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Artículo de método

Imágenes de dispersión Raman estimuladas en dos colores en tiempo real del cerebro del ratón para el diagnóstico de tejidos

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DOI:

10.3791/63484

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1 de febrero de 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Washington

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) es una técnica de imagen potente, no destructiva y sin etiquetas. Una aplicación emergente es la histología Raman estimulada, donde las imágenes SRS de dos colores en las transiciones Raman de proteínas y lípidos se utilizan para generar imágenes de pseudo-hematoxilina y eosina. Aquí, demostramos un protocolo para imágenes SRS de dos colores en tiempo real para el diagnóstico de tejidos.

Resumen

La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) se ha convertido en una poderosa técnica de imagen óptica para el diagnóstico de tejidos. En los últimos años, se ha demostrado que el SRS de dos colores puede proporcionar imágenes equivalentes a hematoxilina y eosina (H&E) que permiten un diagnóstico rápido y confiable del cáncer cerebral. Tal capacidad ha permitido emocionantes aplicaciones de diagnóstico de cáncer intraoperatorio. Las imágenes SRS de dos colores del tejido se pueden realizar con una fuente láser de picosegundos o femtosegundos. Los láseres de femtosegundo tienen la ventaja de permitir modos de imagen flexibles, incluidas imágenes hiperespectrales rápidas e imágenes SRS de dos colores en tiempo real. Un enfoque de enfoque espectral con pulsos láser chirriados se usa típicamente con láseres de femtosegundo para lograr una alta resolución espectral.

La adquisición de SRS de dos colores se puede realizar con modulación ortogonal y detección de bloqueo. La complejidad del canto de pulso, la modulación y la caracterización es un cuello de botella para la adopción generalizada de este método. Este artículo proporciona un protocolo detallado para demostrar la implementación y optimización de SRS de enfoque espectral e imágenes en tiempo real de dos colores del tejido cerebral de ratón en el modo epi. Este protocolo se puede utilizar para una amplia gama de aplicaciones de imágenes SRS que aprovechan la alta velocidad y la capacidad de imágenes espectroscópicas de SRS.

Introducción

El diagnóstico tisular tradicional se basa en protocolos de tinción seguidos de un examen bajo un microscopio óptico. Un método de tinción común utilizado por los patólogos es la tinción H&E: la hematoxilina tiñe los núcleos celulares de un azul violáceo, y la eosina tiñe la matriz extracelular y el citoplasma de rosa. Esta simple tinción sigue siendo el estándar de oro en patología para muchas tareas de diagnóstico de tejidos, particularmente el diagnóstico de cáncer. Sin embargo, la histopatología de H&E, particularmente la técnica de seccionamiento congelado utilizada en un entorno intraoperatorio, todavía tiene limitaciones. El procedimiento de tinción es un proceso laborioso que implica incrustación, seccionamiento, fijación y tinciónde tejidos 1. El tiempo de respuesta típico es de 20 minutos o más. Realizar H&E durante la sección congelada a veces puede ser más difícil cuando se procesan varias secciones a la vez debido a la necesidad de evaluar las características celulares o los patrones de crecimiento en 3D para la evaluación de márgenes. Además, las técnicas histológicas intraoperatorias requieren técnicos y clínicos calificados. La limitación en el número de patólogos certificados por la junta en muchos hospitales es una limitación para la consulta intraoperatoria en muchos casos. Tales limitaciones pueden aliviarse con los intereses de rápido desarrollo en patología digital y diagnóstico basado en inteligencia artificial2. Sin embargo, los resultados de tinción de H&E son variables, dependiendo de la experiencia del técnico, lo que presenta desafíos adicionales para el diagnóstico por computadora2.

Estos desafíos pueden abordarse potencialmente con técnicas de imágenes ópticas sin etiquetas. Una de esas técnicas es la microscopía SRS. SRS utiliza láseres pulsados sincronizados (bomba y Stokes) para excitar vibraciones moleculares con alta eficiencia3. Informes recientes han demostrado que las imágenes SRS de proteínas y lípidos pueden generar imágenes equivalentes a H&E (también conocidas como histología Raman estimulada o SRH) con tejido fresco intacto, lo que evita la necesidad de cualquier procesamiento tisular, acorta significativamente el tiempo necesario para el diagnóstico y se ha adaptado intraoperatoriamente4. Además, las imágenes SRS pueden proporcionar imágenes 3D, lo que ofrece información adicional para el diagnóstico cuando las imágenes 2D son insuficientes5. La SSR es imparcial y genera imágenes digitales que están fácilmente disponibles para el diagnóstico basado en computadora. Surge rápidamente como una posible solución para el diagnóstico intraoperatorio del cáncer y el análisis del margen tumoral, especialmente en el cáncer cerebral 6,7,8. Más recientemente, también se ha sugerido que las imágenes SRS de los cambios químicos del tejido proporcionan información diagnóstica útil que puede ayudar aún más a los médicos a estratificar diferentes tipos de cáncer o etapas9.

