Precipitación de proteínas a base de disolventes orgánicos para una purificación robusta del proteoma antes de la espectrometría de masas

El análisis del proteoma por espectrometría de masas se ha vuelto cada vez más riguroso, debido a la mayor sensibilidad, resolución, velocidad de escaneo y versatilidad de los instrumentos modernos de MS. Los avances de la EM contribuyen a una mayor eficiencia de identificación de proteínas y a una cuantificación más precisa 1,2,3,4,5. Con una instrumentación mejorada de em, los investigadores exigen una estrategia de preparación de muestras front-end correspondientemente consistente capaz de recuperar cuantitativamente proteínas de alta pureza en un tiempo mínimo en todas las etapas del flujo de trabajo 6,7,8,9,10,11 . Para reflejar con precisión el estado del proteoma de un sistema biológico, las proteínas deben aislarse de la matriz de muestra nativa de manera eficiente e imparcial. Con este fin, la inclusión de un surfactante desnaturalizante, como el dodecil sulfato de sodio (SDS), garantiza una extracción y solubilización eficientes de proteínas¹². Sin embargo, SDS interfiere fuertemente con la ionización por electropulverización, causando una severa supresión de la señal de EM si no se elimina adecuadamente¹³.

Existen varias estrategias de agotamiento de SDS para el posterior análisis del proteoma, como la retención de proteínas por encima de un filtro de corte de peso molecular contenido en cartuchos de espín desechables 14,15,16. El método de preparación de muestras asistido por filtro (FASP) se ve favorecido ya que agota efectivamente el SDS por debajo de 10 ppm, lo que facilita una EM óptima. Sin embargo, la recuperación de proteínas con FASP es variable, lo que impulsó la exploración de otras técnicas. Los enfoques cromatográficos que capturan selectivamente proteínas (o surfactantes) han evolucionado en varios cartuchos convenientes o formatos basados en cuentas 17,18,19,20,21. Dadas estas estrategias simples y (idealmente) consistentes para la purificación de proteínas, el enfoque clásico de la precipitación de proteínas con solventes orgánicos a menudo se pasa por alto como un enfoque prometedor para el aislamiento de proteínas. Si bien se ha demostrado que la precipitación con disolvente agota la SDS por debajo de los niveles críticos con éxito, la recuperación de proteínas ha sido una preocupación de larga data de este enfoque. Múltiples grupos han observado un sesgo de recuperación de proteínas, con rendimientos de precipitación inaceptablemente bajos en función de la concentración de proteínas, el peso molecular y la hidrofobicidad^22,23. Debido a la diversidad de protocolos de precipitación reportados en la literatura, se desarrollaron condiciones de precipitación estandarizadas. En 2013, Crowell et al. informaron por primera vez la dependencia de la fuerza iónica en la eficiencia de precipitación de las proteínas en el 80% de acetona²⁴. Para todas las proteínas examinadas, se demostró que la adición de cloruro de sodio de hasta 30 mM era esencial para maximizar los rendimientos (hasta un 100% de recuperación). Más recientemente, Nickerson et al. demostraron que la combinación de una fuerza iónica aún mayor (hasta 100 mM) con una temperatura elevada (20 ° C) durante la precipitación de acetona dio una recuperación casi cuantitativa en 2-5 min²⁵. Se observó una ligera caída en la recuperación de proteínas de bajo peso molecular (LMW). Por lo tanto, un informe posterior de Baghalabadi et al. demostró la recuperación exitosa de proteínas y péptidos LMW (≤5 kDa) mediante la combinación de sales específicas, particularmente sulfato de zinc, con un mayor nivel de disolvente orgánico (97% acetona)²⁶.

Si bien refinar el protocolo de precipitación brinda una estrategia de purificación de proteínas más confiable para la proteómica basada en la EM, el éxito de la precipitación convencional depende en gran medida de la técnica del usuario. Un objetivo principal de este trabajo es presentar una estrategia de precipitación robusta que facilite el aislamiento del pellet de proteína del sobrenadante contaminante. Se desarrolló un cartucho de filtración desechable para eliminar el pipeteo aislando la proteína agregada sobre un filtro de membrana de PTFE poroso²⁷. Los componentes que interfieren con la EM en el sobrenadante se eliminan eficazmente en un paso de centrifugación corto y de baja velocidad. El cartucho de filtro desechable también ofrece un cartucho SPE intercambiable, que facilita la limpieza posterior de la muestra después de la resolubilización y la digestión opcional de proteínas, antes de la espectrometría de masas.

