Aislamiento de microvesículas esplénicas en un modelo murino de infección bacteriana intraperitoneal

Summary

Las microvesículas que se desprenden de la membrana plasmática actúan como efectores celulares. Las microvesículas del bazo (SMV) son marcadores sustitutos de afecciones fisiopatológicas. En ratas y ratones, el contenido y las propiedades de SMV caracterizan el envejecimiento o la inflamación y se alteran con los tratamientos citoprotectores, lo que los convierte en una herramienta de seguimiento valiosa pero abundante para la investigación preclínica.

Abstract

Las microvesículas (MV) son fragmentos submicrónicos liberados de la membrana plasmática de las células activadas que actúan como efectores celulares proinflamatorios y procoagulantes. En ratas, los MV del bazo (SMV) son marcadores indirectos de afecciones fisiopatológicas. Estudios previos in vitro demostraron que Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), un importante patógeno periodontal, permite la diseminación endotelial y la apoptosis, mientras que el lipopolisacárido (LPS) favorece la diseminación de microvesículas derivadas de esplenocitos (SMV). Los estudios in vivo demostraron la viabilidad del control farmacológico de la excreción del SMV. El presente protocolo establece un procedimiento estandarizado para aislar los SMV esplénicos del modelo de infección murina aguda por P. gingivalis . La infección por P. gingivalis fue inducida en ratones jóvenes C57BL/6 por inyección intraperitoneal (tres inyecciones de 5 x 10⁷ bacterias/semana). Después de dos semanas, se recolectaron los bazos, se pesaron y se contaron los esplenocitos. Los SMV se aislaron y cuantificaron mediante ensayos de proteínas, ARN y protrombinasas. La viabilidad celular se evaluó mediante yoduro de propidio o colorantes de exclusión de azul de tripano. Tras la extracción de los esplenocitos, los recuentos de neutrófilos se obtuvieron por citometría de flujo después de 24 h de cultivo de esplenocitos. En ratones inyectados por P. gingivalis, se observó un aumento de 2,5 veces en el peso del bazo y un aumento de 2,3 veces en el recuento de esplenocitos, mientras que el recuento de neutrófilos aumentó 40 veces. La viabilidad celular de los esplenocitos de ratones inyectados con P. gingival osciló entre el 75% y el 96% y disminuyó en un 50% después de 24 h de cultivo sin ninguna diferencia significativa en comparación con los controles no expuestos. Sin embargo, los esplenocitos de ratones inyectados arrojan mayores cantidades de MV mediante el ensayo de protrombinasa o las mediciones de proteínas. Los datos demuestran que los SMV procoagulantes son herramientas fiables para evaluar una respuesta temprana del bazo a la infección intraperitoneal por P. gingivalis .

Introduction

Las microvesículas (MV), también denominadas micropartículas o ectosomas, son fragmentos de membrana plasmática con un diámetro de 0,1-1,0 μm que se liberan en los fluidos corporales y en el espacio extracelular en respuesta a diversos estímulos celulares. Identificados inicialmente como polvo plaquetario que expone fosfolípidos procoagulantes, principalmente fosfatidilserina (PSer), los MV constituyen una superficie adicional para el ensamblaje de los complejos de coagulación sanguínea ^1,2. El papel clave de los MV circulantes como efectores procoagulantes se ha demostrado en pacientes con síndrome de Scott², una enfermedad genética rara que conduce a una exposición disfuncional a PSer y sangrado (Figura complementaria 1). Los MV han sido ampliamente estudiados como biomarcadores circulantes de riesgo trombótico en enfermedades crónicas asociadas a trastornos cardiovasculares como la diabetes, la enfermedad renal crónica, la preeclampsia y la hipertensión^{arterial 3,4}. Actualmente se reconocen como verdaderos efectores celulares en fluidos o tejidos de órganos como el miocardio¹. Debido a que transportan proteínas activas, lípidos y miARN, modulan de forma remota respuestas vasculares como la hemostasia, la inflamación, la angiogénesis vascular y el crecimiento vascular o la remodelación de tejidos⁵.

