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Artículo de método

Cultivos primarios de astrocitos de rata y microglia y su uso en el estudio de la esclerosis lateral amiotrófica

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DOI:

10.3791/63483

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23 de junio de 2022

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1Center for Laser Microscopy, Institute for Physiology and Biochemistry “Jean Giaja”, University of Belgrade Faculty of Biology

En este artículo

Resumen

Presentamos aquí un protocolo sobre cómo preparar cultivos primarios de células gliales, astrocitos y microglía de cortezas de rata para imágenes de video de lapso de tiempo de Ca2+ intracelular para la investigación sobre fisiopatología de la esclerosis lateral amiotrófica en el modelo de rata hSOD1G93A .

Resumen

Este protocolo demuestra cómo preparar cultivos primarios de células gliales, astrocitos y microglía de las cortezas de ratas Sprague Dawley y cómo usar estas células con el fin de estudiar la fisiopatología de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) en el modelo hSOD1G93A de rata. Primero, el protocolo muestra cómo aislar y cultivar astrocitos y microglia de cortezas de ratas postnatales, y luego cómo caracterizar y probar la pureza de estos cultivos mediante inmunocitoquímica utilizando el marcador de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de los astrocitos y el marcador microglial ionizado de la molécula adaptadora de unión al calcio 1 (Iba1). En la siguiente etapa, se describen métodos para la carga de colorantes (Fluo 4-AM sensible al calcio) de células cultivadas y las grabaciones de cambios de Ca2+ en experimentos de imágenes de video en células vivas.

Los ejemplos de grabaciones de vídeo consisten en: (1) casos de imágenes de Ca2+ de astrocitos cultivados expuestos agudamente a inmunoglobulina G (IgG) aislados de pacientes con ELA, mostrando una respuesta característica y específica en comparación con la respuesta al ATP como se demostró en el mismo experimento. Los ejemplos también muestran un aumento transitorio más pronunciado en la concentración de calcio intracelular evocado por ALS IgG en astrocitos hSOD1G93A en comparación con los controles no transgénicos; (2) imágenes de Ca 2+ de astrocitos cultivados durante una depleción de las reservas de calcio por thapsigargin (Thg), un inhibidor no competitivo de la ATPasa del retículo endoplásmico Ca 2+, seguida de una entrada de calcio operada por el almacén provocada por la adición de calcio en la solución de registro, lo que demuestra la diferencia entre la operación de almacenamiento de Ca2+ en hSOD1G93A y en astrocitos no transgénicos; (3) Las imágenes de Ca 2+ de la microglía cultivada muestran predominantemente una falta de respuesta a la IgG de ELA, mientras que la aplicación de ATP provocó un cambio de Ca2+. Este documento también enfatiza posibles advertencias y precauciones con respecto a la densidad celular crítica y la pureza de los cultivos, eligiendo la concentración correcta del colorante Ca2+ y las técnicas de carga de colorante.

Introducción

Las técnicas de cultivo celular han dado lugar a numerosos avances en diversos campos de la neurofisiología celular en la salud y la enfermedad. En particular, los cultivos celulares primarios, recién aislados del tejido neuronal de un animal de laboratorio, permiten al experimentador estudiar de cerca el comportamiento de diversas células en diferentes medios bioquímicos y configuraciones fisiológicas. El uso de diferentes indicadores fisiológicos fluorescentes, como los colorantes sensibles al Ca2+ en combinación con la microscopía de video de lapso de tiempo, proporciona una mejor comprensión de los procesos biofísicos y bioquímicos celulares en tiempo real.

La ELA es una enfermedad neurodegenerativa devastadora que afecta a las neuronas motoras superiores e inferiores1. La enfermedad tiene una patogénesis compleja de tipo familiar, pero principalmente de forma esporádica (90% de los casos)2. Es bien sabido que los mecanismos autónomos no celulares contribuyen a la fisiopatología de la ELA, principalmente debido al papel esencial de las células gliales3. La ELA también se caracteriza bien como una enfermedad neuroinflamatoria con la participación de factores humorales y celulares de inflamación.

