso, y desinfectar el área quirúrgica para evitar infecciones y complicaciones que puedan afectar el bienestar animal. Use guantes quirúrgicos estériles y cubra al animal con cortinas adhesivas para evitar la contaminación.

  1. Preparación de animales y anestesia
    1. A los animales se les administró 0,1 mg/kg de buprenorfina por vía intraperitoneal el día anterior a la cirugía. Coloque al animal en una cámara de caja de inducción de anestesia y selle la parte superior.
    2. Enciende el vaporizador de sevoflurano (5% para inducción en 100%O2).
    3. Cuando la rata esté recostada, apague el vaporizador de sevoflurano y retire la rata de la cámara de la caja.
    4. Administrar por vía intraperitoneal una mezcla de ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) para anestesiar al animal.
    5. Espere hasta que el animal esté completamente anestesiado. Verifique el nivel de anestesia pellizcando el área interdigital.
    6. Afeite el área entre las orejas y los ojos.
  2. Colocación en el marco estereotáctico y craneotomía
    1. Coloque al animal en posición prona en el marco estereotáctico y use el adaptador de sujeción de la cabeza para ratas para mantener al animal en la posición correcta durante la cirugía.
    2. Asegure la inmovilidad de la cabeza mediante el uso de las barras de oreja de rata. Tenga cuidado con la inserción de las barras del oído, ya que una inserción demasiado profunda puede dañar el tímpano.
    3. Aplique gel lubricante oftálmico en los ojos para evitar la sequedad durante la cirugía y cúbralos con una gasa estéril.
    4. Cubra al animal con cortinas adhesivas para evitar la contaminación.
    5. Aplique la solución de yodopovidona en el área afeitada y límpiela con una gasa estéril.
    6. Aplique mepivacaína en gel en el área afeitada para anestesiar el área local.
    7. Haga una incisión longitudinal en la piel que recubre el cráneo entre las orejas, extendiéndose 1.5-2 cm desde lambda hasta Bregma (es decir, desde el vértice craneal hacia los ojos).
    8. Exponga el cráneo con la ayuda de 2 o 3 pinzas. Retire el periostio con un bastoncillo de algodón y limpie la sangre con solución salina para exponer Bregma y las suturas sagitales. Retire el exceso de solución salina con una gasa.
    9. Rasca la superficie del cráneo con un bisturí para mejorar la adhesión del cemento dental. Limpie el área con un bastoncillo de algodón empapado en peróxido de hidrógeno.
  3. Colocación de electrodos y fijación al cráneo
    1. Enderezar los electrodos con pinzas de plástico para asegurar la colocación correcta durante la cirugía.
      NOTA: En este protocolo se utilizan electrodos bipolares concéntricos de platino-iridio con tierra a tierra.
    2. Localice un electrodo en el soporte del brazo derecho del marco estereotáctico.
      NOTA: Puede ser necesario adaptar el soporte al electrodo para fijarlo mejor (ver Figura 1B). Asegúrese de que el electrodo esté paralelo al eje del soporte.
    3. Mueva el brazo derecho que sostiene el electrodo a través del marco estereotáxico y coloque la punta del electrodo exactamente sobre Bregma. Trate de acercar la punta del electrodo lo más posible al cráneo pero sin tocarlo para evitar la deformación del electrodo, y observe las coordenadas resultantes para Bregma proporcionadas por el marco estereotáxico. Haga una marca en el cráneo que indique la posición inicial del electrodo con una pluma quirúrgica.
