La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) es una técnica de imagen potente, no destructiva y sin etiquetas. Una aplicación emergente es la histología Raman estimulada, donde las imágenes SRS de dos colores en las transiciones Raman de proteínas y lípidos se utilizan para generar imágenes de pseudo-hematoxilina y eosina. Aquí, demostramos un protocolo para imágenes SRS de dos colores en tiempo real para el diagnóstico de tejidos.
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Artículo de método
Imágenes de dispersión Raman estimuladas en dos colores en tiempo real del cerebro del ratón para el diagnóstico de tejidos
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En este artículo
Resumen
Resumen
La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) se ha convertido en una poderosa técnica de imagen óptica para el diagnóstico de tejidos. En los últimos años, se ha demostrado que el SRS de dos colores puede proporcionar imágenes equivalentes a hematoxilina y eosina (H&E) que permiten un diagnóstico rápido y confiable del cáncer cerebral. Tal capacidad ha permitido emocionantes aplicaciones de diagnóstico de cáncer intraoperatorio. Las imágenes SRS de dos colores del tejido se pueden realizar con una fuente láser de picosegundos o femtosegundos. Los láseres de femtosegundo tienen la ventaja de permitir modos de imagen flexibles, incluidas imágenes hiperespectrales rápidas e imágenes SRS de dos colores en tiempo real. Un enfoque de enfoque espectral con pulsos láser chirriados se usa típicamente con láseres de femtosegundo para lograr una alta resolución espectral.
La adquisición de SRS de dos colores se puede realizar con modulación ortogonal y detección de bloqueo. La complejidad del canto de pulso, la modulación y la caracterización es un cuello de botella para la adopción generalizada de este método. Este artículo proporciona un protocolo detallado para demostrar la implementación y optimización de SRS de enfoque espectral e imágenes en tiempo real de dos colores del tejido cerebral de ratón en el modo epi. Este protocolo se puede utilizar para una amplia gama de aplicaciones de imágenes SRS que aprovechan la alta velocidad y la capacidad de imágenes espectroscópicas de SRS.
Introducción
El diagnóstico tisular tradicional se basa en protocolos de tinción seguidos de un examen bajo un microscopio óptico. Un método de tinción común utilizado por los patólogos es la tinción H&E: la hematoxilina tiñe los núcleos celulares de un azul violáceo, y la eosina tiñe la matriz extracelular y el citoplasma de rosa. Esta simple tinción sigue siendo el estándar de oro en patología para muchas tareas de diagnóstico de tejidos, particularmente el diagnóstico de cáncer. Sin embargo, la histopatología de H&E, particularmente la técnica de seccionamiento congelado utilizada en un entorno intraoperatorio, todavía tiene limitaciones. El procedimiento de tinción es un proce....
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Protocolo
Todos los procedimientos experimentales con animales se llevaron a cabo con cerebros de ratón de 200 μm, fijos y seccionados, de acuerdo con el protocolo (# 4395-01) aprobado por el Comité del Instituto de Cuidado y Uso animal (IACUC) de la Universidad de Washington. Los ratones de tipo salvaje (cepa C57BL/6J) son sacrificados con CO2. Luego, se realiza una craneotomía para extraer sus cerebros para la fijación en paraformaldehído al 4% en solución salina tamponada con fosfato. Los cerebros están incrustados en una mezcla de agarosa al 3% y gelatina al 0,3% y se seccionan en rodajas de 200 μm de espesor mediante un vibratomo.
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Resultados
Optimización de la resolución espectral:
La dispersión a través de un material se ve afectada por el medio dispersivo (longitud y material) y la longitud de onda. Cambiar la longitud de la varilla de dispersión afecta la resolución espectral y el tamaño de la señal. Es una relación de toma y daca que se puede sopesar de manera diferente dependiendo de la aplicación. Las varillas estiran el pulso del haz de ser ancho en frecuencia y estrecho en el tiempo a ser estrecho en frecuencia y ancho en el tiemp.......