La inmunoglobulina G es ampliamente utilizada como marcador molecular en la ELA y otras enfermedades neurodegenerativas. El estudio del nivel sérico de este marcador puede indicar la presencia y el estadio de la neuroinflamación en la enfermedad 4,5,6, mientras que su presencia en el líquido cefalorraquídeo puede indicar una ruptura de la barrera hematoencefálica7. Las IgG también fueron identificadas como depósitos en las neuronas motoras de la médula espinal de pacientes con ELA7. Sin embargo, este abordaje ha mostrado algunas inconsistencias en la correlación del nivel de IgG con el estadio y las características de la enfermedad6.

La IgG aislada de sueros de pacientes con ELA (ALS IgG) puede inducir una respuesta al calcio enastrocitos 8 naïve y la liberación de glutamato en las neuronas, apuntando a un efecto excitotóxico, un sello distintivo de la patología de ELA9. Sin embargo, los estudios en el modelo de rata hSOD1G93A ALS (que contiene múltiples copias de la mutación SOD1 humana10) mostraron una serie de marcadores de estrés oxidativo en células neurogliales cultivadas 11, tejidos 12,13,14 o animales vivos 13. Cabe destacar que los astrocitos cultivados del modelo de rata ALS fueron más propensos al estrés oxidativo inducido por el peróxido que la astroglía de compañeros de camada no transgénicos11.

Las células microgliales en cultivo se ven afectadas por la ELA IgG de una manera menos aparente. A saber, una línea celular microglial BV-2 mostró un aumento en la señal de marcadores fluorescentes de estrés oxidativo en respuesta a la aplicación de solo 4/11 muestras de pacientes con ELAIgG 15. Es bien sabido que la microglía participa en muchas patologías neuroinflamatorias, añadiendo estrés oxidativo y fase de progresión tardía en el mecanismo autónomo no celular de ALS16,17. Sin embargo, los datos con ALS IgG indicaron que estas células pueden no ser tan reactivas como los astrocitos a estos factores humorales de la inflamación de la ELA. Se han realizado varios estudios con astrocitos primarios de modelos murinos de ELA, no solo en cachorros sino también en animales sintomáticos, ya sea en el cerebro o en la médula espinal 18,19,20,21. Esto también es cierto para los cultivos primarios microgliales, aunque en menor medida que los astrocitos y principalmente de regiones cerebrales en la etapa embrionaria22,23,24.

Utilizamos imágenes de video de lapso de tiempo de Ca2+ en células en cultivo principalmente como un medio para seguir los transitorios intracelulares de este ion como un marcador fisiológico de excitotoxicidad. Así, mediante la caracterización biofísica de estos transitorios (amplitud, área bajo transitorio, tiempo de subida, frecuencia) el investigador puede obtener parámetros diagnósticos experimentales a partir de diversos modelos celulares de neurodegeneración. Por lo tanto, esta técnica ofrece una ventaja de una evaluación fisiológica cuantitativa de IgG como biomarcadores de enfermedades. Existe una gran cantidad de literatura sobre el papel de las IgG y el Ca2+ en la inducción de la ELA. La mayoría de estos estudios se realizaron mediante la inducción de ELA mediante la inyección de IgG de pacientes en animales de experimentación 25,26,27,28,29, que luego mostraron elevación intracelular de Ca 2+ y depósitos de IgG. Una línea de estudios exploró el efecto de las IgG de ELA en la sinapsis motora in vitro30,31,32. En el contexto anterior, la técnica presentada aquí pone el foco en las células gliales como actores importantes en el mecanismo autónomo no celular de la ELA y cuantifica su potencial respuesta excitotóxica a las IgG como factores humorales de neuroinflamación. Este enfoque puede tener una aplicación más amplia en la prueba de otros factores humorales como sueros enteros, LCR o citoquinas en diferentes sistemas de cultivo celular y en modelos celulares de inflamación general.

Este documento describe cómo preparar cultivos primarios de células gliales, astrocitos y microglía de las cortezas de ratas Sprague Dawley y cómo usar aún más estas células para estudiar la fisiopatología de la ELA con IgG derivada de sueros del paciente. Los protocolos se detallan para la carga de colorante de células cultivadas (Figura 1) y las grabaciones de cambios de Ca2+ en experimentos de imágenes de video de lapso de tiempo. Ejemplos de grabaciones de video mostrarán cómo reaccionan las células gliales a la IgG ALS en comparación con el ATP, este último activando los receptores de membrana purinérgica. Se muestra por primera vez un ejemplo de cómo los astrocitos aislados del cerebro de rata hSOD1G93A ALS reaccionan con una respuesta de Ca 2+ más pronunciada a la IgG de ELA en comparación con los controles no transgénicos y cómo relacionar este proceso con las diferencias en la operación de almacenamiento de Ca2+. También se muestra un ejemplo de imágenes de calcio en células microgliales con un desafío agudo con ELA IgG, con solo una respuesta modesta de calcio intracelular.