    4. Mueva el soporte a las coordenadas AP y ML obtenidas en el paso 1.4.3 y haga una marca en el cráneo con una pluma quirúrgica que indique la posición del objetivo del electrodo.
    5. Retire el brazo derecho del marco estereotáctico que sostiene el electrodo. Tenga cuidado de no tocar nada con el electrodo.
    6. Use un pequeño taladro eléctrico para hacer un agujero a través del cráneo (aproximadamente 1-1.5 mm de diámetro) en la posición objetivo hasta que la duramadre sea visible. Detenga cualquier sangrado con un bastoncillo de algodón.
    7. Perfore 4 agujeros a lo largo del cráneo para localizar 4 tornillos (preferiblemente tornillos de acero inoxidable de 2-3 mm de longitud) para aumentar el área de superficie del cemento dental y localizar el suelo. Coloque los 4 tornillos.
    8. Localice el brazo derecho del marco estereotáctico con el electrodo derecho. Mueva el brazo a la posición calculada, que debe coincidir con el agujero. Luego, baja el electrodo hasta que toque la duramadre. Esta posición servirá como nivel 0 en la dirección DV.
    9. Inserte la punta del electrodo en la dirección DV, utilizando la posición DV del paso 1.4.3. Limpie la sangre y el líquido cefalorraquídeo alrededor del área del electrodo con un bastoncillo de algodón.
    10. Fije la tierra a uno de los tornillos más cercanos al electrodo.
    11. Aplicar cemento dental alrededor del electrodo y tornillos teniendo cuidado de dar forma al cemento dental evitando bordes afilados, que podrían lesionar al animal. El cemento dental se aplica en una capa para evitar el sobrecalentamiento / lesión térmica en el tejido / cráneo. Las capas gruesas requieren más tiempo para curarse antes de agregar capas adicionales. Asegúrese de que el cemento dental esté completamente endurecido antes de retirar el electrodo del soporte.
      PRECAUCIÓN: La preparación del cemento dental produce la emanación de vapores tóxicos de la mezcla, que termina con la solidificación del cemento. Por lo tanto, use una máscara de protección efectiva contra los gases químicos desde este punto y hasta el final de la cirugía.
    12. Repita el mismo procedimiento de los pasos 2.3.2-2.3.11 para el otro hemisferio del cerebro.
    13. Aplique más cemento dental para formar una tapa sin cubrir el electrodo. Espere hasta que se endurezca.
    14. Use sutura trenzada de seda natural no absorbible 1/0, con una aguja triangular, para suturar por delante y por detrás de la tapa. Si es necesario, retire las suturas no absorbibles en un momento determinado de acuerdo con la región del cuerpo donde se encuentran. Use una solución de yodopovidona para desinfectar el área quirúrgica.
    15. Retire la rata del marco estereotáctico.
  4. Imágenes por TC para la confirmación de la colocación de electrodos
    1. Realice los pasos 1.2.4-1.2.5 y consulte la figura 1C.
    2. Una vez que se complete la tomografía computarizada in vivo , coloque la rata en su jaula.
    3. Siga los pasos 1.3.6. y 1.3.7.
  5. Cuidados postoperatorios
    1. Administrar antibiótico (ceftriaxona, 100 mg/kg, subcutáneo) durante 5 días y analgésico (buprenorfina, 0,1 mg/kg, intraperitoneal) durante 3 días como cuidados postoperatorios. Este régimen antibiótico puede prolongarse durante 5 días si se observa cualquier signo de infección (enrojecimiento, hinchazón y exudado) alrededor del capuchón.
    2. Realice una inspección visual de cada animal diariamente, buscando signos de dolor o angustia, y limpie la tapa con la solución de yodopovidona.
    3. Proporcionar cuidados intensivos hasta 1 semana después de la cirugía.