A pesar de su tremendo potencial en aplicaciones de diagnóstico de tejidos, las imágenes SRS se limitan principalmente a laboratorios académicos especializados en óptica debido a la complejidad asociada con la plataforma de imágenes, que incluye láseres ultrarrápidos, el microscopio de escaneo láser y la sofisticada electrónica de detección. Este protocolo proporciona un flujo de trabajo detallado para demostrar el uso de una fuente láser de femtosegundo común para imágenes SRS de dos colores en tiempo real y la generación de imágenes pseudo-H&E a partir de tejido cerebral de ratón. El protocolo abarcará los siguientes procedimientos:

Optimización de alineación y chirrido
La mayoría de los esquemas de imágenes SRS utilizan láseres de picosegundos o femtosegundos como fuente de excitación. Con los láseres de femtosegundo, el ancho de banda del láser es mucho mayor que el ancho de línea Raman. Para superar esta limitación, se utiliza un enfoque de enfoque espectral para chirriar los láseres de femtosegundo a una escala de tiempo de picosegundos para lograr una resolución espectral estrecha10. La resolución espectral óptima solo se logra cuando el chirrido temporal (también conocido como dispersión de retardo de grupo o simplemente dispersión) se combina adecuadamente para la bomba y los láseres Stokes. El procedimiento de alineación y los pasos necesarios para optimizar la dispersión de los rayos láser utilizando varillas de vidrio altamente dispersivas se muestran aquí.

Calibración de frecuencia
Una ventaja del SRS de enfoque espectral es que la excitación Raman se puede ajustar rápidamente cambiando el retardo de tiempo entre la bomba y los láseres Stokes. Dicha sintonización ofrece imágenes rápidas y una adquisición espectral confiable en comparación con la sintonización de longitudes de onda láser. Sin embargo, la relación lineal entre la frecuencia de excitación y el retardo de tiempo requiere calibración externa. Los disolventes orgánicos con picos Raman conocidos se utilizan para calibrar la frecuencia Raman para el ENFOQUE espectral SRS.

Imágenes en tiempo real a dos colores
Es importante aumentar la velocidad de las imágenes en las aplicaciones de diagnóstico de tejidos para acortar el tiempo necesario para analizar muestras de tejido grande. Las imágenes simultáneas de SRS de dos colores de lípidos y proteínas evitan la necesidad de ajustar el láser o el retraso de tiempo, lo que aumenta la velocidad de imagen en más del doble. Esto se logra mediante el uso de una novedosa técnica de modulación ortogonal y demodulación de doble canal con un amplificador de bloqueo11. Este artículo describe el protocolo para la modulación ortogonal y la adquisición de imágenes de doble canal.

Imágenes SRS en modo Epi
La mayoría de las imágenes SRS mostradas hasta la fecha se realizan en modo de transmisión. Las imágenes en modo epi detectan fotones retrodispersados del tejido12. Para aplicaciones de patología, las muestras quirúrgicas pueden ser bastante grandes. Para las imágenes en modo de transmisión, a menudo es necesario seccionar el tejido, lo que indeseablemente requiere tiempo adicional. Por el contrario, las imágenes en modo epi pueden funcionar con muestras quirúrgicas intactas. Debido a que el mismo objetivo se utiliza para recoger la luz retrodispersada, tampoco hay necesidad de alinear un condensador de alta apertura numérica requerido para la transmisión de imágenes. El modo Epi también es la única opción cuando la sección de tejido es difícil, como con el hueso. Anteriormente hemos demostrado que para el tejido cerebral, las imágenes en modo epi ofrecen una calidad de imagen superior para el grosor del tejido > 2 mm13. Este protocolo utiliza un divisor de haz polarizador (PBS) para recolectar fotones dispersos despolarizados por el tejido. Es posible recolectar más fotones con un detector anular a expensas de la complejidad del conjunto de detectorespersonalizados 12. El enfoque PBS es más simple de implementar (similar a la fluorescencia), con el fotodiodo estándar que ya se utiliza para la detección del modo de transmisión.

Generación de imágenes Pseudo-H&E
Una vez que se recopilan las imágenes SRS de dos colores, se pueden volver a colorear para simular la tinción de H&E. Este artículo demuestra el procedimiento para convertir imágenes SRS de lípidos y proteínas en imágenes SRS pseudo-H&E para aplicaciones de patología. El protocolo experimental detalla los pasos críticos necesarios para generar imágenes SRS de alta calidad. El procedimiento que se muestra aquí no solo es aplicable al diagnóstico de tejidos, sino que también se puede adaptar para muchas otras aplicaciones de imágenes srS hiperespectrales, como imágenes de medicamentos e imágenes metabólicas14,15.

Requisitos generales del sistema
El sistema láser para este protocolo debe ser capaz de emitir 2 rayos láser de femtosegundo sincronizados. Los sistemas cuentan idealmente con un oscilador óptico paramétrico (OPO) para el ajuste de longitud de onda amplia de uno de los rayos láser. La configuración de este protocolo utiliza un sistema láser comercial Insight DS+ que emite dos láseres (un haz fijo a 1.040 nm y un haz sintonizable basado en OPO, que van desde 680 a 1.300 nm) con una tasa de repetición de 80 MHz. Los microscopios de barrido láser, ya sea de los principales fabricantes de microscopios o de fabricación casera, se pueden utilizar para imágenes SRS. El microscopio utilizado es un microscopio de barrido láser vertical construido sobre un marco de microscopio vertical comercial. Se utilizan un par de espejos galvo de 5 mm para escanear el rayo láser. Para los usuarios que elijan adoptar un microscopio de escaneo láser casero, consulte un protocolo publicado previamente para la construcción de un microscopio de escaneo láser16.