Aquí se presentan una serie de flujos de trabajo de precipitación de proteoma recomendados, incluidos los protocolos modificados de acetona y cloroformo / metanol / agua²⁸ , en un formato convencional (basado en viales) y semiautomatizado en un cartucho desechable de filtración y extracción de dos estados. Se destacan las recuperaciones de proteínas resultantes y las eficiencias de agotamiento de SDS, junto con la cobertura de proteoma LC-MS/MS de abajo hacia arriba, para demostrar el resultado esperado de cada protocolo. Se discuten los beneficios prácticos y los inconvenientes asociados con cada enfoque.

1. Consideraciones materiales y preparación previa de la muestra

1. Use solo solventes de alta pureza (acetona, cloroformo, metanol) (>99.5%) y productos químicos, libres de exceso de humedad.
2. Preparar soluciones de cloruro de sodio y sulfato de zinc (1 M) en agua.
   NOTA: Las soluciones salinas se pueden almacenar indefinidamente a temperatura ambiente, siempre y cuando estén libres de contaminantes o crecimiento microbiano.
3. Utilice el vial de microcentrífuga de polipropileno (PP) más pequeño suficiente para retener el volumen requerido de muestra y disolventes para inducir la precipitación.
4. Asegúrese de que la concentración de SDS en la muestra a precipitar no sea superior al 2% (p/v). Si el SDS es mayor, diluya la muestra con agua.
5. Asegurar una concentración de proteína entre 0,01 y 10 g/L para una eficiencia óptima de la precipitación.
   NOTA: La masa óptima para la precipitación oscila entre 1-100 μg de proteína.
6. Asegúrese de que todos los disolventes y soluciones estén libres de partículas antes de su uso. Realice una filtración (<0,5 μm) o una etapa de centrifugación (10.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente) para eliminar las partículas no disueltas.
7. Si se requiere la reducción y alquilación de enlaces de disulfuro, realice estos pasos antes de la precipitación de proteínas. El exceso de reactivos reductores y alquilantes se eliminará a través del proceso de precipitación.
8. Precipitar las proteínas seleccionando y realizando uno de los protocolos (pasos 2, 3, 4 o 5).

2. Precipitación rápida de proteínas (a base de viales) con acetona

1. Pipetear 90 μL de proteína (libre de partículas) o solución de proteoma en un tubo de microcentrífuga PP. Luego, agregue 10 μL de NaCl acuoso de 1 M.
   NOTA: Si la resistencia iónica del extracto de proteoma ya supera los 100 mM, no se necesita sal adicional.
2. Pipeta 400 μL de acetona en la muestra. Tapa el vial y golpea suavemente el vial para combinar los disolventes. No se requiere una mezcla vigorosa.
   NOTA: El volumen de proteína, sal y acetona se puede aumentar siempre que se mantenga la proporción relativa de cada uno.
3. Deje que el vial se incube a temperatura ambiente, sin perturbaciones, durante un mínimo de 2 minutos.
   NOTA: Las incubaciones más largas, incluidas las que se realizan a temperatura reducida (por ejemplo, la precipitación convencional de acetona emplea precipitación durante la noche en el congelador), pueden dar lugar a la formación de partículas de proteína agregadas más grandes (visibles) (Figura 1A), que generalmente no mejoran la recuperación total de proteínas.
4. Después de la incubación, coloque las muestras en una centrífuga, anotando la orientación del vial. Girar durante un mínimo de 2 min, a 10.000 x g o más a temperatura ambiente.
5. Desmonte el vial y decante suavemente el sobrenadante invirtiendo lentamente el vial a un contenedor de residuos. Toque el vial invertido en una toalla de papel para extraer el disolvente residual del vial.
   PRECAUCIÓN: Los disolventes de desecho deben conservarse y desecharse según los protocolos apropiados.
6. Para muestras que contengan SDS, dispense 400 μL de acetona fresca, teniendo cuidado de no molestar el pellet.
   NOTA: El paso 2.6 es opcional.
   1. Centrifugar inmediatamente la muestra (10.000 x g o más durante 1 min a temperatura ambiente), colocando el vial en el rotor en la misma orientación que el giro inicial. Decantar el disolvente de lavado como se describe en el paso 2.5.
7. Deje que la muestra se seque completamente con la tapa abierta (~ 1 min). Recapitule el vial y proceda con la solubilización de pellets (paso 6).