3. Adquisición de imágenes PET/CT

NOTA: Cada animal se somete a dos estudios de PET/CT (es decir, en ausencia y durante la administración de DBS) bajo anestesia inhalada para evaluar los efectos agudos inducidos por la estimulación eléctrica. Ambas sesiones de exploración siguen el mismo protocolo de adquisición de imágenes, realizándose 1 semana después de la cirugía (D1, sin estimulación) y 2 días después (D2, durante DBS).

  1. Preparación de animales y anestesia
    1. Ayune la rata durante 8-12 h antes de cada exploración PET para permitir una mayor absorción cerebral de FDG, mejorando la relación señal-ruido12.
    2. Coloque al animal en una caja de inducción de anestesia y selle la parte superior.
    3. Enciende el vaporizador de sevoflurano (5% para inducción en 100%O2).
    4. Cuando la rata esté anestesiada, cambie el flujo de gas a la nariz.
  2. Inyección de FDG y período de captación
    PRECAUCIÓN: FDG es una radiosonda, así que considere medidas de radioprotección para evitar la exposición a la radiactividad. Confirmar que la institución tiene todos los permisos para trabajar con compuestos radiactivos.
    1. Mantenga el vial de FDG dentro de un gabinete revestido de plomo hasta que se use para evitar la exposición indeseable a la radiactividad.
    2. Llene una jeringa de calibre pequeño (~27G) con ~37 MBq de la solución FDG en el menor volumen posible, medido en un activímetro.
    3. Coloque una almohadilla térmica debajo de la cola del animal o use luz infrarroja para dilatar las venas de la cola.
    4. Una vez que las venas laterales son evidentes en el pico de la cola, limpie el área con alcohol sanitario (96%).
    5. Inyecte la solución de FDG a través de una de las venas laterales de la cola, acercándose a la vena con una jeringa paralela a su trayectoria y con el bisel de la aguja hacia arriba.
    6. Apague la anestesia y vuelva a colocar al animal en su jaula para recuperarse completamente bajo una lámpara de calentamiento.
    7. Permita 45 minutos de captación del radiotrazador antes de comenzar la sesión de adquisición de imágenes. Durante este período, mantenga al animal despierto y dentro de una cámara blindada de plomo.
    8. En el caso del estudio D2, administrar DBS como se explica a continuación en la sección 4 (Administración de estimulación eléctrica) durante el período de captación de FDG.
  3. Adquisición de PET y reconstrucción de imágenes
    NOTA: Las especificaciones de adquisición de imágenes PET dependen del escáner y del tiempo de escaneo. Para este protocolo, se adquirió una imagen estática de PET durante 45 min con un escáner PET/CT de animales pequeños, utilizando una ventana de energía de 400-700 keV 7,8,9. Revise las especificaciones del equipo PET/CT antes de diseñar el protocolo de adquisición.
    1. 45 min después de la inyección de FDG, coloque al animal en una caja de inducción de anestesia y selle la parte superior.
    2. Enciende el vaporizador de sevoflurano (5% para inducción en 100%O2).
    3. Transfiera al animal a la cama PET/CT y colóquelo en posición supina, asegurando la nariz al cono nasal de anestesia y manteniendo la anestesia con sevoflurano (3% para mantenimiento en 100%O2). Confirme el estado de la anestesia pellizcando la pata de rata.
    4. Repita los pasos 1.2.2 y 1.2.3.
    5. Localice el cabezal en el centro del campo de visión del escáner PET.
    6. Adquiera la imagen estática de PET utilizando parámetros de adquisición de acuerdo con las especificaciones del escáner.
    7. Proceda a reconstruir la imagen utilizando un 2D-OSEM (algoritmo de maximización de expectativas de subconjuntos ordenados) y aplique correcciones de decaimiento y tiempo muerto 7,8,9.
    8. Cuando se complete la TEP in vivo , mantener el flujo de sevoflurano a la rata para posteriormente proceder a la adquisición de la TC sin desplazar la posición de la cabeza del animal en el lecho del escáner.
  4. Adquisición de TC
    1. Sin cambiar la posición del animal con respecto a la adquisición previa de PET, se procede a adquirir la imagen de TC.
    2. Repita los pasos 1.2.3-1.2.5.
    3. Una vez que se complete la tomografía computarizada in vivo , detenga el flujo de sevoflurano y coloque a la rata en su respectiva jaula para su recuperación.
    4. Siga los pasos 1.3.6. y 1.3.7.
    5. Mantenga al animal en una cámara blindada con plomo hasta que la radiactividad completa disminuya.