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Protocolo

Todos los procedimientos experimentales con animales se llevaron a cabo con cerebros de ratón de 200 μm, fijos y seccionados, de acuerdo con el protocolo (# 4395-01) aprobado por el Comité del Instituto de Cuidado y Uso animal (IACUC) de la Universidad de Washington. Los ratones de tipo salvaje (cepa C57BL/6J) son sacrificados con CO2. Luego, se realiza una craneotomía para extraer sus cerebros para la fijación en paraformaldehído al 4% en solución salina tamponada con fosfato. Los cerebros están incrustados en una mezcla de agarosa al 3% y gelatina al 0,3% y se seccionan en rodajas de 200 μm de espesor mediante un vibratomo.

1. Alineación inicial

NOTA: Asegúrese de que el tamaño del haz y la divergencia de ambos brazos coincidan para obtener la mejor sensibilidad y resolución. Colime la bomba y los haces de Stokes y ajuste sus tamaños antes de que entren en el microscopio de barrido láser. Para hacer esto, use un par de lentes acromáticas para cada haz antes de combinarlas en el espejo dicroico. Siempre use gafas láser adecuadas para la alineación del haz.

  1. Colimación de haz
    1. Instale un par de lentes acromáticas para el haz de la bomba. Como punto de partida, use una lente de 100 mm y una lente de 200 mm para aumentar el tamaño del rayo láser en 2 veces. Asegúrese de que la distancia de las dos lentes sea de aproximadamente 300 mm. Alinee el haz de la bomba a través del centro de ambas lentes.
    2. Coloque un espejo después de la segunda lente para enviar el haz hacia una pared (a > 1 m de distancia). Tenga cuidado al enviar el haz a través de largas distancias. Traza el haz desde el espejo hasta la pared con una tarjeta IR y comprueba si el haz cambia de tamaño. Colimar el haz si el haz cambia de tamaño en función de la distancia.
      1. Si el haz está convergiendo (disminuyendo el tamaño con la propagación), acerque las dos lentes.
      2. Si el haz está divergiendo (aumentando el tamaño con la propagación), mueva las dos lentes más separadas. Ajuste la distancia hasta que el haz esté colimado.
    3. Repita los pasos 1.1.1 y 1.1.2 para que el haz de Stokes colime el haz.
  2. Ajuste del tamaño del haz
    1. Si hay un perfilador de haz disponible, mida el tamaño del haz colimado para cada haz. Alternativamente, calcule el tamaño del haz utilizando la tarjeta IR y una regla para obtener un diámetro de haz de 4-5 mm.
    2. Si el tamaño del haz es demasiado pequeño o demasiado grande, cambie el par de lentes utilizado en el paso 1.1. Ajuste el par de lentes hasta que ambos haces tengan un diámetro de 4-5 mm.
      NOTA: La ampliación del haz es la relación entre la distancia focal de la segunda lente y la primera lente (f2/f1).
  3. Superposición espacial
    NOTA: Las imágenes SRS requieren que ambos rayos láser se combinen en el espacio y el tiempo para excitar las vibraciones moleculares. En la Figura 1 se muestra un esquema de la imagen SRS de enfoque espectral.
    1. Combine los dos rayos láser instalando un espejo dicroico con varios espejos de dirección para su ajuste. Optimice la superposición espacial de la bomba y Stokes monitoreando los haces después del espejo dicroico en dos posiciones diferentes muy separadas (~ 1 m). Ajuste iterativamente el espejo de dirección antes del espejo dicroico y el espejo dicroico para alinear el haz stokes con el haz de la bomba.
      NOTA: Si las dos vigas se superponen espacialmente en ambas posiciones, están suficientemente superpuestas.
    2. Asegúrese de que los haces combinados se envíen al centro de los espejos de escaneo del microscopio de escaneo láser ajustando un par de espejos de dirección cuando los espejos de escaneo estén en la posición estacionada. Asegúrese de que ambos haces viajen a través del centro del objetivo del microscopio y el condensador.
    3. Después del condensador, utilice otro par de objetivos con distancias focales de 100 mm y 30 mm, respectivamente, para retransmitir el haz transmitido al fotodiodo. Asegúrese de que ambos haces estén contenidos dentro del fotodiodo e instale dos filtros de paso bajo para bloquear el haz Stokes modulado.