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Protocolo

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directivas de la UE sobre la protección de los animales con fines científicos y con el permiso de la Comisión de Ética de la Facultad de Biología de la Universidad de Belgrado (número de aprobación EK-BF-2016/08). En cuanto al material del paciente (sueros para IgGs), se recolectó para el examen clínico de rutina con el consentimiento informado del paciente de acuerdo con el Código de Ética de la Asociación Médica Mundial (Declaración de Helsinki) para experimentos con humanos. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Centro Clínico de Serbia (No. 850/6).

1. Preparación del cultivo celular primario

  1. Aislamiento del tejido cerebral
    NOTA: El aislamiento debe realizarse en hielo, utilizando soluciones heladas.
    1. Utilizar cachorros recién nacidos de 1 a 3 días de edad para cultivo celular neonatal primario33.
      NOTA: Para el estudio aquí presentado, se utilizó Sprague Dawley hSOD1G93A y ratas no transgénicas. Para el genotipado, se utilizaron colas de rata para la posterior extracción de ADN y PCR.
    2. Espolvorea la cabeza del cachorro con etanol al 70% e inmediatamente decapitarla rápidamente usando tijeras.
    3. Abra la piel con tijeras de ángulo pequeño para exponer el cráneo. Abra el cráneo haciendo un corte desde el foramen magnum hacia las órbitas. A continuación, haga un corte perpendicular en la línea media. Retire el cerebro del cráneo y colóquelo en una placa de Petri que contenga solución salina tamponada con fosfato (PBS).
      NOTA: Limpie las herramientas entre cachorros para evitar la contaminación cruzada entre cachorros transgénicos y no transgénicos. El aislamiento de las cortezas del resto del cerebro debe hacerse bajo un microscopio estereoscópico.
    4. Usando la punta de los fórceps, rasgue las conexiones entre ambos hemisferios. Luego, separe los hemisferios con pinzas curvas empujando suavemente un hemisferio desde el centro hacia un lado.
    5. Retire las meninges rasgándolas cuidadosamente con fórceps rectas y curvas.
    6. Retire el hipocampo pellizcándolo con un fórceps curvo. Deseche el hipocampo o úselo para otra preparación de cultivo celular.
      NOTA: Se deben realizar pasos adicionales debajo de la campana de flujo laminar para garantizar condiciones estériles.
  2. Homogeneización y disociación tisular
    1. Transfiera una corteza a un tubo de 15 ml lleno de 3 ml de PBS frío. Pipet la suspensión hacia arriba y hacia abajo con una punta de 1 mL, completando 10-15 golpes hasta que la suspensión se vuelva homogénea.
      NOTA: Tenga mucho cuidado de no producir burbujas en este proceso.
    2. Centrifugar a 500 × g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 3 ml de PBS frío pipeteándolo hacia arriba y hacia abajo con una punta de 1 ml. Repita el paso de centrifugación.
      NOTA: Todas las soluciones utilizadas a partir de este punto deben precalentarse a 37 °C.
    3. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 2 ml de medio de águila modificado (DMEM) completo de Dulbecco suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) y antibióticos (penicilina y estreptomicina). Transfiera el homogeneizado a un tubo de 2 ml.
    4. Pase el homogeneizado a través de agujas de 21 G y 23 G (tres veces cada una) para hacer una suspensión de células individuales.
      NOTA: Tenga mucho cuidado de no producir burbujas en este proceso.
  3. Verter la suspensión celular preparada a partir de una corteza en una placa de Petri de 60 mm de diámetro o en un matraz T25 (con la superficie pretratada con un recubrimiento polipeptídico para el crecimiento de células adherentes) que contenga 3 ml de DMEM completo. Agite ligeramente la placa de Petri para que la suspensión se distribuya uniformemente.