Mientras que los estudios clínicos examinan el valor pronóstico de los MV en relación con los factores de riesgo, los MV aislados de los fluidos o tejidos del paciente permiten la evaluación ex vivo de sus propiedades efectoras⁶. El desciframiento de los mecanismos que gobiernan la biogénesis de los MV y las capacidades de comunicación cruzada se logra generalmente en modelos de cultivo celular para identificar moléculas activas expuestas o encapsuladas dentro de los MV y su señalización posterior. Las interacciones de MV con las células diana dependerán de la unión proteína/proteína de membrana, cuando se disponga de contraligandos adecuados, y/o de la fusión lipídica⁷.

En condiciones fisiológicas, las MV que circulan en el plasma se originan mayoritariamente en células vasculares, identificadas por los marcadores de diferenciación de grupos de linaje (CD)^8,9. Sin embargo, en patología, especialmente en el cáncer¹⁰ y el rechazo del injerto^11,12, los MV se desprenden del tejido dañado y presentan características nocivas procoagulantes y proinflamatorias. Estos se detectan en la circulación sistémica, lo que los convierte en sondas útiles para el seguimiento de terapias protectoras o de rejuvenecimiento, y posibles dianas farmacológicas¹³. Debido a que los MV circulan como un grupo de almacenamiento dinámico que refleja la homeostasis de las células vasculares y tisulares en la salud y la enfermedad, también es necesario investigar in vivo una mejor comprensión de su acción a distancia, después de la inyección intravenosa o la instilación nasal en animales pequeños^14,15. De hecho, se ha considerado que los VM contribuyen en gran medida a las intrincadas vías que acoplan la inflamación exagerada y la trombosis¹⁶.

La periodontitis es una enfermedad inflamatoria de origen infeccioso que afecta a los tejidos de soporte dental^17,18 y se asocia al riesgo trombótico. Se caracteriza por sangrado gingival, destrucción del hueso alveolar, movilidad dental y, en última instancia, puede provocar la pérdida de dientes. La periodontitis es altamente prevalente en todo el mundo y afecta a más del 50% de la población, con un 11% que presenta una forma grave¹⁹. La periodontitis es inducida por la disbiosis bacteriana de las biopelículas subgingivales, que sostienen una respuesta inflamatoria exacerbada que desencadena la destrucción del tejido²⁰. Durante la última década, la periodontitis se ha relacionado con enfermedades sistémicas como trastornos cardiovasculares, diabetes y artritis reumatoide. Las posibles explicaciones son la acción de los patógenos periodontales a distancia y/o el aumento de la inflamación sistémica mediada por citocinas proinflamatorias como la interleucina (IL-1, IL-6) y el TNF-α^21,22.

Entre los patógenos asociados con el inicio y desarrollo de la periodontitis, Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis)²³ se encuentra en las lesiones más graves que cosechan varios factores de virulencia, incluyendo el lipopolisacárido (LPS)²⁴ que induce respuestas inflamatorias mediadas por receptores tipo Toll (TLR)²⁵ y el reclutamiento de neutrófilos y leucocitos polimorfonucleares (PMN) en el sitio de la infección inicial²⁶. El LPS de P. gingivalis activa TLR-4 o TLR-2, facilitando la detección inmune y la evasión de la supervivencia bacteriana²⁷. A nivel vascular, la activación de TLR2 por LPS se asocia con inmunotrombosis. La capacidad única de P. gingivalis para provocar la señalización de TLR-2, mientras que el reconocimiento dependiente de TLR-4 se ve significativamente afectado, favorece la infección persistente de bajo grado^28,29.

Los procedimientos in vivo para estudiar las respuestas de MV a la infección crónica y sostenida de patógenos de bajo grado son escasos. Los abordajes metodológicos para la extracción de MVs tisulares están poco descritos en la literatura y generalmente se refieren a la recolección de MVs a partir de tejidos patológicos como tumores sólidos, esteatosis hepática, placas aterotrombóticas o injertos 11,29,30, mientras que el bazo detecta bacterias y virus en el torrente sanguíneo. También almacena eritrocitos, plaquetas, linfocitos, monocitos, basófilos y eosinófilos implicados en la respuesta inmunitaria. Los granulocitos, como los neutrófilos de la pulpa roja, también generan especies reactivas de oxígeno (ROS) y proteasas que destruyen los patógenos y evitan la propagación de la infección^31,32. Sorprendentemente, y hasta donde sabemos, las VM del bazo no se investigan en el contexto de las lesiones tisulares inducidas por patógenos. Existe una necesidad global no satisfecha de estudiar las variaciones de las VM tisulares en fisiopatología.