2. Detección de señal SRS

  1. Modulación electroóptica (MOE)
    NOTA: La MOE de 20 MHz se utiliza para modular la amplitud de Stokes. Como se discutió más adelante, la MOE se deriva del tren de pulso láser de 80 MHz, que se requiere para la modulación ortogonal. Se pueden usar otras frecuencias de modulación si solo se realiza SRS de un solo color o hiperespectral. En ese caso, la sincronización de la frecuencia de modulación con la frecuencia láser es innecesaria. Se puede utilizar un generador de frecuencia con un amplificador de potencia de RF para impulsar la MOE. Como resultado, se pueden omitir los pasos 2.1.1-2.1.4.
    1. Coloque un muestreador de haz en la trayectoria del haz stokes para recoger el 10% del haz y enviarlo a un fotodiodo rápido para detectar el tren de pulsos de 80 MHz.
      NOTA: La señal de fotodiodo se envía a un divisor de frecuencia para generar una salida TTL de 20 MHz. Esta salida se envía además a un búfer de fanout para replicar la salida en cuatro salidas idénticas de 20 MHz. Una de las salidas se utiliza para activar el osciloscopio.
    2. Tome una de las salidas del búfer de fanout y filtre con un filtro de paso de banda para obtener una onda sinusoidal de 20 MHz. Utilice un atenuador de RF para ajustar el voltaje de pico a pico de salida a ~ 500 mV.
    3. Envíe la salida resultante a una palanca de cambios de fase, que permite un ajuste fino de la fase de RF con una fuente de voltaje. Envíe esta salida a un amplificador de potencia de RF y conecte la salida del amplificador a la MOE.
    4. Desbloquee el haz de Stokes y optimice la profundidad de modulación de EOM1 colocando un fotodiodo en la trayectoria del haz. Ajuste el voltaje de la MOE y la placa de cuarto de onda hasta que la profundidad de modulación (relación valle-pico) parezca satisfactoria.
      NOTA: A una modulación de 20 MHz (1/4 de la tasa de repetición láser), se esperan dos pulsos cada 50 ns.
  2. Superposición temporal
    NOTA: La superposición temporal de la bomba y Stokes se logra retrasando uno de los dos trenes de pulsos láser con un retrorreflector montado en una etapa de retardo (la Figura 1 muestra el Stokes retrasado). La superposición gruesa se monitorea con el osciloscopio, y la superposición fina es monitoreada por la señal SRS. La superposición temporal fina también se puede lograr con un autocorrelador si está disponible.
    1. Coloque un fotodiodo después del espejo dicroico para detectar el rayo láser. Bloquea primero la viga stokes. Amplíe uno de los picos de pulso de la bomba en el osciloscopio. Coloque un cursor vertical para marcar la posición temporal de este pico con el osciloscopio.
    2. Bloquee el haz de la bomba y desbloquee el haz de Stokes. Traduzca la etapa de retardo para que coincida temporalmente con la posición máxima en el osciloscopio con la posición marcada en el paso anterior. Consulte la Figura 2 para ver una visualización de la superposición temporal de dos haces.
      1. (OPCIONAL) Si la traslación de la etapa de retardo es insuficiente para que coincida temporalmente con las dos vigas, mueva la etapa de retardo a la mitad de su rango de movimiento.
      2. Calcule la distancia de retardo requerida para que coincida con los dos haces tomando la diferencia temporal entre los dos haces y multiplicando la diferencia por la velocidad de la luz para encontrar la cantidad de distancia necesaria para que coincida con los dos haces temporalmente.
      3. Alargar la trayectoria del haz del haz más rápido o acortar la trayectoria del haz del haz más lento para que coincida aproximadamente con el retraso temporal en consecuencia.
    3. Prepare una muestra de diapositiva de microscopio con DMSO y cinta adhesiva de doble cara como espaciador para mantener la muestra entre la diapositiva y una cubierta.
    4. Coloque la muestra en el microscopio con el lado de la cubierta hacia el objetivo del microscopio. Cambie el microscopio a iluminación de campo brillante y observe la muestra desde el ocular. Encuentre el foco de la muestra encontrando primero el foco en la capa superior e inferior de burbujas de aire en la interfaz vidrio-cinta, y luego mueva el foco para que esté entre las dos capas de cinta.
      NOTA: Asegúrese de que los rayos láser estén bloqueados antes de mirar el ocular.
    5. Ajuste la salida del haz sintonizable a 798 nm. En función del rendimiento óptico del condensador, ajuste la potencia óptica para que sea de ~ 40 mW cada uno para la bomba y los haces stokes en el foco objetivo.
    6. Abra ScanImage en MATLAB (u otro software de escaneo que controle el microscopio) y haga clic en el botón FOCUS para comenzar a escanear.
      NOTA: Los rayos láser se escanearán ráster a través de la muestra para generar una imagen. La salida de señal de baja frecuencia del fotodiodo (<100 kHz) se envía directamente al canal 1 de la tarjeta de adquisición de datos (denominado canal de CC). La salida de alta frecuencia (>100 kHz) del fotodiodo se envía al amplificador de bloqueo, y la salida X de la señal del amplificador de bloqueo se envía al canal 2 de la tarjeta de adquisición de datos (denominado canal de CA).
    7. Ajuste el espejo de dirección antes del escáner galvo para centrar la señal de CC en la pantalla del canal 1. Mueva la etapa de retardo motorizado y observe de cerca la salida de bloqueo que se muestra en la pantalla del canal 2 (es decir, el canal de CA).
      NOTA: Cuando la bomba y Stokes coinciden en el tiempo, aparecerá una señal en el canal de CA. Es útil ajustar la escala de color del canal de CA para mostrar el pequeño cambio de intensidad.
    8. Maximice la intensidad de la señal de CA ajustando finamente el retardo de tiempo. Ajuste el espejo dicroico para centrar la señal SRS en el canal de CA (mientras mantiene el canal de CC centrado). Ajuste la fase del amplificador de bloqueo para maximizar la señal. Consulte la Figura 3 para obtener una señal satisfactoria.