  4. Cultivar las células en la incubadora en una atmósfera humidificada de 5% de CO2/95% de aire a 37 °C.
  5. Cambie el medio 48 h después del aislamiento y reemplace el medio cada 3 días.
  6. Para promover el crecimiento de astrocitos, cuando las células alcanzan una confluencia del 70% -80%, lávelas con PBS precalentado para eliminar las células gliales sueltas y los rastros de FBS en el medio.
    1. Tripsinizar la capa subyacente de astrocitos añadiendo 1 ml de solución de tripsina precalentada (tripsina al 0,25%, EDTA al 0,02% en PBS, filtrada estéril).
    2. Colocar el plato en la incubadora a 37 °C durante 2-5 min.
    3. Revise las células bajo el microscopio. Cuando comiencen a desprenderse, agregue 4 ml de DMEM completo.
    4. Recoja la suspensión celular y transfiérala a un tubo de 15 ml. Centrifugar a 500 × g durante 5 min.
    5. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 mL de medio completo. Contar las células con un hemocitómetro.
    6. Replacar las células a una densidad de 104 células/cm2 en 5 ml de DMEM completo fresco.
  7. Cambiar el medio cada 3 días. Para minimizar la presencia de otros tipos de células gliales, después de que los astrocitos alcancen el 50% de confluencia y antes de cada reemplazo de medios, lave las células con DMEM completo.
    1. Aspirar el medio sobrenadante con una pipeta de 1 ml y dispensar suavemente sobre la capa de células varias veces. Asegúrese de que toda la superficie de la capa celular esté cubierta durante este paso de lavado.
  8. Una vez que las células alcancen el 80% de confluencia (generalmente después de 14 días), repita la tripsinización y la recolección de astrocitos como se describe en el paso 1.6.
  9. Semilla 5 × 103 de astrocitos en un cubreobjetos de vidrio circular de 7 mm recubierto con poli-L-lisina (50 μg/ml). Úsalos en experimentos después de 48 h.
  10. Para promover la microglía, después del paso 1.7, permita que las células gliales alcancen una capa confluente34. Cuando las células microgliales aparezcan en la parte superior de la capa de astrocitos (después de 10-15 días, reconocidas por sus cuerpos más pequeños y ovalados y procesos más cortos), agite la placa de Petri en un agitador orbital durante 2 h a 220 rpm.
  11. Dispersión y siembra de células microgliales
    1. Lave ligeramente las células desprendidas y sueltas aspirando el medio sobrenadante con una punta de pipeta de 1 ml y dispense suavemente sobre la capa de células varias veces. Asegúrese de cubrir toda la superficie de la capa celular durante este paso de lavado, recoja el medio con las células desprendidas y transfiéralo a un tubo de 15 ml.
    2. Centrifugar a 500 × g durante 5 min. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 mL de medio.
    3. Pase la suspensión celular a través de una aguja de 21 G para obtener una suspensión de una sola celda.
      NOTA: La mayoría de los métodos publicados utilizan tripsina o papaína para disociar el tejido; sin embargo, las agujas de 21 G tienen la ventaja de prevenir la sobredigestión de las células, lo que permite una disociación más suave.
    4. Contar las células con un hemocitómetro. Semilla 5 × 103 células microgliales en un cubreobjetos de vidrio circular de 7 mm recubierto con poli-L-lisina (50 μg/ml). Úsalos en experimentos después de 48 h.
      NOTA: Es difícil obtener un cultivo microglial puro por agitación, ya que las células precursoras de oligodendrocitos y los astrocitos todavía pueden estar presentes en un número variable dependiendo de la experiencia del experimentador. El protocolo inmunocitoquímico utilizado para estimar la presencia de diferentes poblaciones celulares en cultivos gliales ha sido descrito en otra parte35.