Los datos in vitro de nuestro laboratorio mostraron que el LPS induce el desprendimiento de MVs procoagulantes de los esplenocitos de rata, lo que a su vez provoca la senescencia de células endoteliales coronarias cultivadas y un fenotipo endotelial proinflamatorio y proinflamatorio consecutivo¹¹. La viabilidad del control farmacológico de los MV del bazo se demostró aún más después de tratar al animal con una fórmula optimizada de omega-3. Se encontró que la sonda oral de ratas de mediana edad y anciana era protectora tanto contra el desprendimiento de MVs procoagulantes de los esplenocitos como contra sus propiedades nocivas prosenescentes hacia el endotelio coronario³³.

En comparación con la sangre, el bazo ofrece la ventaja de ser una fuente importante de leucocitos en un individuo. Además, recientemente se ha propuesto un eje esplénico-cardíaco ^3,34, lo que convierte al bazo en un posible contribuyente al riesgo cardiovascular relacionado con la infección de interés beneficioso para el control farmacológico. La evaluación de las propiedades o la liberación de los SMV es clave para comprender las respuestas inflamatorias o inducidas por patógenos. Curiosamente, se puede conseguir en animales tratados y en diferentes modelos fisiopatológicos (edad, hipertensión, diabetes). De hecho, al comparar ratas de mediana edad y ancianas³³, las diferencias en las propiedades y la liberación de MVs del bazo se pueden evidenciar después de un simple cultivo de esplenocitos de 24 h.

Dadas las evidencias anteriores de la alteración de las propiedades efectoras de las MV del bazo con la condición fisiopatológica y la factibilidad de su control farmacológico en ratas, se describe un protocolo estandarizado para el aislamiento de las MV del bazo murino. El procedimiento se ajustaría mejor a las investigaciones en profundidad de los mecanismos in vivo que respaldan los efectos mediados por SMV, eventualmente en ratones modificados. El procedimiento se estableció en ratones C57BL/6 utilizando una infección intraperitoneal local por P. gingivalis, para establecer pruebas de una acción remota del patógeno sobre las propiedades efectoras del bazo MV (SMV).

Protocol

Todos los protocolos experimentales fueron aprobados y siguieron las directrices pertinentes del Comité de Ética local (APAFIS#28745-2020121815051557) y de cuidado animal de la Universidad de origen y del INSERM. Para los experimentos se utilizaron ratones machos jóvenes C57BL/6, de 6-8 semanas de edad. Los ratones fueron examinados regularmente para evaluar el dolor y el estrés, y sus pesos fueron monitoreados diariamente. A menos que se indique lo contrario, todos los tampones y soluciones de extracción deben ser estériles y estar a temperatura ambiente.

1. Preparación animal

1. Administrar a los ratones seis inyecciones intraperitoneales de P. gingivalis (PG) cada 2 días durante 2 semanas (tres inyecciones de 5 x 10⁷ bacterias/semana, Ficha Suplementaria 1).
2. Anestesiar a los ratones con una combinación de 100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilacina.
3. Sacrificar los ratones anestesiados y extraer el bazo después de la laparotomía.
   NOTA: Las condiciones específicas para la infección por P. gingivalis y el sacrificio de los animales para la recolección de bazo se detallan en la sección "experimento con animales" del Archivo Complementario 1. La representación esquemática de los pasos del protocolo se muestra en la Figura 1.

