Precipitación de proteínas a base de disolventes orgánicos para una purificación robusta del proteoma antes de la espectrometría de masas

Resumen

El presente protocolo describe la precipitación de proteínas a base de disolventes en condiciones controladas para una recuperación y purificación robustas y rápidas de muestras de proteoma antes de la espectrometría de masas.

Resumen

Si bien los múltiples avances en los instrumentos de espectrometría de masas (EM) han mejorado el análisis cualitativo y cuantitativo del proteoma, los enfoques frontales más confiables para aislar, enriquecer y procesar proteínas antes de la EM son críticos para una caracterización exitosa del proteoma. La recuperación de proteínas baja e inconsistente y las impurezas residuales como los surfactantes son perjudiciales para el análisis de la EM. La precipitación de proteínas a menudo se considera poco confiable, requiere mucho tiempo y técnicamente es difícil de realizar en comparación con otras estrategias de preparación de muestras. Estas preocupaciones se superan mediante el empleo de protocolos óptimos de precipitación de proteínas. Para la precipitación de acetona, la combinación de sales específicas, el control de la temperatura, la composición del disolvente y el tiempo de precipitación es crítica, mientras que la eficiencia de la precipitación de cloroformo / metanol / agua depende del pipeteo adecuado y la manipulación del vial. Alternativamente, estos protocolos de precipitación están optimizados y semiautomatizados dentro de un cartucho de centrifugado desechable. Los resultados esperados de la precipitación de proteínas a base de solvente en el formato convencional y el uso de un cartucho desechable de filtración y extracción de dos etapas se ilustran en este trabajo. Esto incluye la caracterización detallada de mezclas proteómicas mediante análisis LC-MS/MS de abajo hacia arriba. El rendimiento superior de los flujos de trabajo basados en SDS también se demuestra en relación con las proteínas no contaminadas.

Introducción

El análisis del proteoma por espectrometría de masas se ha vuelto cada vez más riguroso, debido a la mayor sensibilidad, resolución, velocidad de escaneo y versatilidad de los instrumentos modernos de MS. Los avances de la EM contribuyen a una mayor eficiencia de identificación de proteínas y a una cuantificación más precisa 1,2,3,4,5. Con una instrumentación mejorada de em, los investigadores exigen una estrategia de preparación de muestras front-end correspondientemente consistente capaz de recuperar cuan....

Protocolo

1. Consideraciones materiales y preparación previa de la muestra

1. Use solo solventes de alta pureza (acetona, cloroformo, metanol) (>99.5%) y productos químicos, libres de exceso de humedad.
2. Preparar soluciones de cloruro de sodio y sulfato de zinc (1 M) en agua.
   NOTA: Las soluciones salinas se pueden almacenar indefinidamente a temperatura ambiente, siempre y cuando estén libres de contaminantes o crecimiento microbiano.
3. Utilice el vial de microcentrífuga de polipropileno (PP) más pequeño suficiente para retener el volumen requerido de muestra y disolventes para inducir la precipitación.
4. Asegúrese de que la c....

Resultados

La Figura 4 resume el agotamiento esperado de SDS después de la precipitación de proteínas a base de vial o facilitada por cartucho en un cartucho de filtro desechable utilizando acetona. La incubación nocturna convencional (-20 °C) en acetona se compara con el protocolo de precipitación rápida de acetona a temperatura ambiente (paso 2), así como con la precipitación CMW (paso 4). La SDS residual se cuantificó mediante el ensayo de sustancias activas de azul de metileno (MBAS)

Discusión

La caracterización óptima de la EM se logra cuando la SDS residual se agota por debajo de 10 ppm. Mientras que los enfoques alternativos, como el FASP y la digestión en perlas, ofrecen un agotamiento cuantitativo de SDS con recuperación variable 31,32,33, el objetivo principal de la precipitación es maximizar la pureza y el rendimiento simultáneamente. Esto depende de aislar efectivamente el sobrenadante (que contiene el SDS) si.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Acetona	Fisher Scientific	AC177170010	≤ 0,002 % aldehído
Acetonitrilo	Fisher Scientific	A998-4	Grado HPLC
Bicarbonato de amonio	Millipore Sigma	A6141-1KG	sólido
Beta mercaptoetanol	Millipore Sigma	M3148-25ML	Grado en biología molecular
Azul de bromofenol	Millipore Sigma	B8026-5G	Bromofenol sal azula de sodio
Cloroformo	Fisher Scientific	C298-400	Cloroformo
Ácido fórmico	Honeywell	56302	Aditivo eluent para LC-MS
Espectrómetro de Masas Lumos de Fusión	ThermoFisher Scientific		para el análisis de mezclas estándar de proteínas
Glicerol	Millipore Sigma	356352-1L-M	En biología molecular, > 99%
Isopropanol	Fisher Scientific	A4641	Grado HPLC
Metanol	Fisher Scientific	A452SK-4	Grado HPLC
Microcentrífuga	Fisher Scientific	75-400-102	Hasta 21.000 XG
Tubo microcentrífuga (1,5 mL)	Fisher Scientific	05-408-130	Fondo cónico
Tubo de microcentrífugas y nbsp;               (2 mL)	Fisher Scientific	02-681-321	Fondo redondeado
Puntas de micropipetas                 (0.1-10 μ L)	Fisher Scientific	21-197-28	Punta universal de pipéta, no estéril
Puntas de micropipetas                 (1-200 μ L)	Fisher Scientific	07-200-302	Punta universal de pipéta, no estéril
Puntas de micropipetas               (200-1000 y mu; L)	Fisher Scientific	07-200-303	Punta universal de pipéta, no estéril
Micropipetas	Fisher Scientific	13-710-903	Pack de tríos de micropipetas
Pepsin	Millipore Sigma	P0525000	Polvo liofilizado,                     >3200 unidades/mg
ProTrap XG	Proteoform Scientific	PXG-0002	50 unidades completas por caja
Cloruro de sodio	Millipore Sigma	S9888-1KG	Reactivo ACS, >99 %
Dodecilo sulfato de sodio	ThermoFisher Scientific	28312	Sólido en polvo
Espectrómetro de Masas TimsTOF Pro	Bruker		para el análisis del extracto de proteoma hepático
Ácido trifluoroacético	ThermoFisher Scientific	L06374. AP	99%
Tris	Fisher Scientific	BP152-500	Grado en biología molecular
Tripsina	Millipore Sigma	9002-07-7	Procedente del páncreas bovino, tratado con TPCK
Urea	Bio-Rad	1610731	sólido
Agua (desionizada)	Sistema de Purificación de Agua Mini Sartorius Arium	76307-662	Ultrapura tipo 1 (18,2 MΩ cm)
Sulfato de zinc	Millipore Sigma	307491-100G	sólido