2. Inmunocitoquímica

  1. Enjuague las celdas chapadas en cubreobjetos en PBS, 2 x 1 min.
  2. Fijar las células en paraformaldehído al 4% durante 20 min a temperatura ambiente (RT).
  3. Lavar en PBS 3 x 5 min.
  4. Incubar en una solución bloqueante que contenga 10% de suero de burro normal (NDS)/1% de albúmina sérica bovina (BSA)/0,1% de Triton X-100 durante 45 min a RT.
    1. Añadir 50 μL de solución de bloqueo por cubreobjetos de 10 mm de diámetro.
  5. Preparar anticuerpos primarios en 1% NDS/1% BSA/0,1% TritonX-100 en las siguientes diluciones: ratón anti-GFAP 1:300, cabra anti-Iba1 1:500. Incubar las células con anticuerpos primarios durante la noche a +4 °C.
  6. Enjuagar en PBS, 3 x 10 min.
  7. Incubar con los anticuerpos secundarios conjugados con un fluoróforo: burro anti-ratón (excitación 488 nm [1:200)) o burro anti-cabra (excitado a 647 nm [1:200)). Incubar las células durante 2 h a RT en la oscuridad.
  8. Lavar en PBS, 7 x 5 min.
  9. Incubar las células con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 1:4.000) durante 10 min a RT.
  10. Lavar en PBS 5 x 5 min.
  11. Monte los cubreobjetos en portaobjetos de microscopio utilizando una solución de montaje; Use una gota por cubreobjetos.
    NOTA: Las diluciones de anticuerpos pueden variar dependiendo del productor. Los usuarios deben determinar diluciones óptimas para sus experimentos.

3. Imágenes de video de lapso de tiempo

NOTA: Las soluciones que contienen el tinte fluorescente deben protegerse de la luz directa. Antes de comenzar el experimento de imágenes, asegúrese de que el cubreobjetos de vidrio no se mueva al encender la perfusión.

  1. Preparación de soluciones y células
    1. Preparar la solución extracelular (ECS) para la obtención de imágenes: 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de CaCal 2, 2 mM de MgCl2, 10 mM de D-glucosa y 10 mM de HEPES. Ajuste el pH a 7.4. Asegúrese de que la osmolaridad sea de 280-300 mOsm/kg y prepare ECS sin Ca2+: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glucosa, 10 mM HEPES y 0.1 mM EGTA.
    2. Preparar las soluciones de prueba: 100 μM ATP disuelto en ECS, 1 μM Thg en ECS sin Ca2+ y 0,1 mg/mL ALS IgG en ECS8.
    3. Transfiera un cubreobjetos a un plato con ECS para lavar el DMEM completo. Preparar la solución de carga de colorante diluyendo 1 mM de solución madre de Fluo-4 AM con ECS hasta la concentración final de 5 μM de Fluo-4 AM.
      1. Coloque el cubreobjetos con células en la solución de carga de tinte durante 30 minutos a RT en la oscuridad. Lave las celdas en ECS durante 20 min.
    4. Si las células no están cargadas adecuadamente (es decir, si el nivel basal de fluorescencia es demasiado bajo, <5% del rango dinámico de la cámara con un tiempo de exposición superior a 400 ms), aumente el tiempo de carga hasta 45 min a 1 h a 37 °C. Alternativamente, mezcle la solución madre de Fluo-4 AM con un volumen igual de detergente al 20% (p/v) (Pluronic) en DMSO antes de diluir en ECS, haciendo que la concentración final de Pluronic sea ~0.02%.
      NOTA: Los ejemplos experimentales de este estudio se realizaron con IgG humana aislada de sueros sanguíneos de pacientes con ELA como se describió anteriormente 4,5,11. Cada experimento se realizó con muestras de IgG de un solo paciente.
  2. Imágenes de vídeo
    NOTA: En este protocolo, el sistema de imágenes de video se combinó con una lámpara de arco corto de xenón, un sistema policromador y un microscopio de epifluorescencia invertido equipado con agua, glicerina y objetivo de inmersión en aceite. Las imágenes de lapso de tiempo se realizaron utilizando un sistema de cámara digital.
    1. Encienda los componentes de la configuración de imágenes 15 minutos antes del experimento para permitir que el sistema alcance la temperatura de trabajo.
    2. Coloque el cubreobjetos en la cámara de grabación con 1 ml de solución de trabajo (ECS o ECS sin Ca2+).
    3. Para elegir el protocolo de imágenes correcto, abra el software de imágenes y, en el panel Adquisición, elija los pares de filtros para Fluo4-AM con una longitud de onda de excitación a 480 nm, un espejo dicroico a 505 nm y una longitud de onda de emisión a 535 nm.
    4. Elija el campo de visión teniendo cuidado de tener un número constante de células a lo largo del experimento. Ajuste el tiempo de exposición y la ganancia del detector adecuadamente, de tal manera que la señal no esté saturada. Elija el modo pseudocolor para la adquisición. Para obtener instrucciones más detalladas, consulte el manual proporcionado por el fabricante.
    5. Ajuste la frecuencia de muestreo a 1 Hz (1 fotograma por segundo).
    6. Comience la imagen adquiriendo el nivel basal de fluorescencia durante 3-5 minutos para la determinación de la línea de base (F0). Asegurar un flujo constante de la solución de trabajo.
    7. Detenga el flujo de la solución de trabajo y cambie a la solución de prueba durante el período de tiempo deseado (consulte también las barras de tiempo en los ejemplos de la Figura 2 y la Figura 3). Entre cada solución de prueba, lave las celdas con un flujo constante de la solución de trabajo durante 3-5 minutos.
    8. Mantenga el volumen de la solución en la cámara de grabación en ~1 ml organizando una succión constante desde la parte superior de la solución (ver Figura 2E).
      NOTA: Para aplicar el tratamiento directamente a las células fotografiadas, se colocó un sistema de administración personalizado hecho de una pipeta de vidrio (0,8 mm de diámetro interior) a ~350 μm de distancia y ~1 mm por encima de las células, en un ángulo de 45° combinado con el sistema de intercambio de solución que contiene válvulas de pellizco y un controlador electrónico de válvulas (ver Figura 2E).