3. Precipitación de péptidos de bajo peso molecular (LMW) (ZnSO₄ + acetona)

1. Dispensar 54 μL de extracto de proteoma a un vial de PP de 2 ml y, a continuación, añadir 6 μL de 1 M de ZnSO₄.
   NOTA: La recuperación óptima de los péptidos LMW (≤5 kDa) se obtiene mediante la adición de acetona a un 97% final en volumen. Suponiendo un vial de PP de 2 ml, el volumen máximo de muestra inicial es de 54 μL.
2. Añadir 1940 μL de acetona a un 97% final en volumen. Agite suavemente para mezclar y deje reposar sin molestias en la mesa de trabajo durante un mínimo de 2 minutos.
3. Centrifugar (10.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente) y retirar el sobrenadante invirtiendo el vial, y luego tocando el vial en una toalla de papel.
4. Para muestras que contengan SDS, dispense 400 μL de acetona fresca, teniendo cuidado de no molestar el pellet.
   NOTA: El paso 3.4 es opcional.
   1. Centrifuque inmediatamente la muestra según el paso 3.3, colocando el vial en el rotor en la misma orientación que el giro inicial. Decantar el disolvente de lavado como se describe en el paso 3.3.
5. Resolubilizar el pellet seco resultante en un disolvente acuoso con un breve vórtice o sonicación (~5 min).

4. Precipitación de proteínas por cloroformo/metanol/agua (CMW)

1. Dispensar 100 μL de la proteína o solución de proteoma en un vial de PP. Añadir 400 μL de metanol, seguido de 100 μL de cloroformo. Tapa el vial y el vórtice brevemente para mezclar.
   NOTA: Para la precipitación de CMW, se prefieren viales de 1,5 ml con fondos estrechos (Figura 2A).
   PRECAUCIÓN: El disolvente de cloroformo debe manipularse en una campana de ventilación adecuada. Todos los disolventes que entran en contacto con el cloroformo deben tratarse como residuos halogenados cuando se eliminan.
2. Dispense rápidamente 300 μL de agua directamente en el centro del vial. Tapa el vial. Deje que la muestra se asiente en la mesa de trabajo sin ser molestada durante 1 minuto.
   NOTA: La solución aparecerá inmediatamente de color blanco turbio. Evite mezclar el vial después de la adición de agua.
3. Coloque el vial de PP en una centrífuga y gire durante un mínimo de 5 minutos (10.000 x g o más a temperatura ambiente).
   NOTA: Una vez centrifugado, se formarán dos capas de disolvente visibles (capa superior = metanol/agua; inferior = cloroformo). Se forma un pellet de proteína sólida en la interfaz del disolvente (Figura 2A).
4. Usando una punta de micropipeta grande (1 ml) y manteniendo el vial a ~ 45 °, retire ~ 700 μL del solvente de la capa superior a una velocidad uniforme.
5. Use una punta de micropipeta más pequeña (200 μL) para continuar retirando la capa superior de disolvente del vial inclinado de ~45°. Pipetear en un movimiento continuo hasta que la capa superior de disolvente forme una perla en el vial.
6. Añadir 400 μL de metanol fresco al vial de muestra, sin perturbar el pellet, dispensando el disolvente por el lateral del vial.
7. Tapa el vial. Combine las capas de disolvente balanceando suavemente el vial para hacer girar los disolventes juntos.
   NOTA: Es esencial evitar la interrupción del pellet. No vórtice el vial.
8. Teniendo en cuenta la orientación del vial en el rotor, centrífuga durante un mínimo de 10 min (10.000 x g a temperatura ambiente). El pellet de proteína se adhiere a la parte inferior del vial (Figura 2B).
9. Incline el vial a 45°, con el pellet hacia abajo. Coloque la punta de la pipeta a lo largo del borde superior del vial y retire el sobrenadante con una punta de micropipeta de 1 ml a una velocidad lenta pero continua. Retener ~20 μL de disolvente en el vial.
10. Lave el pellet de proteína para muestras que contengan SDS dispensando lentamente 400 μL de metanol fresco. No vórtice el vial.
    1. Proceda directamente con la centrifugación (10.000 x g durante 2 min a temperatura), colocando el vial en el rotor con la misma orientación que el giro inicial.
11. Retire el disolvente, según el paso 4.9. Deje que la muestra se seque al aire en un vapor hasta que el disolvente residual se evapore.
12. Consulte los procedimientos de resolubilización recomendados en el paso 6.