2. Extracción de esplenocitos

1. Con un bisturí, pique el tejido del bazo en rodajas de ~ 1 mm en una placa de Petri ya llena con 3 mL de RPMI que contenga antibióticos (estreptomicina (100 U/mL)/Penicilina (100 U/mL), Fungizone (250 mg/mL), L-glutamina (2 mM)), y suplementada con un 10% de suero fetal bovino (FBS) (consulte la tabla de materiales).
2. Transfiera las rodajas a un colador (ver Tabla de Materiales), que está previamente unido a un tubo de poliestireno de 50 mL.
3. Use el émbolo de una jeringa como mortero para triturar los pañuelos en el tamiz.
4. Enjuague el tamiz con el medio RPMI (3 mL).
5. Centrifugar la suspensión celular eluida a 450 x g durante 5 min a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante con precaución por reflujo.

3. Extirpación de eritrocitos mediante un choque osmótico

1. Agregue 1 mL de tampón ACK (ver Tabla de Materiales), mezcle bien, incube durante 3 min a temperatura ambiente y agite suavemente con la rotación de la mano.
2. Diluir añadiendo 9 mL de RPMI y mezclar bien mediante aspiración y reflujo.
3. Centrifugar a 450 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
4. Deseche el sobrenadante por aspiración y reflujo, y vuelva a suspender el pellet en 5 mL de medio RPMI.
5. Mezcle suavemente (aspiración/reflujo) y, finalmente, elimine los residuos lipídicos pipeteando o utilizando un colador.

4. Ajuste de la concentración de esplenocitos aislados

1. Llene un microtubo de 1,5 mL que contenga 900 μL de RPMI.
2. Con una micropipeta, tome 100 μL de la suspensión celular, agréguela al microtubo de 1,5 mL que contiene 900 μL de medio RPMI y mezcle bien.
3. Transfiera 10 μL de las células diluidas a un microtubo, agregue 10 μL del tinte de exclusión azul de tripano y mezcle bien.
4. Coloque 10 μL de la solución (paso 3.3) en el portaobjetos de recuento del contador automático de células (consulte la Tabla de materiales) y determine el recuento de células.
   NOTA: El software del dispositivo da dos valores: el número total de celdas y el número y porcentaje de celdas vivas.
5. Ajuste la concentración de células vivas a 3 o 5 x 10⁶ células/mL (V_máx . = 20 mL; la capacidad total máxima es de 100 x 10⁶ células/mL).
6. Siembre las células en un matraz de 75 mL que contenga RPMI.
7. Incubar el matraz verticalmente en una incubadora humidificada a 37 °C durante 24 h.
   PRECAUCIÓN: El azul de tripano es un agente mutagénico y cancerígeno^35,36. Asegúrese de usar guantes mientras cuenta, incluso fuera de la capucha. Deseche inmediatamente las puntas y los líquidos en los recipientes y lave la superficie del banco.
   NOTA: Si las células recolectadas miden menos de 50 x 10⁶, use un matraz de cultivo de 25 mL. El número de celular no debe variar mucho de un individuo a otro. El porcentaje de células vivas es generalmente superior al 80% en este paso.