4. Análisis de datos

  1. Defina una región de interés (ROI) que corresponda a la celda individual.
    1. Elija la trama con la intensidad de señal más alta (es decir, de la aplicación de ATP) y rodee una celda utilizando la herramienta poligonal de aplicación. Repita para todas las células en el campo adquirido. Elija cinco ROI en segundo plano con la herramienta Círculo.
    2. Para medir la intensidad media de la señal de una sola celda y el fondo para cada período de tiempo, seleccione todos los ROI y utilice el comando Multimedida en ROI Manager en ImageJ o cualquier comando equivalente en software comercial (consulte la Tabla de materiales).
  2. Exporte los valores medios de intensidad de señal de los ROI como una hoja de cálculo.
  3. Promedia cinco ROI de fondo y resta el fondo promediado de cada fotograma de la intensidad media del ROI del fotograma adquirido al mismo tiempo.
  4. Para normalizar los datos obtenidos a la señal de referencia, use la ecuación (1):
    ΔF/F 0 = (F - F 0)/F0 (1)
    donde F es la intensidad de la señal de cada marco de tiempo después de la resta de fondo, y F0 es la fluorescencia Fluo-4 de referencia.
    NOTA: En este estudio se utilizó un código personalizado.
  5. Para analizar la actividad del calcio, determine varios parámetros4: la amplitud del pico de calcio (ΔF / F 0), el cambio integrado (tiempo integral, superficie bajo el registro de respuesta) del transitorio de calcio (ΔF / F 0 × s), el tiempo transcurrido hasta el pico transcurrido desde el inicio de la estimulación hasta el máximo de calcio transitorio (s), aumento del tiempo transcurrido desde el inicio de la estimulación hasta el valor de ΔF / F 0 que alcanza el 50%-80% de la(s) amplitud(es) máxima(s), anchura-anchura completa de un transitorio a amplitud (s) media-máxima(s), frecuencia de respuestas si son repetitivas (Hz).

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Resultados

Caracterización de diferentes tipos de células gliales en cultivo
Por lo general, toma de 15 a 21 días producir astrocitos para experimentos, mientras que las células microgliales tardan de 10 a 15 días en crecer. Se realizó inmunotinción para evaluar la pureza celular del cultivo. La Figura 1 muestra la expresión del doble marcaje del marcador astrocítico GFAP y el marcador microglial Iba1 en cultivos respectivos.

Se sabe que las imágenes de c...

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Discusión

Este artículo presenta el método de cultivo de células primarias como una herramienta rápida y "dentro del presupuesto" para estudiar diferentes aspectos de la (fisio)fisiología celular, como la ELA en el modelo hSOD1G93A de rata. Por lo tanto, la técnica es adecuada para estudios a nivel unicelular que pueden extrapolarse e investigarse más a fondo a un nivel superior de organización (es decir, en rodajas de tejido o en un animal vivo). El cultivo celular como técnica, sin embargo, tiene algunas advertencias....