3. Optimización de la resolución espectral

NOTA: La bomba y los haces stokes que llegan a la muestra deben tener la misma cantidad de dispersión de retardo de grupo (GDD) para maximizar la resolución espectral. La dispersión depende en gran medida de la configuración experimental. La configuración experimental descrita aquí utiliza pulsos de femtosegundos a 1.040 nm y 800 nm como Stokes y bomba, respectivamente. Las varillas de vidrio de sílex denso (H-ZF52A) se utilizan como medio de estiramiento por pulso.

  1. Inserte 48 cm de una varilla de vidrio altamente dispersiva (H-ZF52A o vidrio de sílex denso equivalente) en la trayectoria del haz de 800 nm. Estimar el GDD usando Eq (1):
    figure-protocol-1 (1)
    NOTA: GVD de varios materiales de vidrio en diferentes longitudes de onda se puede encontrar en el recurso de base de datos de índice de refracción. Por ejemplo, H-ZF52A tiene un GVD de 220.40 fs2/mm a 800 nm. El GDD total es 105792 fs2.
  2. Calcule cuántos cm de la varilla de vidrio dispersiva se requieren para agregar a la trayectoria del haz de 1.040 nm para que coincida con el GDD de la bomba. Inserte la longitud adecuada de varillas de vidrio dispersivas en la trayectoria del haz de 1.040 nm para que coincida aproximadamente con el GDD del haz de 800 nm. Tenga en cuenta que la adición de varillas de vidrio cambiará la superposición temporal de las dos vigas, y puede ser necesario ajustar el retardo.
  3. Calibración de la resolución espectral
    1. Haga una muestra de diapositiva de microscopio con DMSO. Coloque el portaobjetos en el microscopio y compruebe la potencia de los haces que salen del condensador del microscopio. Ajuste la potencia en consecuencia para tener ~ 40 mW cada uno en el enfoque de la muestra.
    2. Abra ScanImage desde MATLAB. Encuentre la señal SRS máxima escaneando a través de la etapa de retardo, que corresponde al pico Raman de 2.913 cm-1 de DMSO. Estime la posición de la etapa en función de la posición de la etapa anterior con el aumento de la longitud de la trayectoria óptica debido a la inserción de varillas. Realinear la superposición espacial del haz debido a la pequeña desviación del haz cuando se agregan varillas de vidrio.
    3. Guarde un escaneo SRS hiperespectral tomando secuencialmente una serie de imágenes SRS mientras mueve la etapa motorizada.
      NOTA: El rango de escaneo de retardo cubre dos picos Raman, correspondientes a los picos Raman de 2.913 cm-1 y 2.994 cm-1 de DMSO, respectivamente. Estas dos transiciones se observan cuando se utiliza una bomba de 800 nm y un láser Stokes de 1.040 nm.
    4. Trazar los espectros SRS de la solución DMSO utilizando ImageJ o MATLAB. Ajuste el pico grande dmSO de 2.913 cm-1 a una función gaussiana o lorentziana en MATLAB para calcular el ancho completo a la mitad del máximo (FWHM) del pico.
      NOTA: Los resultados representativos se muestran en la Figura 4. Si solo hay un pico ancho presente, eso significa que la resolución espectral es demasiado pobre para distinguir los dos picos y se requieren más varillas de vidrio, o que el rango escaneado era demasiado pequeño para detectar el segundo pico. Por lo general, un DMSO de resolución espectral aceptable es de ~ 20-25 cm-1 cuando se utilizan varillas de vidrio de >60 cm. A menudo se utiliza una resolución más baja para que las imágenes de tejidos cambien por señales más altas con pulsos más cortos17.
  4. (OPCIONAL) Utilice un autocorrelador o un FROG (Frequency-Resolved Optical Gating) para determinar la duración del pulso de cada brazo para calcular exactamente la cantidad de GDD y la longitud de las varillas necesarias para que coincida con el GDD entre la bomba y el Stokes.
  5. Repita los pasos 3.3.2-3.3.4 para diferentes longitudes de varillas en el haz de Stokes para encontrar la resolución espectral óptima, lo que significa que se ha encontrado experimentalmente la mejor coincidencia de GDD. Utilice múltiples juegos de varillas de vidrio que difieren en longitud para lograr una resolución espectral óptima.

4. Caracterización de señal a ruido (SNR)

  1. Asegúrese de que el paso 4.2 se realiza después de una alineación espacial y temporal completa.
  2. Adquiera una imagen SRS correspondiente al pico Raman de 2.913 cm-1 de DMSO. Abra la imagen en ImageJ y seleccione un área pequeña en el centro del marco. Utilice la función de medida para calcular la media y la desviación estándar de los valores en el área seleccionada.
  3. Divida el valor medio del área seleccionada por la desviación estándar para encontrar el valor SNR, como en Eq (2).
    figure-protocol-2 (2)
    NOTA: Un buen SNR para el sistema (con una constante de tiempo de bloqueo de 4 μs) utilizando DMSO a 40 mw / 40 mw en el foco para ambos brazos es >800. Se pueden utilizar concentraciones más bajas de DMSO o menor potencia para una estimación más precisa del SNR si la tarjeta de adquisición de datos tiene una profundidad de bits limitada.
  4. Si el SNR es demasiado bajo, realinee los pulsos láser para optimizar la superposición espacial, la superposición temporal, la coincidencia de tamaño de haz / colimación y / o la coincidencia de dispersión. Para un objetivo con un collar de corrección de aberración, optimice la señal ajustando el collar de corrección.