5. Precipitación de proteínas con un cartucho de filtración desechable

NOTA: Cada protocolo de precipitación a base de disolvente descrito en los pasos 2-5 se puede realizar en un cartucho de filtración y extracción de dos etapas (consulte la Tabla de materiales).

1. Con el tapón conectado al cartucho de filtración superior (Figura 3A), dispense el volumen deseado del proteoma, la sal y el disolvente extraídos como se describe en una de las tres opciones a continuación.
   1. (Opción 1) Para la precipitación de proteínas con acetona, combine 90 μL de proteína o solución de proteoma, 10 μL de NaCl acuoso de 1 M y 400 μL de acetona. Incubar durante un mínimo de 2 min en la mesa de trabajo.
      NOTA: Se desarrollará un precipitado visible para muestras de proteínas concentradas (1 g/L) (Figura 3B).
   2. (Opción 2) Para la precipitación peptídica LMW, combine 15 μL de la muestra, 1,5 μL de 1 M ZnSO₄ y 485 μL de acetona. Incubar durante un mínimo de 2 min en la mesa de trabajo.
      NOTA: Una concentración de sal de 90 mM en la muestra acuosa no afectará la recuperación en relación con los 100 mM recomendados en el paso 3.
   3. (Opción 3) Para la precipitación de CMW, agregue 50 μL de extracto de proteoma, 200 μL de metanol y 50 μL de cloroformo. Tapa el vial y brevemente el vórtice para combinar.
      1. Dispense rápidamente 150 μL de agua directamente en el centro del vial. Incubar durante 1 min en la mesa de trabajo.
2. Centrífuga durante 2 min a 2.500 x g a temperatura ambiente con el tapón aún conectado al cartucho de filtración.
3. Invierta el cartucho y, a continuación, desenrosque y retire el enchufe de la base del cartucho.
4. Coloque el cartucho de filtración en un vial limpio y vuelva a la centrífuga. Girar durante 3 min a 500 x g a temperatura ambiente. Deseche el disolvente de flujo continuo del vial inferior.
   NOTA: Si queda algún disolvente en el cartucho de filtración superior, vuelva a la centrífuga y realice un giro adicional.
5. Lave el pellet de proteína agregando 400 μL de acetona al cartucho de filtración (para la precipitación de CMW, paso 5.1.3, agregue 400 μL de metanol).
6. Centrifugar durante 3 min a 500 x g a temperatura ambiente o hasta que no quede disolvente en el cartucho superior.
7. Re-solubilizar el pellet de precipitación como se describe en el paso 6.