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Desarrollo Tecnológico República de Serbia Contrato No. 451-03-9/2021-14 / 200178, el proyecto FENS - NENS Education and Training Cluster "Trilateral Course on Glia in Neuroinflammation", y la subvención EC H2020 MSCA RISE # 778405. Agradecemos a Marija Adžić y Mina Perić por proporcionar las imágenes de inmunohistoquímica y a Danijela Bataveljić por su ayuda con la redacción en papel.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo de 15 mLSarstedt, Alemania62 554 502
Tubo de 2 mLSarstedt, Alemania72.691
Aguja de 21Nipro, JapónHN-2138-ET
Aguja de 23 GNipro, JapónHN-2338-ET
Nipro, JapónSY3-5SC-EC
Cubreobjetos de vidrio circular de 6 mmMenzel Glasser, Alemania630-2113
Placa de Petri de 60 mmThermoFisher Sientific, Estados Unidos130181
ATPSigma-Aldrich, AlemaniaA9062
AxioObserver A1Carl Zeiss, Alemania
Albúmina sérica bovinaSigma-Aldrich, AlemaniaB6917
Cloruro de calcioSigma-Aldrich, Alemania2110
CentrífugaEppendorf, Alemania
DAPISigma-Aldrich, Alemania10236276001
D-glucosaSigma-Aldrich, Alemania158968
DMEMSigma-Aldrich, AlemaniaD5648
Anti burro-cabra AlexaFluor 647 IgG anticuerpoInvitrogen, Estados UnidosA-21447
Burro-anti ratón AlexaFluor 488 Anticuerpo IgGInvitrogen, EE. UU.A-21202
EDTASigma-Aldrich, AlemaniaEDS-100G
EGTASigma-Aldrich, AlemaniaE4378
" Sistema de cámara digital evolve"-EM 512Photometrics, EE. UU.
Suero fetal bovino (FBS)Gibco, ThermoFisher Scientific, EE. UU.10500064
Fiji ImageJ SoftwareCódigo abierto bajo la Licencia
filtros FITCChroma Technology Inc., EE. UU.
Sondas moleculares Fluo-4 AM, EE. UUF14201
Cabra anti-Iba1Fujifilm Wako Chemicals, EE. UU.011-27991
HEPESBiowest, FranciaP5455
Sistema de intercambio de soluciones de alta velocidadALA Scientific Instruments, EE. UU
IncubadoraMemmert GmbH + Co. KG, Alemania
Cloruro de magnesioSigma-Aldrich, AlemaniaM2393
Software MatlabMath Works, EE.UU.
Ratón anti-GFAPMerck Millipore, EE.UU.MAB360
Mowiol 40-88Sigma-Aldrich, Alemania324590
Suero de burro normalSigma-Aldrich, AlemaniaD9663
ParaformaldehídoSigma-Aldrich, Alemania158127
Penicilina y EstreptomicinaThermoFisher Sientific, EE. UU.15140122
Poli-L-lisinaSigma-Aldrich, AlemaniaP5899
Cloruro de potasioSigma-Aldrich, AlemaniaP5405
Dihidrógeno fosfato de potasioReactivos Carlo Erba, EspañaAgitador de 471686
DELFIA PlateShakePerkinElmer Life Sciencies, Estados Unidos
Bicarbonato de sodioSigma-Aldrich, AlemaniaS3817
Cloruro de sodioSigma-Aldrich, AlemaniaS5886
Fosfato de sodio dibásico heptahidratadoCarl ROTH GmbHX987.2
Piruvato de sodioSigma-Aldrich, AlemaniaP5280
ThapsigargineTocris Bioscience, Reino Unido1138
Triton X - 100Sigma-Aldrich, AlemaniaT8787
TripsinaSigma-Aldrich, AlemaniaT4799
Vapro Osmómetro de Presión de Vapor 5520Wescor, ELITechGroup Inc., EE. UU.
Sistema de imágenes ViiFluorVisitron System Gmbh, Alemania
Sistema de policromador VisiChromeVisitron System Gmbh, Alemania
Configuración de alto rendimiento VisiViewVisitron System Gmbh, Alemania
Lámpara de arco corto de xenónUshio, Japón
G Jeringa de 5 mL Pública General GNU Juego de. .

Referencias

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  2. Taylor, J. P., Brown, R. H. J., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
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