5. Calibración del eje de frecuencia

NOTA: Este paso se realiza para relacionar la posición de la etapa de retardo con la transición Raman escaneada. Se requiere una cuidadosa selección de solventes para generar una "Regla Raman" apropiada. DMSO es un disolvente eficaz para los enlaces CH, ya que tiene dos picos Raman agudos a 2.913 cm-1 y 2.994 cm-1.

  1. Guarde una exploración hiperespectral con el rango de etapas de retardo que cubre los picos Raman de 2.913 cm-1 y 2.994 cm-1 de DMSO. Guarde las posiciones de escenario correspondientes al conjunto de datos hiperespectrales.
    NOTA: El pico máximo global del espectro corresponde al desplazamiento Raman DMSO 2,913 cm-1 y el segundo pico máximo corresponde al desplazamiento Raman DMSO 2,994 cm-1 .
  2. Realizar regresión lineal para las posiciones de etapa y turnos Raman a 2.913 cm-1 y 2.994 cm-1. Usando la ecuación de regresión lineal que relaciona la posición de la etapa con el desplazamiento Raman, convierta las posiciones de retardo a las frecuencias Raman correspondientes.

6. Modulación ortogonal e imágenes de dos colores

NOTA: El paso de modulación ortogonal solo es necesario cuando se necesitan imágenes de dos colores en tiempo real. Un esquema de este esquema se muestra en la Figura 5. La modulación ortogonal utiliza un par de EOM accionados a una cuarta parte de la frecuencia del láser (20 MHz para el láser de 80 MHz) con un cambio de fase de 90 ° entre los dos. Este paso de modulación ortogonal se puede omitir para imágenes SRS de un solo color o imágenes SRS hiperespectrales.

  1. Modulación EOM1
    1. Instale un PBS (PBS2), una placa de cuarto de onda (QWP2) y una segunda MOE (EOM2) en la trayectoria del haz de Stokes después de la primera MOE. Desenchufe la entrada de señal a EOM2. Conecte la entrada de señal a EOM1 y enciéndala.
    2. Modular el haz de Stokes (fijado a 1.040 nm) a 20 MHz (f0/4) enviando el haz a través de la primera MOE. Ajuste la inclinación y la posición de EOM1 para asegurarse de que el haz está golpeando recto y centrado a través del cristal de EOM.
    3. Monitoree la profundidad de modulación observando ambas polarizaciones que salen de PBS1 con dos fotodiodos y mostrando la modulación en un osciloscopio.
    4. Ajuste el QWP1, el voltaje EOM1 y la fase de la entrada de 20 MHz (utilizando un cambiador de fase) para optimizar la profundidad de modulación del haz transmitido para que sea cercana al 100%. Consulte la Figura 2B para obtener una ilustración de una buena profundidad de modulación.
  2. Modulación EOM2
    1. Desenchufe EOM1 y conecte EOM2.
    2. Envíe la salida de alto voltaje del segundo amplificador a 20 MHz a EOM2. Ajuste la inclinación y la posición de EOM2 para asegurarse de que el haz está golpeando recto y centrado a través del cristal de EOM.
    3. Una vez más, monitoree la profundidad de modulación observando ambas polarizaciones que salen de PBS2 con un osciloscopio. Ajuste el QWP2, el voltaje EOM2 y el cambio de fase según sea necesario para lograr una modulación cercana al 100% para ambas polarizaciones.
    4. Asegúrese de que la modulación del tren de impulsos tenga un cambio de fase de 90° desde la primera modulación.
      NOTA: Si los dos trenes de pulsos de la bomba no son ortogonales de 90°, la diafonía entre los dos canales será un problema.
    5. Pruebe la ortogonalidad de la modulación encendiendo y conectando tanto EOM1 como EOM2. Monitoree ambas polarizaciones divididas por PBS2 con un osciloscopio. Reoptimice EOM1 y EOM2 individualmente si el tren de pulsos después del segundo PBS no se parece a la Figura 2C.
    6. Instale un cristal de cuarzo birrefringente (BRC) de 20 mm y HWP aguas abajo de EOM2. Conecte ambos EOM a la vez y supervise el tren de pulsos de tal manera que se parezca a la Figura 2D.
      NOTA: Para el chirrido utilizado en este experimento, el BRC de 20 mm induce un retardo de tiempo que corresponde a un desplazamiento Raman de 80 cm-1 . Es posible que se necesite una longitud de BRC diferente si se usa un chirrido diferente.
  3. Calibración
    1. Calibre el sistema utilizando DMSO detectando señales del amplificador de bloqueo X y la salida de canal E Y (enviadas a los canales 2 y 3 de la tarjeta de adquisición de datos).
    2. Compruebe si las señales generadas por el pico de 2.913 cm-1 de la polarización más rápida y las de la polarización más lenta están cerca de 90 ° fuera de fase en el amplificador de bloqueo. Si este no es el caso, ajuste la alineación de la MOE hasta que las dos señales estén cerca de 90 ° fuera de fase.
    3. Una vez completada la calibración, encuentre la posición de retardo que sondea la transición de la proteína a 2.930 cm-1 para uno de los haces ortogonales. Asegúrese de que la otra polarización sondea la transición lipídica de 2.850 cm-1.