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Discusión
El esquema de imágenes SRS de dos colores presentado en este protocolo depende de la implementación adecuada de imágenes SRS de un solo color. En las imágenes SRS de un solo color, los pasos críticos son la alineación espacial, la alineación temporal, la profundidad de modulación y el cambio de fase. La combinación espacial de los dos haces se logra mediante un espejo dicroico. Se utilizan varios espejos de dirección para un ajuste fino al enviar las vigas al espejo dicroico. Una vez que los haces se combinan con el espe.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por NIH R35 GM133435 a D.F.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Lente acromática de 100 mm | THORLABS | AC254-100-B | Banda ancha, 650 - 1.050 nm, distancia focal de la lente acromática, 100 mm |
| Filtro de paso de banda de 20 MHz | Minicircuits | BBP-21.4 + | Filtro de paso de banda LC agrupado, 19.2 - 23.6 MHz, 50 y omega; |
| Lente acromática de 200 mm | THORLABS | AC254-200-B | Banda ancha, 650 - 1.050 nm, longitud focal de la lente acromática, 200 mm |
| Óptica acromática de media onda | de unión | WPA2210-650-1100-M25.4 | Placa de media onda de banda ancha |
| Cuarto de onda acromático Óptica | de unión | WPA4210-650-1100-M25.4 | Muestreador de haz de placa de cuarto de onda de banda ancha |
| THORLABS | BSN11 | 10:90 Divisor de haz de placa | |
| Espejo dicroico | THORLABS | DMSP1000 | Se pueden utilizar otros dicroicos con una longitud de onda central de alrededor de 1.000 nm. |
| DMSO (Dimetilsulfóxido) | Sigma Aldrich | 472301 | Disolvente para la calibración del desplazamiento Raman. Se pueden utilizar otros disolventes con picos Raman conocidos. |
| Modulador de amplitud electroóptico | THORLABS | EO-AM-NR-C1 | Se necesitan dos EOM para la modulación ortogonal y la obtención de imágenes de doble canal. Se recomienda la versión resonante para que se pueda utilizar un voltaje de conducción más bajo. |
| Falso H& E Staining Script | Matlab | https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining | |
| Fanout Buffer | PRL-414B | Pulse Research Lab | 1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer y controlador de línea, para generar la frecuencia de conducción de EOM y la referencia al |
| bloqueo Fotodiodo rápido | THORLABS Detector de | DET10A2 | tiempo de subida de 1 ns |
| PRL-220A | Laboratorio | de investigación de pulsosDivisor de frecuencia TTL (f/2, f/4, f/8, f/16), para generar 20MHz a partir de la salida del láser. | |
| Varillas de vidrio altamente dispersivas | Óptica de unión | CYLROD01 | Alta dispersión H-ZF52A Lente de varilla de 120 mm, lente de varilla SF11 de 100 mm |
| Sistema láser Insight DS+ | Newport | capaz de emitir dos láseres pulsados sincronizados (un haz fijo a 1.040 nm y un haz sintonizable, que va de 680 a 1.300 nm) con una tasa de repetición de 80 MHz. | |
| Amplificador Lock-in | Liquid Instruments | Moku Lab | Amplificador Lock-in para extraer la señal SRS del fotodiodo. También se puede utilizar un instrumento Zurich HF2LI o un instrumento similar. |
| Espejos | THORLABS | BB05-E03-10 | Espejo dieléctrico de banda ancha, 750 - 1.100 nm. También se pueden utilizar espejos plateados. |
| Platina de retardo motorizada | Zaber | X-DMQ12P-DE52 | Petapa de retardo para el control fino del solapamiento temporal de la bomba y los láseres Stokes. Cualquier otra etapa motorizada debería funcionar. |
| Condensador de inmersión en aceite | Nikon CSC1003 | 1.4 NA. Se pueden utilizar otros condensadores con NA>1.2. | |
| Osciloscopio | Tektronix | TDS7054 | Cualquier otro osciloscopio con banda de 400 MHz o superior debería funcionar. |
| Desfasador | SigaTek | SF50A2 | Para cambiar la fase de la frecuencia de modulación |
| Fotodiodo | Hamamatsu Corp | S3994-01 | Diodo PIN de silicio con gran área (10 x 10 cm2). Se pueden utilizar otros diodos con gran área y baja capacitancia. |
| Divisor de haz polarizador Union | Optic | PBS9025-620-1000 | Divisor de haz polarizado de banda ancha |
| índice reactivo | refractiveindex.info | ||
| retrorreflector | Edmund Optics | 34-408 | BBAR Prisma de ángulo recto. Se pueden utilizar otros prismas o retrorreflectores. |
| Minicircuitos | amplificador de potencia RF | ZHL-1-2W + | bloque de ganancia, 5 - 500 MHz, 50 y omega; |
| Espejos de escaneo | Cambridge Technologies | 6215H | Utilizamos un juego de espejos de 5 mm con recubrimiento de plata |
| ScanImage | Vidrio ScanImage Basic | Software de control de microscopio de escaneo láser | |
| Filtro de paso corto | THORLABS | FESH1000 | Filtro de paso corto premium de 25,0 mm, longitud de onda de corte: 1.000 nm. Para una supresión eficiente de los Stokes, pueden ser necesarios dos filtros. |
| Microscopio vertical | Nikon | Eclipse FN1 | Se puede utilizar cualquier otro marco de microscopio. Si se dispone de un microscopio de barrido láser, se puede utilizar directamente. De lo contrario, era necesario añadir al microscopio un escáner galvo y una lente de exploración. |
| Objetivo de inmersión en agua | Olympus | XLPLN25XWMP2 | El objetivo multifotón 25X tiene un NA de 1,05. Se pueden utilizar otros objetivos similares. |
Referencias
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Cui, M., Zhang, D. Y. Artificial intelligence and computational pathology. Laboratory Investigation. ....
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Reimpresiones y permisos