5. Aislamiento de microvesículas de esplenocitos

1. Pasadas las 24 h, verter el contenido del matraz en un tubo de polipropileno o poliestireno de 50 mL.
2. Centrifugar a 450 x g durante 15 min a temperatura ambiente para eliminar las células y los residuos.
3. Después de la centrifugación, conservar 100 μL del 1er sobrenadante (SN1) para una eventual medición de la concentración inicial de MV para calcular el rendimiento de aislamiento. Observe el volumen SN1.
4. Centrifugar el SN1 a 450 x g durante 15 min a temperatura ambiente.
5. Deseche el pellet y vuelva a centrifugar a 450 x g durante 15 min a temperatura ambiente. Retire y recoja rápidamente SN2 (observe el volumen).
6. Transfiera SN2 a microtubos de 1,8 mL con fondos de forma cónica. Mantenga 100 μL de SN2 para una medición final de la concentración inicial de MV para calcular el rendimiento de aislamiento en caso de que demasiados residuos eventualmente perjudiquen la medición de MV en SN1.
7. Agregue 5 mL de medio RPMI a la pellet (células) y cuente los esplenocitos.
   NOTA: La suspensión celular también se puede fijar para la caracterización de citometría de flujo en paraformaldehído al 0,1% (concentración final)³⁷.
8. Centrifugar SN2 a 14.000 x g durante 1 h a 4 °C y, finalmente, refrigerar el rotor con antelación haciendo funcionar el rotor vacío a 4 °C. Este paso genera SN3.
9. Retire inmediatamente SN3 de cada microtubo invirtiendo un solo tubo estéril de 50 ml (debajo del capó). Observe el volumen SN3.
10. Mezcle suavemente SN3 con una pipeta debajo del capó. Guarde las alícuotas para eventuales mediciones en la suspensión.
    NOTA: La solución ahora está agotada de MV, pero contiene los mediadores solubles y exosomas.
11. Raspar cada microtubo (cerrado) en una rejilla con púas para favorecer mecánicamente la resuspensión de los MV en el pellet.
12. Añadir 200 μL de solución salina balanceada de Hank sin Ca²⁺ y Mg²⁺ (HBSS) en el primer microtubo (ver Tabla de Materiales).
13. Vuelva a suspender el pellet MV del primer tubo mediante ciclos suaves de aspiración/reflujo (~10 veces) con una micropipeta de 1 mL. Tenga mucho cuidado de evitar la formación de espuma, ya que esto promoverá la oxidación de las vesículas y otras fracciones en la suspensión.
14. Coseche los primeros 200 μL de MV resuspendidos y viértalos en el segundo tubo sobre el pellet. Mezcle suavemente como se indicó anteriormente, y luego vierta nuevamente en el tercer tubo y mezcle suavemente. La suspensión se vuelve cada vez más turbia de tubo a tubo. Cierre el tercer tubo.
15. Inicie la recolección de los siguientes tres microtubos como se indicó anteriormente (paso 4.14).
16. Recoja todos los MV resuspendidos en un solo (o dos) microtubos colectores (2 mL con fondo de forma cónica). Guarde 50 μL para el cálculo final del rendimiento de este paso. Fíjate en el volumen de la suspensión.
17. Centrifugar el tubo colector a 14.000 x g durante 1 h a 4 °C. Este paso genera SN4.
18. Deseche inmediatamente el SN4 (vierta sobre un tubo colector de sobrenadante). Mantenga una alícuota de SN4 para calcular el rendimiento de la etapa de purificación y vuelva a suspender suavemente el pellet en 500 μL de HBBS (sin Ca²⁺ y Mg²⁺). Conserve una alícuota de 50 μL del pellet resuspendido para calcular el rendimiento de purificación y anotar su volumen.
19. Almacene el pellet resuspendido a 4 °C durante un máximo de un mes para ensayos funcionales en condiciones estériles o a -20 °C para ensayos estructurales.
20. Calcule el rendimiento de purificación (consulte la NOTA a continuación) de cada paso o de todo el procedimiento midiendo la concentración de MV en sobrenadantes y/o suspensiones de pellets.
    NOTA: Rendimiento de purificación (%): ([MV1] x volumen SN1) / ([MV4] x volumen final de suspensión) x 100.
    Este rendimiento debe racionalizarse según el número de esplenocitos aislados del matraz de cultivo y contarse en el paso 4.4. El rendimiento de purificación del presente experimento es de ~70% a partir de 111 x 10⁶ células y 60 mL de sobrenadante.
    1. Evaluar la pérdida de SMVs causada por el procedimiento midiendo los SMVs que quedan en los sobrenadantes empobrecidos de SMVs y que contienen principalmente exosomas (SN2 y SN4).
    2. Mida la concentración de MV mediante TRPS o ensayo de protrombinasa³⁸ para alta sensibilidad y especificidad.
       PRECAUCIÓN: Coseche los MV después de la centrifugación mediante el vertido rápido al revés del sobrenadante. Esperar o usar microtubos en forma de U provocará la pérdida de MV en la pared del microtubo. Nunca use una micropipeta para desechar el sobrenadante; En su lugar, el pellet se puede aspirar. Nunca retrase el proceso después de que se detenga la centrífuga. La centrifugación a sobrevelocidad dará lugar a la contaminación del pellet MV por exosomas.
       NOTA: Las velocidades y la duración de la centrifugación están optimizadas para un enriquecimiento de MV con una contaminación mínima por exosomas. Este protocolo no es fiable para el estudio de las MVs de monocitos/macrófagos del bazo, ya que estas células pueden fagocitar y recapturar rápidamente sus propias MVs³⁹. El protocolo no se puede pausar y reiniciar más tarde debido a la pérdida de células debido a la viabilidad de la célula.