7. Imágenes SRS en modo epi

NOTA: En el esquema de imágenes en modo de transmisión, el objetivo enfoca el láser en la muestra y, a continuación, una lente de condensador dirige el haz transmitido a un fotodiodo para la detección de bloqueo. En el esquema de imágenes epi-mode, la luz que es retrodispersada y despolarizada por la muestra es recogida por el objetivo de enfoque y aislada usando un divisor de haz polarizador. Los fotones aislados y retrodispersados se envían a un fotodiodo a través de un par de lentes de relé para la detección de bloqueo. La Figura 6 muestra el esquema de imágenes en modo epi.

  1. Instale un HWP antes de que el haz entre en el microscopio para cambiar la polarización del haz que entra en el microscopio. Coloque un PBS sobre el objetivo para permitir que el haz retroexflexionado despolarizado llegue al detector.
  2. Utilice un par de lentes que consisten en una lente acromática de 75 mm y una lente asférica de 30 mm para transmitir los fotones retrodispersados desde la apertura posterior del objetivo al fotodetector. Monte el detector para recoger la luz retrodispersada dirigida por el PBS. Instale un filtro para impedir que el haz modulado entre en el detector.
  3. Coloque la muestra de tejido debajo del objetivo. Como el condensador es innecesario para las imágenes en modo epi, retírelo si se requiere más espacio.
  4. Imagenológico
    1. Bloquee la viga con un obturador; hacer brillar una fuente de luz blanca sobre la muestra desde un lado; y usa brightfield para encontrar un enfoque objetivo.
    2. Desbloquee ambos haces y utilice las posiciones de retardo precalibradas para adquirir imágenes SRS de lípidos y proteínas del tejido de las dos salidas del amplificador de bloqueo.
    3. Ajuste la ganancia de bloqueo y el factor de contenedor de píxeles para adquirir imágenes de buena calidad.

8. Tinción de color falso

  1. Abra la pila de imágenes con ImageJ.
  2. Extraiga las dos imágenes que corresponden a las especies de lípidos (2.850 cm-1) y proteínas (2.930 cm-1) haciendo clic con el botón derecho en la imagen y haciendo clic en Duplicar.
  3. Cambie el nombre de la imagen lipídica a lípidos y la imagen proteica a proteínas.
  4. Ir a procesar | Calculadora de imágenes y realizar proteínas restan lípidos.
  5. Combina las imágenes yendo a imagen | | de color Fusionar canales, estableciendo los lípidos en verde y las proteínas en azul. Abra la herramienta de canales de imagen (imagen | | de color Herramienta canales) y ajustar el brillo y el contraste (Imagen | Ajustar | Brillo/Contraste).
  6. Ajuste el brillo y el contraste de cada canal con la herramienta canales . Para el canal lipídico, ajuste el contraste hasta que las características celulares aparezcan oscuras. Para el canal de proteína, ajuste el contraste hasta que las características celulares aparezcan azules. Convierta la imagen verde/azul del canal combinado en una imagen RGB yendo a imagen | Tipo | Color RGB. Exportar esta imagen por file | Guardar como | Tiff.
    NOTA: Para la tinción falsa de H&E, el esquema de color muestra citoplasma rosa, mientras que los núcleos son de color azul oscuro-púrpura.
  7. Descargue el script HE.m MATLAB desde el recurso de script de tinción falso de H&E en la Tabla de materiales.
  8. Ejecute el script HE.m en MATLAB. Seleccione la imagen RGB exportada del paso anterior para generar una imagen teñida artificialmente de H&E.
  9. (OPCIONAL) Normalice la intensidad de la imagen para imágenes de campo de visión grande porque la imagen aparece más oscura en la periferia que en el centro.
    1. Para realizar la normalización de campo de las imágenes, promedie tantas imágenes como sea posible. A continuación, elimine las funciones de intensidad con ImageJ (Process | Filtros | | de desenfoque gaussiano Radio=50).
    2. Mida la intensidad máxima de la imagen borrosa (Ctrl+M). Divida la imagen borrosa por la intensidad máxima (Proceso | | matemáticas Dividir). Divida la imagen SRS sin procesar por la imagen borrosa (Proceso | Imagen | Calculadora).

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Resultados

Optimización de la resolución espectral:
La dispersión a través de un material se ve afectada por el medio dispersivo (longitud y material) y la longitud de onda. Cambiar la longitud de la varilla de dispersión afecta la resolución espectral y el tamaño de la señal. Es una relación de toma y daca que se puede sopesar de manera diferente dependiendo de la aplicación. Las varillas estiran el pulso del haz de ser ancho en frecuencia y estrecho en el tiempo a ser estrecho en frecuencia y ancho en el tiemp...