6. Resolubilización del pellet de proteína

1. Humedezca la membrana en la base del cartucho de filtración dispensando 2-5 μL de isopropanol directamente a la membrana inmediatamente antes de los protocolos de resolubilización que se describen a continuación.
2. Siga uno de los siguientes métodos de resolubilización.
   1. (Opción 1) Añadir un mínimo de 20 μL de tampón acuoso que contenga ≥2% SDS al cartucho de filtración. Tapa y vórtice vigorosamente (~1 min). Alternativamente, sonicate (>10 min) para dispersar el pellet de proteína.
      1. Calentar la muestra a 95 °C durante 5 min). Repita el paso de mezcla después del calentamiento.
         NOTA: El tampón de carga de gel Laemmli puede re-solubilizar el pellet de proteína. Sin embargo, las muestras que contienen SDS son incompatibles con la digestión de tripsina y la LC y LA EM de fase inversa.
   2. (Opción 2) Prepare una solución de ácido fórmico al 80% (v /v) en agua. Precargar la solución ácida (-20 °C), así como el cartucho de filtración que contiene proteína precipitada.
      1. Dispensar 50 μL de ácido fórmico frío en el cartucho; gorra y vórtice durante 30 s. Volver al congelador (-20 °C) durante 10 min.
      2. Vuelva a vórtice el cartucho durante 30 s. Luego, repita el ciclo de enfriamiento y mezcla una vez más (10 min, -20 °C, vórtice de 30 s).
      3. Agregue agua a un final de 500 μL, diluyendo el ácido fórmico al 8%.
         NOTA: El protocolo de ácido fórmico frío es incompatible con la digestión posterior de tripsina, pero es compatible con LC-MS.
   3. (Opción 3) Añadir 50 μL de urea 8 M recién preparadas en agua al cartucho de filtración. Sonicar durante 30 min.
      1. Deje que el cartucho se incube en la mesa de trabajo durante 1 h (hasta durante la noche).
      2. Diluya los 8 M de urea un mínimo de 5 veces con agua o tampón apropiado.
         NOTA: Una vez diluido, el protocolo de solubilización de urea es compatible con la digestión posterior de tripsina, así como con LC-MS.

7. Digestión de proteínas

1. Para el análisis de EM de abajo hacia arriba, someta las proteínas resolubilizadas a digestión enzimática utilizando uno de los dos métodos mencionados a continuación.
   1. (Opción 1) Para la resolubilización del ácido fórmico, reduzca el volumen inicial del 80% de ácido fórmico en el paso 6.2.2.1 a 25 μL. En el paso 6.2.2.3, use 375 μL de agua para diluir el ácido fórmico al 5% (v/v).
   2. Dispense pepsina en el cartucho en una proporción aproximada de proteína a enzima de 50:1. Con un tapón conectado al cartucho de filtración, incube la muestra durante la noche a temperatura ambiente.
2. (Opción 2) Para la resolubilización en urea, asegurar un pH entre 8 y 8.3 con la inclusión de 100 mM de Tris o bicarbonato de amonio en el paso 6.2.3.2.
   1. Agregue tripsina a una relación aproximada de proteína a masa enzimática de 50: 1. Con un tapón conectado al cartucho, incube la muestra durante la noche en un baño de agua tibia a 37 °C.
   2. Terminar la digestión acidificando la solución con 10% de TFA a un 1% final.
3. Recupere la proteína digerida por pepsina o tripsina retirando el tapón de la base del filtro y centrifugando el cartucho contenido en un vial limpio (2 min, 5000 x g, temperatura ambiente).

8. Limpieza de SPE

NOTA: Para la desalinización adicional de la muestra después de la digestión o el intercambio de disolventes, la muestra puede estar sujeta a una limpieza de fase inversa como se describe.

1. Cebar un cartucho SPE (ver Tabla de Materiales) pasando 300 μL de metanol (2 min, 400 x g) seguido de 300 μL de 5% de acetonitrilo/0,1% de TFA (2 min, 400 x g).
2. Conecte el cartucho SPE cebado a la base del cartucho de filtración que contiene proteína resolubilizada o digerida.
3. Haga girar la proteína a través del cartucho SPE (5 min, 800 x g a temperatura ambiente). Si el disolvente permanece en el cartucho superior, devuelva el cartucho a la centrífuga y repita el giro.
   NOTA: Pasar la muestra a través del cartucho SPE por segunda vez puede mejorar la recuperación.
4. Añadir al cartucho 300 μL de acetonitrilo al 5%/0,1% de AGT en agua. Para lavar, fluya a través del cartucho SPE (2 min, 2000 x g). Descarta el flujo.
5. Para proteínas LMW o péptidos digeridos, eluya la muestra fluyendo 300 μL de acetonitrilo al 50%/0,1% TFA (5 min, 2500 x g).
6. Para las proteínas intactas, siga el paso 8.5 con un paso de elución adicional utilizando 300 μL de 75% de acetonitrilo/0.1% de TFA. Combine los dos extractos resultantes.
   NOTA: El paso 8.6 es opcional.

