Cultivos primarios de astrocitos de rata y microglia y su uso en el estudio de la esclerosis lateral amiotrófica

Katarina Milićević; Andrej Korenić; Milena Milošević; Pavle R. Andjus

doi:10.3791/63483

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Artículo de método

Cultivos primarios de astrocitos de rata y microglia y su uso en el estudio de la esclerosis lateral amiotrófica

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DOI:

10.3791/63483

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23 de junio de 2022

Katarina Milićević¹ , Andrej Korenić¹ , Milena Milošević¹ , Pavle R. Andjus¹

¹Center for Laser Microscopy, Institute for Physiology and Biochemistry “Jean Giaja”, University of Belgrade Faculty of Biology

En este artículo

Resumen

Presentamos aquí un protocolo sobre cómo preparar cultivos primarios de células gliales, astrocitos y microglía de cortezas de rata para imágenes de video de lapso de tiempo de Ca²⁺ intracelular para la investigación sobre fisiopatología de la esclerosis lateral amiotrófica en el modelo de rata hSOD1^G93A .

Resumen

Este protocolo demuestra cómo preparar cultivos primarios de células gliales, astrocitos y microglía de las cortezas de ratas Sprague Dawley y cómo usar estas células con el fin de estudiar la fisiopatología de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) en el modelo hSOD1^G93A de rata. Primero, el protocolo muestra cómo aislar y cultivar astrocitos y microglia de cortezas de ratas postnatales, y luego cómo caracterizar y probar la pureza de estos cultivos mediante inmunocitoquímica utilizando el marcador de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de los astrocitos y el marcador microglial ionizado de la molécula adaptadora de unión al calcio 1 (Iba1). En la siguiente etapa, se describen métodos para la carga de colorantes (Fluo 4-AM sensible al calcio) de células cultivadas y las grabaciones de cambios de Ca²⁺ en experimentos de imágenes de video en células vivas.

Los ejemplos de grabaciones de vídeo consisten en: (1) casos de imágenes de Ca²⁺ de astrocitos cultivados expuestos agudamente a inmunoglobulina G (IgG) aislados de pacientes con ELA, mostrando una respuesta característica y específica en comparación con la respuesta al ATP como se demostró en el mismo experimento. Los ejemplos también muestran un aumento transitorio más pronunciado en la concentración de calcio intracelular evocado por ALS IgG en astrocitos hSOD1^G93A en comparación con los controles no transgénicos; (2) imágenes de Ca 2+ de astrocitos cultivados durante una depleción de las reservas de calcio por thapsigargin (Thg), un inhibidor no competitivo de la ATPasa del retículo endoplásmico Ca 2+, seguida de una entrada de calcio operada por el almacén provocada por la adición de calcio en la solución de registro, lo que demuestra la diferencia entre la operación de almacenamiento de Ca²⁺ en hSOD1^G93A y en astrocitos no transgénicos; (3) Las imágenes de Ca 2+ de la microglía cultivada muestran predominantemente una falta de respuesta a la IgG de ELA, mientras que la aplicación de ATP provocó un cambio de Ca²⁺. Este documento también enfatiza posibles advertencias y precauciones con respecto a la densidad celular crítica y la pureza de los cultivos, eligiendo la concentración correcta del colorante Ca²⁺ y las técnicas de carga de colorante.

Introducción

Las técnicas de cultivo celular han dado lugar a numerosos avances en diversos campos de la neurofisiología celular en la salud y la enfermedad. En particular, los cultivos celulares primarios, recién aislados del tejido neuronal de un animal de laboratorio, permiten al experimentador estudiar de cerca el comportamiento de diversas células en diferentes medios bioquímicos y configuraciones fisiológicas. El uso de diferentes indicadores fisiológicos fluorescentes, como los colorantes sensibles al Ca²⁺ en combinación con la microscopía de video de lapso de tiempo, proporciona una mejor comprensión de los procesos biofísicos y bioquímicos celulares en tiempo r....