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Discusión

El esquema de imágenes SRS de dos colores presentado en este protocolo depende de la implementación adecuada de imágenes SRS de un solo color. En las imágenes SRS de un solo color, los pasos críticos son la alineación espacial, la alineación temporal, la profundidad de modulación y el cambio de fase. La combinación espacial de los dos haces se logra mediante un espejo dicroico. Se utilizan varios espejos de dirección para un ajuste fino al enviar las vigas al espejo dicroico. Una vez que los haces se combinan con el espe...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por NIH R35 GM133435 a D.F.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Lente acromática de 100 mmTHORLABSAC254-100-BBanda ancha, 650 - 1.050 nm, distancia focal de la lente acromática, 100 mm
Filtro de paso de banda de 20 MHzMinicircuitsBBP-21.4 +Filtro de paso de banda LC agrupado, 19.2 - 23.6 MHz, 50 y omega;
Lente acromática de 200 mmTHORLABSAC254-200-BBanda ancha, 650 - 1.050 nm, longitud focal de la lente acromática, 200 mm
Óptica acromática de media ondade uniónWPA2210-650-1100-M25.4Placa de media onda de banda ancha
Cuarto de onda acromático Ópticade uniónWPA4210-650-1100-M25.4Muestreador de haz de placa de cuarto de onda de banda ancha
THORLABSBSN1110:90 Divisor de haz de placa
Espejo dicroicoTHORLABSDMSP1000Se pueden utilizar otros dicroicos con una longitud de onda central de alrededor de 1.000 nm.
DMSO (Dimetilsulfóxido)Sigma Aldrich472301Disolvente para la calibración del desplazamiento Raman. Se pueden utilizar otros disolventes con picos Raman conocidos.
Modulador de amplitud electroópticoTHORLABSEO-AM-NR-C1Se necesitan dos EOM para la modulación ortogonal y la obtención de imágenes de doble canal. Se recomienda la versión resonante para que se pueda utilizar un voltaje de conducción más bajo.
Falso H& E Staining ScriptMatlabhttps://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout BufferPRL-414BPulse Research Lab1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer y controlador de línea, para generar la frecuencia de conducción de EOM y la referencia al
bloqueo Fotodiodo rápidoTHORLABS Detector deDET10A2tiempo de subida de 1 ns
PRL-220ALaboratoriode investigación de pulsosDivisor de frecuencia TTL (f/2, f/4, f/8, f/16), para generar 20MHz a partir de la salida del láser.
Varillas de vidrio altamente dispersivasÓptica de uniónCYLROD01Alta dispersión H-ZF52A Lente de varilla de 120 mm, lente de varilla SF11 de 100 mm
Sistema láser Insight DS+Newportcapaz de emitir dos láseres pulsados sincronizados (un haz fijo a 1.040 nm y un haz sintonizable, que va de 680 a 1.300 nm) con una tasa de repetición de 80 MHz.
Amplificador Lock-inLiquid InstrumentsMoku LabAmplificador Lock-in para extraer la señal SRS del fotodiodo. También se puede utilizar un instrumento Zurich HF2LI o un instrumento similar.
EspejosTHORLABSBB05-E03-10Espejo dieléctrico de banda ancha, 750 - 1.100 nm. También se pueden utilizar espejos plateados.
Platina de retardo motorizadaZaberX-DMQ12P-DE52Petapa de retardo para el control fino del solapamiento temporal de la bomba y los láseres Stokes. Cualquier otra etapa motorizada debería funcionar.
Condensador de inmersión en aceiteNikon CSC10031.4 NA. Se pueden utilizar otros condensadores con NA>1.2.
OsciloscopioTektronixTDS7054Cualquier otro osciloscopio con banda de 400 MHz o superior debería funcionar.
DesfasadorSigaTekSF50A2Para cambiar la fase de la frecuencia de modulación
FotodiodoHamamatsu CorpS3994-01Diodo PIN de silicio con gran área (10 x 10 cm2). Se pueden utilizar otros diodos con gran área y baja capacitancia.
Divisor de haz polarizador UnionOpticPBS9025-620-1000Divisor de haz polarizado de banda ancha
índice reactivorefractiveindex.info
retrorreflectorEdmund Optics34-408BBAR Prisma de ángulo recto. Se pueden utilizar otros prismas o retrorreflectores.
Minicircuitosamplificador de potencia RFZHL-1-2W +bloque de ganancia, 5 - 500 MHz, 50 y omega;
Espejos de escaneoCambridge Technologies6215HUtilizamos un juego de espejos de 5 mm con recubrimiento de plata
ScanImageVidrio ScanImage BasicSoftware de control de microscopio de escaneo láser
Filtro de paso cortoTHORLABSFESH1000Filtro de paso corto premium de 25,0 mm, longitud de onda de corte: 1.000 nm. Para una supresión eficiente de los Stokes, pueden ser necesarios dos filtros.
Microscopio verticalNikonEclipse FN1Se puede utilizar cualquier otro marco de microscopio. Si se dispone de un microscopio de barrido láser, se puede utilizar directamente. De lo contrario, era necesario añadir al microscopio un escáner galvo y una lente de exploración.
Objetivo de inmersión en aguaOlympusXLPLN25XWMP2El objetivo multifotón 25X tiene un NA de 1,05. Se pueden utilizar otros objetivos similares.
Si, divisor de frecuencia de Base de datos de de

Referencias

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