La Figura 4 resume el agotamiento esperado de SDS después de la precipitación de proteínas a base de vial o facilitada por cartucho en un cartucho de filtro desechable utilizando acetona. La incubación nocturna convencional (-20 °C) en acetona se compara con el protocolo de precipitación rápida de acetona a temperatura ambiente (paso 2), así como con la precipitación CMW (paso 4). La SDS residual se cuantificó mediante el ensayo de sustancias activas de azul de metileno (MBAS)29. Brevemente, la muestra de 100 μL se combinó con 100 μL de reactivo MBAS (250 mg de azul de metileno, 50 g de sulfato de sodio, 10 ml de ácido sulfúrico, diluido en agua a 1,0 L), seguido de la adición de 400 μL de cloroformo y la medición de absorbancia de la capa orgánica a 651 nm en un espectrofotómetro UV / Vis. Todos los enfoques reducen la SDS para permitir un análisis óptimo de la EM.

La recuperación cuantitativa y reproducible de proteínas se logra después de una rápida precipitación de acetona y precipitación de CMW, como se ve en la Figura 5 a través del análisis SDS PAGE de un lisado celular total de levadura procesada. La precipitación en un cartucho de filtración desechable elimina la necesidad de pipetear cuidadosamente el sobrenadante que contiene SDS mientras retiene las proteínas agregadas por encima de un filtro de membrana. Se obtiene una recuperación consistente con todos los protocolos de precipitación, sin que se detecten bandas visibles en las fracciones sobrenadantes a través de tres réplicas independientes.

La Figura 6 cuantifica los rendimientos esperados, incluida la resolubilización de gránulos de proteína precipitados utilizando ácido fórmico frío (paso 6). La precipitación CMW permite la recuperación cuantitativa al preservar cuidadosamente el pellet en un enfoque basado en viales (paso 5), que es igual al obtenido con el cartucho (100 ± 4% frente a 101 ± 3%, respectivamente). La recuperación de pellets de proteína precipitada por acetona se beneficia de un cartucho de filtración, con una mejora del 15-20 % en el rendimiento observado. En viales, el aislamiento del sobrenadante de acetona de la proteína agregada se basa esencialmente en la adherencia del pellet a la superficie del tubo de PP; el cartucho de filtración elimina esta preocupación, ya que el filtro garantiza una alta recuperación de la proteína precipitada sin pipeteo.

Para recuperar eficientemente las proteínas y péptidos LMW, se modifica el protocolo de precipitación de acetona sustituyendo NaCl por ZnSO4 y elevando el porcentaje de disolvente al 97%. La combinación de esta sal específica y niveles más altos de disolvente orgánico son necesarios para la alta recuperación de proteínas y péptidos LMW26. Como se ve en la Figura 7, la precipitación de proteínas basada en cartuchos demuestra una recuperación superior de una muestra de plasma bovino digerida con pepsina en relación con la precipitación basada en viales. El cartucho de espín desechable puede recuperar más del 90% de los péptidos LMW. Se observan diferencias más significativas en el rendimiento en el cartucho cuando se emplea NaCl, lo que confirma la importancia del tipo de sal para maximizar el rendimiento. La inclusión de ZnSO4 en lugar de NaCl da como resultado un pellet de proteína agregado que es atrapado más fácilmente por el filtro del cartucho de espín.