Results

Los datos proporcionados ofrecen una representación completa de todo el procedimiento, utilizando dos condiciones animales principales: ratones jóvenes C57BL/6 no tratados y sus compañeros de camada sometidos a seis inyecciones intraperitoneales (IP) de PG cada 2 días, durante 2 semanas. También muestran la acción remota de una inyección intraperitoneal de PG sobre la respuesta del bazo después de 2 semanas. Las microvesículas de los esplenocitos se cuantificaron mediante ensayo enzimático de protrombinasa o midiendo sus...

Discussion

El presente estudio confirma que el bazo es una fuente importante y fiable de MVs con relevancia fisiopatológica en comparación con otras fuentes como la sangre, de volumen limitado en ratones. Siempre que se tomen precauciones, el método es fácil de configurar y no requiere equipos costosos. Dado que no se dispone de otra vía alternativa que no sea la evaluación in vivo , el modelo actual parece ser un método valioso para estudiar el impacto de los profármacos en la excreción d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos de 2 mL tipo Eppendorf	Dutscher	54816	cónico sté riel microtubos
Allegra 64 R Centrífuga	Beckman Coulter
Contador de células automático	Biorad
Albúmina sérica bovina	Euromedex	04-100-812-E	Preparado, filtrado con 0,22 µ m tamiz y almacenado a 4 & grados; C en condiciones estériles utilizando las siguientes fórmulas: 2 mM de EDTA, 0,5% de BSA y PBS estéril
CD11 (Mac-1)	e-Biosciences	45-00112-80	Conjugado con eFluor 450; λ máx excitación 405 nm y lambda; máx emisión 445 nm
CD16/32	BD Biosciences	553142	EDTA no conjugado
	Calbiochem Calbiochem		S 6381-92-6
Tubo de halcón	Célula estrella	227261	50 mL
Suero fetal bovino	Dutscher	S1810-500	Número de lote = S14028S1810
Fortessa Aria	BD Biosciences		para Citómetro de
flujo Fortessa	Becton-Dickinson.
Fungizone	PAN biotech	P06-01050
HBSS	Gibco	14175-053	Sin rojo fenol, sin Ca+2 y Mg+2
ICAM-1		abcam ab171123
LYG-6 (Gr-1)	BD Biosciences	566218	Conjugado a BUV395; λ máx 348 nm, y lambda; máx emisión 395 nm
Tampón de lisis eritrocitos (ACK)	Sigma		Preparado, filtrado con 0,22 y micro; m tamiz y almacenado a 4 °; C en condiciones estériles utilizando las siguientes fórmulas: NH4Cl, 0,15 M (molaridad), 53,491 (mw) 4 g KHCO3 1 mM (molaridad) 100,115 (mw), 50 mg EDTA  0,1 mM (molaridad), 292,24 (mw), 14,6 g pH: 7,2– 7.4
Espectrofotómetro NanoDrop 1000	Thermoscientific
PBS	Lonza	17-516F	Sin Ca+2  y Mg+2
Placa			100 mm
Tubo de poliestireno	Falcon	352070
q-Nano Gold	iZON science
Medio de cultivo RPMI 1640: 2 g/L de glucosa	PAN biotech	p04-18047	Suplementado con estreptomicina (100 U/mL)/Penicilina (100 U/mL), Fungizone (250 mg/mL), L-glutamina (2 mM) y FBS 10%.
Bisturíes
Tamiz Nylon	Falcon USA	352360	100 µ m
Estreptomicina/Penicilina	PAN biotech	P06-07100
Jeringa			2 mL
Azul de Trypan	Biorad	1450013
VCAM1	abcam	ab215380