4. Administración de estimulación eléctrica

NOTA: La estimulación eléctrica se administra durante el período de captación de FDG en la sesión de imagen D2. Para este protocolo, la estimulación se administró con un estimulador aislado, con una estimulación eléctrica de alta frecuencia (130 Hz) en un modo de corriente constante, 150 μA, y un ancho de pulso de 100 μs 7,13,14.

  1. Configuración del estimulador DBS
    1. Prepare el estimulador aislado y los cables necesarios en una habitación amplia y silenciosa, con suficiente espacio para las jaulas de los animales y una influencia mínima de estímulos potencialmente perturbadores.
    2. Conecte los cables de estimulación a los giros para permitir que los animales se muevan libremente dentro de sus jaulas y al estimulador.
    3. Establecer los parámetros de estimulación según las necesidades del estudio.
    4. Utilice un osciloscopio para comprobar el modo actual, la frecuencia y el ancho del pulso. Confirme la forma de onda bifásica con una forma de pulso rectangular (Figura 1D).
  2. Entrega de DBS
    1. Después de la sesión de imagen D1 y hasta la adquisición de D2, someter a los animales a un protocolo de habituación diaria (45 min/día) para acostumbrarlos al sistema de estimulación y al manejo del operador, evitando respuestas de estrés indeseables en D2. Conecta el sistema de estimulación a cada animal, pero sin encender la estimulación.
    2. Una vez que se haya configurado el estimulador y se haya inyectado FDG al animal, conecte el giro a los electrodos y encienda el estimulador.
    3. Después de 45 minutos, apague el estimulador, desconecte al animal del giro y transfiéralo rápidamente a una cámara de inducción de anestesia para comenzar el paso 3.3.

figure-protocol-1
Figura 1: Diseño experimental . (A) Resumen de los pasos experimentales seguidos en este protocolo. (B) Imágenes representativas de una adaptación del soporte para una mejor fijación del electrodo, con (izquierda) y sin (derecha) un electrodo. (C) Imagen fusionada de una resonancia magnética con una tomografía computarizada de un animal operado, que muestra la colocación correcta del electrodo en la corteza prefrontal medial (mPFC). (D) Captura de pantalla de la pantalla del osciloscopio que muestra la forma de onda de estimulación bifásica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Procesamiento y análisis de imágenes PET

NOTA: Siga el mismo procesamiento de imágenes en imágenes de D1 y D2 para obtener datos comparables para el posterior análisis estadístico de vóxel.