Para evaluar la eficacia de las proteínas precipitantes en un amplio rango dinámico, se procesó una mezcla de tres proteínas estándar: β-galactosidasa (β-gal) de E. coli, citocromo c (Cyt c) de bovino y enolasa (Eno) de S. cerevisiae. La relación de masa de β-gal:Cyt c:Eno fue de 10.000:10:1. Las muestras inicialmente contenían un 2% de SDS antes de la precipitación basada en cartuchos (paso 5) y se resolubilizaron y digirieron con tripsina (pasos 6 y 7). Las muestras preparadas en viales actuaron como control, sin SDS y omitiendo la precipitación. Todas las muestras fueron sometidas a una limpieza SPE equivalente (paso 8). Se realizó EM de abajo hacia arriba, con espectros de EM / EM buscados en una base de datos combinada que contenía todas las proteínas de las tres especies involucradas (ver Tabla de Materiales para plataformas de instrumentos y software). Se empleó una tasa de descubrimiento falso de péptidos del 1%. Las tres proteínas fueron identificadas por MS, con 666, 28 y 35 péptidos únicos para β-gal, Cyt c y Eno, respectivamente. La Figura 8 cuantifica la relación relativa (intensidad máxima del péptido) de cada muestra, con una relación superior a 1 que refleja una mayor abundancia de péptidos para las muestras procesadas en los cartuchos de filtro desechables. Los resultados demuestran los beneficios de incorporar SDS en un flujo de trabajo de proteómica, minimizar la pérdida de proteínas (por ejemplo, de la posible adsorción al vial de muestra) y maximizar los rendimientos de péptidos.

El hígado bovino fue adquirido en una tienda de comestibles local. Las proteínas se aislaron extrayendo el tejido con una solución de SDS al 1%. Posteriormente, el proteoma recuperado fue precipitado, re-solubilizado (urea) y digerido con tripsina, todo dentro de un cartucho desechable. Se realizó LC-MS/MS de abajo hacia arriba, lo que resultó en la identificación de un promedio de ~ 8,000 proteínas (~ 30,000 péptidos). Se emplearon tasas de descubrimiento falso de 0.5% y 1.0% para espectros de péptidos y grupos de proteínas, buscando en la base de datos bovina. La reproducibilidad técnica de este flujo de trabajo basado en cartuchos se evalúa a través de identificaciones de proteínas superpuestas. Las inyecciones replicadas de EM de una muestra digerida común logran en promedio 78 ± 0.5% de superposición con las proteínas identificadas. En comparación, las muestras preparadas de forma independiente en cartuchos discretos lograron una superposición del 76 ± del 0,5%. Estos datos sugieren que la contribución de la preparación de la muestra hacia la variabilidad total del análisis es menor, en relación con la ya aportada por el enfoque instrumental LC-MS. Las proteínas bovinas identificadas a partir de tres réplicas técnicas (procesadas independientemente en tres cartuchos desechables) se caracterizaron aún más en cuanto a su peso molecular, hidrofobicidad y punto isoeléctrico, que se muestran en la Figura 9. Un ANOVA bidireccional no pudo determinar las diferencias estadísticas en los proteomas identificados entre las réplicas técnicas. Finalmente, la Figura 10 compara el número de péptidos identificados por proteína en las tres preparaciones de muestras replicadas. Los coeficientes de correlación en estos gráficos (0.94-0.95) demuestran la alta consistencia del enfoque de preparación de muestras para el análisis de EM de abajo hacia arriba.

Figura 1: Proteínas precipitadas por acetona. Muestras que contienen 100 y 1.000 μg de proteína combinada con 100 mM de NaCl y precipitadas con 80% de acetona (A) después de 5 min de tiempo de precipitación y (B) después de la precipitación y posterior centrifugación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Precipitación de proteínas por cloroformo/metanol/agua. Una muestra que contiene 50 μg de proteína precipitada según el paso 4. (A) Inmediatamente después del paso 4.4. (B) Inmediatamente después del paso 4.8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Fotos de un cartucho desechable de filtración y extracción de dos etapas para la precipitación de proteínas. Se combinó una muestra que contenía 100 μg de proteína con 100 mM de NaCl y 80% de acetona en (A) la filtración ensamblada y el cartucho SPE y (B) se precipitó durante 5 minutos hasta que los agregados de proteínas se hicieron visibles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Eficiencia de agotamiento de SDS después de la precipitación de proteínas. El porcentaje de SDS eliminado se muestra a partir de la precipitación de acetona con el protocolo convencional (durante la noche a -20 °C), el protocolo rápido (incubación de 2 min a temperatura ambiente), o por la precipitación de cloroformo/metanol/agua (CMW) de un lisado de S. cerevisiae , tanto en formato convencional (vial) como de cartucho. Estas muestras inicialmente contenían 0.5% SDS (5,000 ppm), infiriendo >99.8% se requiere la eliminación de SDS para un análisis óptimo de MS. La SDS residual se cuantifica mediante el ensayo de sustancias activas de azul de metileno (MBAS). Las barras de error representan la desviación estándar de las réplicas técnicas (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Recuperación total del proteoma a través de la precipitación. SDS PAGE muestra la recuperación del lisado total de proteínaS de S. cerevisiae , precipitado por (A) precipitación convencional de acetona, (B) precipitación de cloroformo/metanol/agua y (C) precipitación rápida de acetona. Las bandas proteicas se observan exclusivamente en la fracción de pellets, sin bandas visibles en el sobrenadante (Super.). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Recuperación superior de proteínas dentro de un cartucho de filtración. Para la precipitación del lisado total de proteínaS de S. cerevisiae , el cartucho de espín desechable facilita la recuperación cuantitativa con precipitación de acetona y CMW. La alta recuperación también es posible con la precipitación a base de viales, aunque se requiere una cuidadosa manipulación de la muestra y pipeteo. LC-UV evaluó la recuperación de proteínas después de la resolubilización del pellet con ácido fórmico frío se muestran aquí. Las barras de error representan la desviación estándar de las réplicas técnicas (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Altos rendimientos de precipitación para péptidos de bajo peso molecular. Un protocolo de precipitación de acetona modificado para péptidos y proteínas ≤5 kDa implica el acoplamiento de 100 mM de ZnSO4 con 97% de acetona para lograr los mayores rendimientos. La precipitación facilitada por un cartucho de filtración desechable demuestra una mejor recuperación en comparación con la precipitación convencional basada en viales en las tres condiciones de precipitación. Las barras de error representan la desviación estándar de las réplicas técnicas (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Mayor recuperación de proteínas estándar en el flujo de trabajo basado en SDS. Tukey Box-and-Whisker traza30 de la intensidad relativa de la señal MS para péptidos recuperados de proteínas que contienen SDS procesadas en un cartucho de filtración desechable en relación con una muestra de control (sin SDS, sin precipitación). Las proteínas empleadas abarcan un amplio rango dinámico de concentración: β-galactosidasa: citocromo c: enolasa = 10,000: 10: 1. Cada cuartil dentro de las cajas contiene el 25% de la distribución, mientras que las barras de error abarcan el 95% de la distribución. La media se indica por "+" y la mediana por una línea horizontal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Distribuciones de proteínas identificadas a partir de réplicas técnicas. Los gráficos de Tukey Box-and-Whisker caracterizan (A) el peso molecular, (B) la hidrofobicidad y (C) el punto isoeléctrico de las proteínas identificadas por LC-MS/MS de abajo hacia arriba después de las preparaciones triplicadas de un lisado hepático bovino en un cartucho de filtración y extracción de dos etapas. No hubo diferencias estadísticas en estas características por ANOVA bidireccional (p < 0,05). Cada cuartil dentro de las cajas contiene el 25% de la distribución, mientras que las barras de error abarcan el 95% de la distribución. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: Correlación de identificaciones peptídicas por proteína a través del flujo de trabajo de preparación basado en SDS a través de réplicas preparativas. Análisis de la reproducibilidad del proteoma de abajo hacia arriba en (A) muestras 1 y 2, (B) muestras 2 y 3, y (C) muestras 1 y 3 basadas en el número de identificaciones peptídicas de EM por proteína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El laboratorio Doucette concibió y patentó el ProTrap XG empleado en este estudio. AAD también es socio fundador de Proteoform Scientific, que comercializó el cartucho de preparación de muestras.