  1. Registro espacial de imágenes PET
    1. Utilice un software especializado de procesamiento de imágenes. En la figura 2 se ilustra todo el flujo de trabajo de registro.
    2. Centra y recorta cada imagen de PET y CT al campo de visión. Registrar la imagen PET en su TC utilizando un algoritmo de registro rígido automático basado en información mutua15.
      NOTA: Los métodos de registro rígidos solo son apropiados si no hay diferencias significativas en el peso corporal o el tamaño entre los animales. De lo contrario, considere usar métodos elásticos.
    3. Registre cada imagen de TC en una TC de referencia registrada espacialmente en el atlas cerebral de ratas Paxinos y Watson11 como en el paso 5.1.2. Guarde los parámetros de transformación resultantes.
    4. Aplicar los parámetros de transformación obtenidos en el paso 5.1.3. a cada imagen PET registrada obteniendo la imagen PET registrada en la imagen CT de referencia.
    5. Guarde todas las imágenes PET finales en formato Nifti.
  2. Normalización de intensidad y suavizado de imágenes PET
    NOTA: La normalización y el suavizado de intensidad se realizan con diferentes scripts internos basados en recursos disponibles públicamente.
    1. Alise las imágenes PET con un núcleo gaussiano isotrópico de 2 mm de ancho completo medio máximo (FWHM) para corregir posibles errores de registro.
      NOTA: El tamaño del filtro de suavizado dependerá de la resolución de la adquisición de PET, pero se recomienda utilizar un filtro de 2-3 veces el tamaño de vóxel de FWHM.
    2. Normalizar la intensidad de los valores de vóxel PET utilizando un método apropiado de normalización de conglomerados de referencia16.
    3. Segmentar una máscara cerebral de una resonancia magnética de referencia registrada a la imagen de TC de referencia.
    4. Aplique la máscara cerebral a cada imagen PET para excluir los vóxeles fuera del cerebro del análisis de vóxel.
  3. Análisis de vóxel
    NOTA: El análisis estadístico, consistente en un análisis de vóxeles de los datos de imagen PET, fue realizado utilizando un software especializado de análisis de imágenes17.
    1. Compare las imágenes PET D1 y D2 utilizando una prueba T pareada, estableciendo umbrales estadísticos significativos adecuados.
    2. Considerar como resultados definitivos del análisis sólo aquellos cúmulos mayores de 50 vóxeles adyacentes para reducir los errores de tipo I.
    3. Representar los resultados en mapas T superpuestos en una resonancia magnética T2, que muestran los cambios en el metabolismo cerebral de la glucosa inducidos por DBS (colores fríos para la reducción de FDG y colores cálidos para el incremento de FDG).

figure-protocol-2
Figura 2: Flujo de trabajo de registro de imágenes Micro PET/CT. Pasos detallados del procesamiento de normalización espacial de imágenes PET para el posterior análisis de vóxeles con el software de mapeo paramétrico estadístico (SPM). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Resultados

Los animales fueron sacrificados usandoCO2 al final del estudio o cuando el bienestar del animal se vio comprometido. Un ejemplo de un estudio completo de PET/CT de un animal operado se muestra en la Figura 3. Por lo tanto, el electrodo insertado en el cerebro de la rata se puede observar claramente en la imagen de TC que se muestra en la Figura 3A. Esta modalidad de imagen proporciona una buena información anatómica y facilita el registro de imágenes...

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Discusión

Dados los avances en la comprensión de la función cerebral y las redes neuronales involucradas en la fisiopatología de los trastornos neuropsiquiátricos, cada vez más investigaciones reconocen el potencial de la ECP en una amplia gama de patologías de base neurológica2. Sin embargo, el mecanismo de acción de esta terapia sigue sin estar claro. Varias teorías han intentado explicar los efectos obtenidos en circunstancias patológicas y de estimulación específicas, pero la heterogeneidad de los estud...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses en relación con este artículo.

Agradecimientos

Agradecemos a la Prof. Christine Winter, Julia Klein, Alexandra de Francisco y Yolanda Sierra por su inestimable apoyo en la optimización de la metodología aquí descrita. MLS contó con el apoyo del Ministerio de Ciencia e Innovación, Instituto de Salud Carlos III (número de proyecto PI17/01766 y número de subvención BA21/0030) cofinanciado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), "A way to make Europe"; CIBERSAM (número de proyecto CB07/09/0031); Delegación del Gobierno para el Plan Nacional sobre Drogas (número de proyecto 2017/085); Fundación Mapfre; y Fundación Alicia Koplowitz.  MCV contó con el apoyo de la Fundación Tatiana Pérez de Guzmán el Bueno como becaria de esta institución, y del Programa Conjunto de la UE - Investigación de Enfermedades Neurodegenerativas (JPND). DRM fue apoyado por la Consejería de Educación e Investigación, Comunidad de Madrid, cofinanciado por el Fondo Social Europeo "Invertir en tu futuro" (número de subvención PEJD-2018-PRE/BMD-7899). NLR contó con el apoyo del Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón, "Programa Intramural de Impulso a la I+D+I 2019". El trabajo de MD fue apoyado por el Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN) y el Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (PT20/00044). El CNIC cuenta con el apoyo del Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), el Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN) y la Fundación Pro CNIC, y es un Centro de Excelencia Severo Ochoa (SEV-2015-0505).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Escáner Biospec 70/20 de 7 TeslaBruker, AlemaniaSN0021Escáner de resonancia magnética para la obtención de imágenes de animales pequeños
BetadineMeda Pharma S.L., España644625.6Solución de yodo (yodopovidona)
Beurer IL 11BeurerSN87318Luz infrarroja
Cable bipolar 50 cm con cobertura de malla de 50 cm hasta 100 cmPlastics One, EE. UU. 305-305 (CM)
Bipolar cable TT2  50 cm hasta 100 cmPlastics One, EE. UU305-340/2Cable bipolar TT2  50 cm hasta 100 cm
BuprexSchering-Plough, S.A961425Buprenorfina (analgésico)
Ceftriaxona Reig Jofré 1g IMLaboratorio Reig Jofré S.A., España624239.1Conmutador de ceftriaxona (antibiótico)
Plastics One, EE. UUConmutador de 4 canalesSL2 + 2C
Electrodos bipolares concéntricos de platino-iridioPlastics One, EE. UUElectrodos MS303/8-AIU/SPCpara perforadora DBS
BoshT58704perforadora
FDGCurium Pharma Spain S.A., España-----2-[18F]fluoro-2-desoxi-D-glucosa (radiotrazador PET)
Almohadilla térmicaDAGA, España23115Almohadilla térmica
KetolarPfizer S.L., España776211.9Ketamina (droga anestésica)
Lipolásica 2 mg/gBausch & Lomb S.A, España65277Gel lubricante oftálmico
MatLab R2021aThe MathWorks, IncSoftware de soporte para SPM12
MRIcroMcCausland Center for Brain Imaging,  Universidad de Carolina del Sur, EE. UU.v2.1.58-0Software para el preprocesamiento y análisis de imágenes
Estación de trabajo multimodal (MMWKS)BiiG, EspañaSoftware para el procesamiento y análisis de imágenes
Omicrom VISION VETRGB Medical Devices, España731100 ReV BMonitor cardiorrespiratorio para imágenes pequeñas
Prevex Bastoncillos de algodónPrevex, Finlandia-----Bastoncillos de algodón
SevoraneAbbVie Spain, S.L.U, España673186.4Sevoflurano (anestesia inhalatoria)
Tornillos pequeñosMax Witte GmbH1,2 x 2 DIN 84 A2Tornillos pequeños
Instrumento estereotáxico estándar con bastidor en U para rata, 18° Barra para la orejaAparato de Harvard, EE. UU.75-1801Marco estereotáctico de dos brazos para ratas
Mapeo Paramétrico Estadístico (SPM12)Centro Wellcome para Neuroimágenes Humanas, UCL Instituto de Neurología Queen Square, Reino UnidoSPM12Software para el análisis de imágenes por vóxeles
STG1004Multi Channel Systems GmbH, AlemaniaSTG1004Estimulador aislado
SuperArgus EscánerPET/CTSedecal, EspañaS0026403Escáner NanoPET/CT para la imagen de pequeños animales
Hilo de sutura con aguja, 1/ºLorca Marí n S.A., España55325Sutura trenzada de seda natural no absorbible 1/0, con aguja triangular
Technovit 4004 (polvo y líquido)Kulzer Technique, Alemania64708471; 64708474Cemento dental acrílico para grifo de craneotomía
Ratas Wistar (Rattus norvergicus)Charles River, EspañaAnimalarioutilizado
XylagesicLaboratorios Karizoo, A.A, España572599-4Xilacina (droga anestésica)
Normon S.A., España602910Mepivacaína en gel para uso tópico
. . para DBS.

Referencias

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